Neuronas sensoriales musculares están implicadas en la señalización propioceptor y también informan sobre los eventos estatales y lesiones relacionados con el metabolismo. Describimos un ratón adulto en preparación muscular del nervio vitro para estudios sobre los aferentes musculares activados por estiramiento.
Neuronas sensoriales musculares que inervan los husos musculares y los órganos tendinosos de Golgi codifican cambios esenciales a la propiocepción de longitud y fuerza. Fibras aferentes adicionales supervisan otras características del medio ambiente muscular, incluyendo la acumulación de metabolito, la temperatura y los estímulos nociceptivos. En general, la activación anormal de las neuronas sensoriales puede conducir a trastornos del movimiento o síndromes de dolor crónico. Se describe el aislamiento del extensor digitorum longus (EDL) del músculo y el nervio para el estudio in vitro de las respuestas de aferentes de estiramiento-evocado en el ratón adulto. Actividad sensorial se graba desde el nervio con un electrodo de succión y aferentes individuales se pueden analizar usando software de pico de clasificación. Preparaciones in vitro permiten estudios bien controlados sobre los aferentes sensoriales sin los factores de confusión potenciales de la anestesia o la perfusión del músculo alterado. Aquí se describe un protocolo para identificar y probar la respuesta de los aferentes del huso muscular a estirar. Es importante destacar que,esta preparación también apoya el estudio de otros subtipos de aferentes musculares, propiedades de respuesta después de la aplicación de drogas y la incorporación de enfoques genéticos de gran alcance y modelos de enfermedad en ratones.
Los músculos esqueléticos están inervados por neuronas sensoriales que proporcionan el sistema nervioso central con información importante sobre el medio ambiente muscular. Los husos musculares son altamente especializados estructuras encapsuladas compuestos de fibras musculares intrafusal que se encuentran en paralelo con las fibras musculares extrafusales. Husillos están inervados por Grupo Ia y II aferentes que codifican los cambios en la longitud del músculo y el tono de fibra intrafusal está regulado dinámicamente por neuronas motoras gamma inervan 1. Grupo Ib aferentes están posicionados entre las fibras musculares y sus inserciones del tendón y son sensibles a cambios en la fuerza muscular, por ejemplo durante la contracción muscular 2. El Grupo Ia, Ib y II aferentes proporcionan retroalimentación propioceptiva que ayuda en el control motor apropiado. Poblaciones adicionales de los aferentes musculares ubicadas en todo el músculo (Grupo III y IV) sirven para indicar la acumulación de metabolito, la presencia de los estímulos nociceptivos, y la temperatura del músculo <sup> 3. Esta información sensorial muscular es esencial para mantener la homeostasis, la prevención del daño muscular y la modulación de movimiento. Aferentes musculares pueden alterar sus patrones de disparo basado en la experiencia previa 4. La activación de los nociceptores puede conducir a la inducción de estados de dolor crónico y 5 de señalización aberrante de los propioceptores musculares puede conducir a problemas con el equilibrio o el movimiento 6. Utilizamos un músculo aislado del nervio en la preparación in vitro para estudiar la respuesta de los receptores musculares terminaciones de neuronas sensoriales de los ratones adultos de ambos sexos (mostrados son las respuestas de 2-4 meses de edad C57BL / 6 ratones). El ratón es la especie genética modelo para estudios en mamíferos. Esta preparación requiere el aislamiento de la rama profunda peroneo del nervio ciático y el músculo extensor digitorum longus (EDL), un músculo de contracción rápida del grupo peroneo se encuentra en la parte lateral de la pierna inferior. La EDL se utiliza a menudo para estudiar las propiedades contráctiles del músculo 7-9, tiene tendons que son fáciles de aislar y es lo suficientemente pequeño como para permitir el suministro de oxígeno por difusión adecuada en reposo y con ciclos de trabajo contracción razonables 10. Otros músculos en esta área (por ejemplo sóleo y tibial anterior) son de tamaño similar y esta preparación podrían ser fácilmente modificados para grabar desde los aferentes de estos músculos. Un electrodo de succión se coloca sobre el extremo cortado del nervio para grabar muscular sensorial aferente de disparo. Las neuronas individuales pueden ser identificados y analizados en función de su forma pico usando pico software de clasificación. Electrodos de estimulación en el baño o en el nervio puede ser utilizado para evocar la contracción muscular. La longitud del músculo y la fuerza pueden ser controlados y medidos usando sistemas disponibles comercialmente. Similar en preparaciones in vitro se han utilizado en roedores para estudiar los aferentes musculares Grupo III y IV en la rata EDL 11, Grupo Ia y II aferentes del huso en la rata cuarto dedo del pie muscular lumbrical 12 y musculares Grupo III y IV aferentes en tque el músculo plantar del ratón 13.
Un sistema in vitro tiene las ventajas de la accesibilidad farmacológica y el control directo de las variables perfundido y fisicoquímicas como la temperatura y el pH. Un enfoque in vitro elimina el potencial in vivo confunde de la anestesia y el músculo estado de la perfusión. Si bien la preparación de músculo-nervio permite el estudio de la respuesta directa de una perturbación en los aferentes, la capacidad de estudiar gamma eferente de modulación de la sensibilidad del husillo y otras respuestas integradas que es posible con 14 in vivo o ex vivo 3 preparados como se sacrifica no hay cuerpos de las células neuronales en esta preparación.
Esta preparación se utilizó previamente para caracterizar la respuesta de los aferentes del huso muscular de ratón a una batería de la rampa y mantenga estiramientos y vibraciones y se determinó que respons aferentes del huso ratónes fueron similares a los reportados en otras especies como ratas, gatos y seres humanos. Se encontraron respuestas de ratón aferentes del huso a ser similar en ambos de 24 ° C y 34 ° C la temperatura del baño, aunque a 34 ° C las tasas de disparo absoluta eran más rápidos y los aferentes eran más capaces de responder a la longitud más rápido cambia 15. Se describe a continuación cómo esta preparación se puede utilizar para identificar y estudiar los aferentes del huso muscular. Además, esta preparación puede ser fácilmente modificado para estudiar la respuesta de otros subtipos de aferentes muscular 13, para comparar las propiedades de los aferentes sensoriales en respuesta a un estado de drogas o enfermedad o una variedad de otras variables (por ejemplo, edad, sexo, knockout de genes).
El objetivo de este artículo es describir un método para la grabación desde los aferentes del huso muscular en una preparación del ratón músculo-nervio en forma aislada. Hemos encontrado que aferentes del huso ratón responden de manera similar para estirar como los de ratas, gatos y seres humanos 15, y otros laboratorios han utilizado ratones como organismos modelo para estudiar las neuronas sensoriales tanto en el músculo y la piel in vitro (por ejemplo 3,13) .
Aferentes sensoriales musculares pueden ser grabados durante al menos 6-8 horas a ambos de 24 ° C y 34 ° C. Para reducir al mínimo el manejo de la EDL y el nervio, utilizar la parte restante de la FHL para manejar el tejido siempre que sea posible. Después de la disección, espere por lo menos 1 hora para iniciar la recopilación de datos para permitir que el tejido se equilibre a la temperatura del baño y para la transmisión sináptica normal para recuperarse. Anteriormente, la salud muscular se verificó en un subconjunto de los músculos usados en esta preparación mediante la determinación de que la máxima tetánica contractile fuerza generada por los músculos es similar a la reportada por otros al principio y al final del experimento 15.
Aferentes del huso muscular funcionalmente se identificaron en esta preparación mediante la búsqueda de una pausa en la característica de disparo en respuesta a la contracción de contracción (Figura 2), así como los aumentos instantáneos de frecuencia esperados en respuesta a cambios de longitud (Figura 3). En nuestra experiencia, la mayoría de los aferentes que disparan en condiciones de control son aferentes del huso muscular. La longitud del nervio retenido en esta preparación (~ 7 mm máximo) no es lo suficientemente largo para utilizar aferentes diferencias de velocidad de conducción para identificar subtipos de aferentes del músculo 13. Además, a diferencia de en los gatos y seres humanos, las medidas de sensibilidad dinámica no fueron capaces de diferenciar claramente Grupo Ia y II aferentes en ratones (para mayor discusión ver Wilkinson et al. 15). Otros subtipos de aferentes (es decir., Grupo III y IV) se pueden identificar mediante pruebas funcionales adicionales en esta preparación, por ejemplo mediante la adición de sustancias como la capsaicina, ATP, o la bradiquinina, la disminución del pH del baño, exponiendo el músculo a la isquemia, etc 3,13,21-23 El uso de electrodos de succión permite la actividad de múltiples neuronas sensoriales a grabar a la vez, lo que aumenta la cantidad de datos que pueden ser recogidos a partir de un solo músculo. Esta preparación se puede utilizar para medir el efecto global de una perturbación en las respuestas de población de las neuronas sensoriales o de las respuestas de los aferentes identificados. Si las formas de pico son lo suficientemente único, hasta 4 neuronas sensoriales pueden ser discriminados por software (tanto Spike2 (Cambridge Electronic Design) y LabChart Pro (AD Instruments) han realizado de manera similar). En los casos en que las neuronas no pueden ser discriminados, los cambios en la colocación de los electrodos o diámetro de la punta fácilmente se pueden implementar.
En resumen, el ratón músculo-nervio en prepar vitroación es un enfoque experimental sencillo que se puede utilizar para investigar las propiedades de respuesta de los aferentes sensoriales musculares a varios modelos de perturbaciones, lesiones y enfermedades fisicoquímicas. Además, esta preparación es ideal para tomar ventaja de las poderosas herramientas genéticas disponibles en ratones, incluso los animales transgénicos y herramientas optogenética.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by a California State University Program for Education and Research in Biotechnology (CSUPERB) New Investigator Grant (KAW), a grant from Pfizer (WS753098, SH), and an NIH MARC fellowship (#2T34GM008253-21, JAF). The authors would like to thank Michael Sawchuk, Anusha Allawala, Nina Bubalo, Remie Mandawe and Peter Nguyen for their technical support.
Force and Length Controller & Tissue Bath | Aurora Scientific, Inc. | 300C-LR & 809B-IV | |
Masterflex L/S Digital Drive Perfusion Pump & Easy Load II Pump Head | Cole Parmer | EW-07523-80 & EW-77200-60 | |
2 Channel Microelectrode AC Differential Amplifier & Headstage Amplifier | A-M Systems | Model 1800; 700000 & 700500 | |
Simulator | Grass OR Aurora Scientific, Inc. |
S88 OR 701 C |
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Dissecting Microscope | Swift | 892070 | |
Fiber Optic Light Source | Fiberlite | Model 190 | |
Analog to Digital Board | AD Instruments | PL3508/P (PowerLab 8/35) | |
Data Acquisition & Analysis Software | AD Instruments | LabChart Pro 7 | |
Electrode Holder | A-M Systems | 672445 | |
Electrode Glass | Dagan | SA16 | |
Electrode Puller | Sutter Instrument Co. | P-80/PC | |
Microforge | Narishige | MF-9 | |
Isoflourane | MWI Veterinary Supply | 18627 | |
Surgical Tools | |||
Large Dissecting Scissors | Fine Science Tools | 14014-17 | |
Large Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
Large Spring Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
#5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
#55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
Sharp Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | |
6-0 Silk Suture | Fine Science Tools | 18020-50 | |
Chemicals for Low Calcium- High Magnesium aCSF and SIF (Low Calcium solution is equilibriated with 95% 02/5% C02 gas and pH of 7.4 ± 0.05; SIF is equilibriated with 100% 02 gas and pH of 7.4 ± 0.05) |
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Sodium Chloride | Sigma | S9888-1KG | |
Magnesium Sulfate Heptahydrate | Sigma | 230391-500G | |
Calcium Chloride Dihydrate | Sigma | 223506-500G | |
Sodium Gluconate | Sigma | S2054-500G | |
Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S8282-500G | |
Glucose | Sigma | G5767-500G | |
Sucrose | Sigma | S5016-500G | |
HEPES | Sigma | H3375-250G | |
Potassium Phosphate Monobasic | Sigma | P0662-500G | |
Potassium Chloride | Sigma | P3911-500G | |
Sodium Bicarbonate | Sigma | S6014-500G |