Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

التصوير متحد البؤر الفاصل الزمني كما وسيلة فعالة لتقييم Cytocompatibility من المركبات الأسنان

Published: November 9, 2014 doi: 10.3791/51949
Automatic Translation
1, 1,2, 1,3, 1,2
1Laboratoire des Multimatériaux et Interfaces, UMR CNRS 5615, Université Lyon1, 2UFR d'Odontologie, Université Lyon1; Service de Consultations et de Traitements Dentaires, Hospices Civils de Lyon, 3UFR d'Odontologie, Université Paris Diderot; Service d'Odontologie, APHP, Hôpital Rothschild

Summary

الجانب الأكثر درس من توافق مع الحياة من المواد المركبة الأسنان هو السمسة 3D CLSM الوقت الفاصل بين التصوير الخاصة بهم جنبا إلى جنب مع فلوري الكمي إشارة يسمح تقييم حساسية في مصير الخلايا مع مرور الوقت. يمكن استخدام هذه الطريقة تكون أداة فعالة لتقييم cytocompatibility من المواد المركبة الأسنان.

Abstract

ومن المسلم به عموما أن التفاعل في المختبر مادة الخلية هو المعيار مفيدا في تقييم الأسنان توافق مع الحياة المادية. كان الهدف من هذه الدراسة هو استخدام 3D CLSM وقت التصوير مرور متحد البؤر لتقييم توافق مع الحياة في المختبر من مركبات الأسنان. وهذه الطريقة توفر مؤشرا دقيقا وحساسا من معدل خلية قابلة للحياة في اتصال مع مقتطفات مركب الأسنان. وELS انكماش منخفضة خارج، وهو مركب يستخدم لترميم الأسنان مباشرة، اتخذت كمثال. تم إجراء التقييم في المختبر على خلايا الليفية مثقف الأولية الإنسان اللثة باستخدام ايف / تلطيخ الميت. تم الحصول على الصور مع النظام البيولوجي متحد البؤر FV10i مقلوب وتحليلها مع FV10-ASW 3.1 البرمجيات. وأظهر تحليل الصور والسمية الخلوية الطفيفة جدا في وجود مركب اختبار بعد 5 ساعات من وقت مضي. وقد أظهرت انخفاض طفيف في بقاء الخلية على اتصال مع مقتطفات مركب compar اختبارإد للسيطرة على الخلايا. أبرزت نتائج استخدام 3D CLSM التصوير الفاصل الزمني كوسيلة حساسة نوعيا وكميا لتقييم السلوك توافق مع الحياة من المواد المركبة الأسنان.

Introduction

واحدة من المعايير الرئيسية المدرجة في التوصيات ISO لتحديد توافق مع الحياة هو غياب سمية المواد إلى الخلايا. للراتنجات المركبة الأسنان قد تطلق سراح عناصر من المصفوفة راتنجية، التي يمكن أن تكون بسبب البداية إلى البلمرة الجزئية، و / أو في وقت لاحق بسبب عمليات التدهور بمرور الوقت 1-4. هذه المكونات صدر تتلامس مع أنسجة الفم ويمكن لها عيوب مختلفة مثل التفاعلات الشروية و5 المخاطية، وتنمية الحساسية وفرط الحساسية ردود الفعل في 6 مرضى أو تعديلات من الخلايا الليفية اللثة التشكل والحد على النوع الأول الكولاجين بروتين 7، كبت المناعة أو تنبيه المناعة على mitogen -driven انتشار تنقية الخلايا اللمفاوية التائية وخلايا الطحال (8) والحمض النووي من التلف في الخلايا الليفية اللثة الإنسان الأساسية، وهو ما يؤكد على السمية الجينية المحتملة 9. يمكن أن العديد من المعلمات تؤثر سمية مركب الأسنان مثل الظل من جomposite، وعلاج الخفيفة، والتركيب الكيميائي للمونومر الراتنج، حشو ودرجة تحويل 10- 13. منذ إمكانات في المختبر من المواد السامة يمكن التنبؤ في حالات المجراة ويمكن مقارنة الحالات السريرية من خلال دراسة بعض النقاط الطرفية ذات الصلة. وسمية الخلايا من المواد المركبة الأسنان ومكوناتها تم تقييمها على نطاق واسع باستخدام أنظمة زراعة الخلايا 14- 16.

وقد تم تطوير هذه الأنظمة في المختبر لتقييم توافق مع الحياة المركبة الأسنان في مدة: نمو الخلايا وموت الخلايا المبرمج الخلية باستخدام THP-1monocytes مثل خلايا 17، سمية الخلايا الليفية في اللثة الإنسان 18، وإمكانات التهابات في القرنية مثل خلايا HaCaT 2، وظائف الخلية odontoblast- مثل MDPC 23 19 خلايا، والحد من إجمالي مستويات RNA، وزيادة كبيرة في استحثاث موت الخلايا المبرمج على اللثة الإنسان الكيراتينية 20 والحمض النووي من التلف في اللثة واللب خلايا الليفية 21.

واقترح منهجيات مختلفة للتحقيق في توافق مع الحياة من المواد المركبة الأسنان. تبقى المقايسات اللونية، التي تنطوي على تلوينات محددة وقياسات امتصاص الضوء، والأكثر شيوعا، نظرا لبساطتها النسبية والتكلفة المنخفضة 22- 26. التحليل المجهري على النقيض من ذلك الضوء في كثير من الأحيان يستهلك المزيد من الوقت وتتحمل تكاليف أعلى. ومع ذلك، هذه التقنيات المجهري لديها بعض المزايا الهامة. مراقبة هيكل الخلية تعطي معلومات موسعة حول الآثار السامة من ذوي الخبرة، وبالتالي توفير المزيد من البيانات ذات الصلة والحساسة. على وجه الخصوص، وقد سمح إدخال المجهري متحد البؤر 27 لمراقبة الهياكل البيولوجية مع تحسين دقة المحوري مقارنة واسعة المجال المجاهر مضان التصوير التقليدية. وبالتالي، أصبح التصوير متحد البؤر أداة تحقيق قوية في مختلف مجالاتالبحوث الطبية والعلمية. وعلى النقيض من تقنيات المجهر الإلكتروني والمسح الضوئي المجهري متحد البؤر يوفر القدرة على تصور مكونات متميزة من الخلايا عن طريق إدراج علامات الفلورسنت محددة. معظم هذه استشفاف محددة هي مستقر في البيئة المائية، يمكن قياسه بشكل معقول وغير مكلفة وغير سامة 28، مما يتيح استخدامها في السريرية وكذلك البحوث والدراسات المخبرية. وعلاوة على ذلك، وتجفيف العينات والتثبيت اللازمة لتحليل المجهر الإلكتروني التقليدية ليست ضرورية للمضي وقت التصوير متحد البؤر، وبالتالي الاستحواذ التي تعتمد على الوقت من الممكن أيضا على عينات. مقارنة مع التصوير ثنائي الأبعاد، ومبدأ التصوير متحد البؤر تمكن التصور العينة الجوفية وإعادة هيكل ثلاثي الأبعاد من مختلف الصور التي تم الحصول عليها العمق. الذي يترتب عليه، أكثر دقة وأكثر هيكلية التفاصيل 29، 30. الدراسة الحالية الفيديو هو مثال على استخدام ثلاثي الأبعاد الوقت الفاصل بين Confocal الليزر الضوئي المجهري (3D-CLSM) جنبا إلى جنب مع لايف / وضع العلامات الفلورية الميت وإشارة الكمي كطريقة مبتكرة. هذه التقنية المقدمة في هذه الورقة لديه ميزة تمكين التقييم والوقت الفاصل بين التصوير من حساسية الخلايا الحية دون تغيير بنية الخلية المقررة. ليس هناك حاجة لخطوات التحضير قبل تحليل متحد البؤر. سابقا، تم استخدام نفس تلطيخ لتقييم جدوى مثقف النوى عظم إسفنجي 31 ولكن من دون متحد البؤر الوقت الفاصل التالية. وبالمثل تم استخدام نفس الإجراء الوقت الفاصل بين متحد البؤر لتقييم النشاط الاريثروميسين الوقت القتل في البكتيريا من الحمأة المنشطة وفقا لمن نوع 32 غرام باستخدام بكتيريا محددة لايف / تلطيخ ميت. وقد تكيفت هذه الطرق مؤخرا واستخدمت لمقارنة سمية المركبة الأسنان على أساس أحادية ميتاكريليت 11.

Protocol

ويتكون البروتوكول من ثلاث خطوات رئيسية: تتألف الخطوة الأولى في إعداد خلاصة المركب في وسائل الإعلام الثقافة. اهتمامات الثانية الابتدائية اللثة الخلايا الليفية الإنسان (HGF) زراعة الخلايا، وخلايا الاتصال مع مقتطفات مركبة وتلطيخ الخلية؛ تتكون الخطوة الثالثة من التصوير متحد البؤر وتحليل الإشارات الفلورسنت. لأنسجة اللثة أخذ، وتمت الموافقة على البروتوكول في الامتثال للتشريعات الفرنسية والموافقة المستنيرة واللجنة الأخلاقية المحلية.

1. المركب مقتطفات التحضير

استخدام Dulbecco لتعديل النسر المتوسط ​​(DMEM) باعتبارها وسيلة شطف. تأكد من أن النسبة بين المساحة السطحية للعينات وحجم استخراج المتوسطة هي في أدنى مستوى متطلبات ISO 10993/12. ومؤخرا وصفت الإجراء 11 و بإيجاز فيما يلي:

  1. تشكيل عينات كروية من مركب غير مخمر الأسنان باستخدام قبضة مفصلإيه. حجم حامل هو في دائرة نصف قطرها 2 مم، وهو ما يتفق مع عمق المعالجة ينصح عموما في العلاج السريري عن طريق الفم.
  2. إعداد الآبار لوحة، كل منها يحتوي على 1 مل من مستنبت (DMEM)، مع مزيج 5٪ من البنسلين / الستربتومايسين و 1٪ من الأمفوتريسين لكن دون مصل بقري جنيني (FBS).
  3. عينات علاج داخل DMEM المتوسط ​​تحتوي أيضا باستخدام مصباح ضوء LED مع 1070 ميغاواط سم -2 كثافة (λ = 465-475 نانومتر) لمدة 40 ثانية. تأكد أن المسافة بين طرف علاج والعينات هي في حدود 0.5 مم. استخدام هذا الوضع علاج لمحاكاة اتصال مؤقت بين الأسنان والأسنان مركب غير مخمر. في الحالة السريرية، يحدث الاتصال عندما يتم وضع مركب التصالحية في تجويف الفم.
  4. احتضان عينات (المركبة العينات في DMEM المتوسطة) عند 37 درجة مئوية تحت جو مرطب 5٪ CO 2 في الهواء. احتضان DMEM المتوسطة (بدون عينات مركبة) للخلايا السيطرة في نفس الظروف.

2. HGF خلية ثقافة، مركب مقتطفات اختبار وخلايا تلطيخ

  1. نمو وصيانة مزارع الخلايا
    عزل الخلايا الليفية الإنسان من اللثة صحية خزعات الأنسجة اللثوية من المرضى التي اتخذت خلال الاستخراج تقويم الأسنان الروتينية.
    1. زراعة الخلايا الليفية اللثة الإنسان في DMEM في حضور 10٪ FBS، 5٪ البنسلين / الستربتوميسين و 1٪ الامفوتريسين B. الحفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة تحت جو مرطب من CO 2 5٪ في الهواء.
    2. متوسطة تغير كل 3 أيام، ومرور الخلايا كل 5 أيام. بعد التوصل confluency، وخلايا الحصاد قبل trypsinization.
    3. خلايا الطرد المركزي في 90 x ج لمدة 5 دقائق واعادة تعليق لها على المديين المتوسط ​​الثقافة. عد الخلايا مع عداد الخلايا صولجان يده الآلي.
    4. تعليق خلية البذور في مناطق ذات كثافة خلية من 2.5 × 10 4 خلية / مل في نظام الشرائح غرفة. السماح للحضانة الخلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في جو من 5٪.
  2. إضافة مقتطفات المركبة إلى خلايا في الثقافة
    1. استبدال وسائل الإعلام من بئرين من الشريحة الغرفة بنسبة 1 مل من مقتطفات مركبة اختبار (بعد 24 ساعة من الحضانة).
    2. الحفاظ على اثنين من الآبار المتبقية (خلايا السيطرة) في نفس الظروف.
    3. احتضان الشريحة غرفة تحتوي على أربعة آبار في 37 درجة مئوية في حاضنة، في ظل جو مرطب 5٪ CO 2 في الهواء.
  3. تلطيخ الفلورسنت
    استخدام لايف / الميت السمية الخلوية وصمة عار للخلايا حقيقية النواة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
    ملاحظة: توفر مجموعة من اللونين الفلورسنت فحص سريع لتحديد الجدوى من الخلايا في عدد السكان على أساس سلامة غشاء البلازما والنشاط استريز. وصمة عار تميز على الهواء مباشرة من الخلايا التالفة من خلال وصفها في وقت واحد مع الأخضر الفلورسنت Calcein-AM للإشارة إلى النشاط استريز داخل الخلايا الحمراء وفلوري إيثيديوم homodimer-1 (EthD-1) للإشارة إلى فقدان MEMBRANالبريد النزاهة.
    1. إعداد محلول العمل من اثنين من الكواشف وصمة عار يحتوي على 2 ميكرومتر من Calcein AM و 4 ميكرومتر EthD-1 (تركيز النهائي عنها لتكون مناسبة لتلطيخ الخلايا الليفية). إضافة وصمة عار على الخلايا الملتصقة مثقف في وجود أو عدم وجود مقتطفات المركبة المحدد.
    2. مراقبة مباشرة وبسرعة على السكان الخلية الملون على الأقل 15 دقيقة بعد تلطيخ وخلال الوقت الفاصل بين التصوير. لا الطرد المركزي وليس صورة ذهنية الخلايا الملون.

3. متحد البؤر الوقت الفاصل بين التصوير وتحليل الإشارات

تم تجهيز النظام المستخدم مع أربع وحدات ليزر ديود والملون متعدد الصورة لمدة تصل إلى أربعة الأصباغ الفلورية لكل عينة. النظام يمكن أن تؤدي صورة رسم الخرائط (10X التكبير) الذي يعطي لمحة عامة عن عينة الاختبار على أي واحد يمكن ان تتحرك لمراقبة المنطقة ذات الاهتمام (600X التكبير).

  1. الوقت الفاصل بين التصوير
    1. وضع Specimens (الشريحة غرفة تحتوي على عينات الملون) في غرفة مظلمة من حاضنة متكاملة مبائر (37 ° C، 5٪ من CO 2 والجو رطب).
    2. حدد الليزر المقابلة. استخدام مصادر الليزر اثنين 473 نانومتر (15 ميغاواط) و 559 نانومتر (18 ميغاواط) لإثارة Calcein وEthD-1.
    3. استخدام وضع متسلسل اثنين للحصول على الصور من خلال تسلسل الخط دون الحديث المتبادل في التصوير مع اثنين من الأصباغ المستخدمة مضان.
    4. استخدام كاشف مع طائفة وضعت حديثا لوضع شروط تلقائيا وفقا للصبغة مضان في وحدة المسح الضوئي.
    5. تحسين عرض النطاق الترددي من مضان الكشف عن كل قناة إلى أقصى حد. سجل جميع عمليات الاستحواذ بالتتابع لتجنب المحتملين عبر الحديث.
    6. حدد الشروط التصوير أكثر ملائمة بناء على اختيار صبغة الفلورسنت باستخدام برنامج الاستحواذ.
    7. الحصول على صورة الخريطة التي يتم إنشاؤها تلقائيا من المركز بشكل لولبي،مع مجال اهتمام اختياره بسهولة لدراسة أعمق.
    8. اختر وضع المراقبة. اختر حتى خمسة أنواع من وسائط المراقبة بما في ذلك مرور الزمن، Z المكدس، ومنطقة متعددة حسب الحاجة. استخدام مزيج من Z-المكدس وسائط مرور الزمن في الدراسة وإكمال بسرعة التقاط الصورة،
    9. تغيير وتبديل صبغة الفلورسنت. بدلا من ذلك، تراكب فلوري وعلى النقيض من الصور الضوئية مع بعضها البعض. مراقبة الصورة الحية باستخدام نقطة اختيارهم على اليسرى السفلى الشاشة خريطة.
    10. تحديد منطقة التصوير باستخدام تأطير والتكبير وظائف. اختياريا، تبديل بين عرض لكل نوع من الصبغة مضان.
      ملاحظة: المجهر المستخدمة في هذا البروتوكول لديه نفس الوظائف ك ومتحد البؤر التقليدية عالية في تصميم مضغوط. تم تجهيز المجهر مع أهداف الغمر بالمياه المقلوب التي هي مناسبة بشكل مثالي لمستقر الوقت الفاصل بين التصوير من الخلايا الحية مع مبسطة المدمج في الحاضنة.
    11. تحليل الإشارات وتقدير
      1. استخدام برامج التصوير لقياس إشارة مضان. الحصول على خمس صور خريطة بهدف 10X لكل من اختبار العينة والخلايا السيطرة.
      2. الحصول على الصور العادية 1024 × 1024 بكسل، مع 0.231 ميكرون × 0،231 بكسل حجم ميكرون. تخزين الصور وتنسيق أوليمبوس صورة (المنظمة الدولية للفرانكوفونية) لتحليل الإشارات. هذا الشكل يتيح تخزين إعدادات المعلمة المختلفة والصور معا. استخدام أدوات التحليل المختلفة (قياس كثافة الشخصية، ونسبة كثافة بين اثنين من القنوات المستخدمة).
      3. تخزين الصور الإسقاط القصوى على شكل ملفات TIFF 12 بت / بكسل.
      4. التشكيل التحليلات الإحصائية باستخدام برنامج القائد R. تحليل الاختلافات باستخدام تحليل التباين في اتجاه واحد (ANOVA) واختبار التكرار. النتائج تقرير الانحراف المتوسط ​​وفقا لمعايير (± SD) ودلالة إحصائية عند P <0.05.

Representative Results

أظهر الرقم 1 لمحة عامة عن / خلايا حية ملطخة الميت في صور الخرائط التي تم الحصول عليها (الهدف 10X) لكل من السيطرة والخلايا المعرضة لمقتطفات مركبة اختبار (ELS انكماش منخفضة إضافية). يمكن تصور هيكل ثلاثي الأبعاد من الخلايا في 600X التكبير. يتم تقديم التصور الخلايا التي تم جمعها في غرفة التحكم والخلايا التي تم جمعها في الغرفة بحضور مقتطفات مركبة اختبارها في الشكل 2. الإسقاط الأقصى (60X موضوعي) يوضح مصير السكان الخلية المحددة في بداية مرور الوقت (15 دقيقة) و في نهاية الفترة الفاصل الزمني (في 5 ساعة). وتم الحصول على سبعة وخمسين رزمة من الصور (xyzt مسح وزارة الدفاع، 39 صورة في أكوام، فوكسل متعمقة 1.00 ميكرون) خلال هذه الفترة. وقد تم الحصول على انخفاض طفيف في إشارة الفلورية الخضراء واختلاف طفيف جدا في أحمر فلوري في الخلايا المعرضة. وقد لوحظ عدم وجود اختلاف كبير عن السيطرةالخلايا. تولت خلايا مقتطفات تتعرض المركبة مماثل المغزل التشكل للسيطرة على الخلايا، لم تغير التشكل في هذه الظروف التجريبية (على الرغم من انخفاض إشارة خضراء والزيادة إشارة حمراء في وجود مركب اختبار). أجري تحليل الصورة على خمسة أكوام صورة مختلفة مختارة الموافق السكان خلية مختلفة عن الصور التي تم الحصول عليها لاختبار المركب بالمقارنة مع الخلايا السيطرة السلبية للإشارة الخضراء والحمراء على حد سواء. ويتضح من ملف كثافة الخلايا الملون في الشكل 3؛ كان تطور إشارة خضراء وحمراء من الخلايا في اتصال مع مركب اختبار مماثلة لتلك الخلايا السيطرة. تم قياس Calcein وEthD-1 كثافة الانبعاثات مضان على الخلايا والسيطرة على الخلايا المركبة المكشوفة. وقد تم قياس على فترات ساعة واحدة لمدة تصل إلى خمس ساعة. و/ نسبة مضان أحمر أخضر (بناء على شدة متكاملة من 495-515 نانومتر الأخضر والأحمر 620-650 إشارات نانومترتم حساب) خلال فترة مرور الزمن. وتظهر نسب الجدوى للرقابة والخلايا المعرضة لELS مقتطفات منخفض خارج انكماش في تي 1 قادرة. وفي وجود مركب اختبارها، تم العثور على النسبة المئوية للخلايا الحية لخفض قليلا من 100٪ إلى 93.9٪ بعد ساعة من 1 للإتصال به. وقد لوحظ فرق كبير بين مركب اختبار والسيطرة السلبية (الخلايا دون أي مقتطفات مركبة) بعد 5 ساعة من فترة مرور الزمن المشار إليها.

الشكل 1
الرقم 1: نظرة عامة على رسم الخرائط أظهرت صورة ملطخة الخلايا في موضوعي 10X، (A) خلايا السيطرة و (ب) الخلايا في وجود مقتطفات المركبة (ELS انكماش منخفض الخارجة) في بداية الفترة الفاصل الزمني (ر = 15 دقيقة). المناطق الخضراء هي الخلايا الحية والمناطق الحمراء هي الخلايا التالفة. في هذا وقد لوحظ شروط التجربة، لا الاختلاف (لكل مضان أخضر وأحمر) للمركبات تتعرض خلايا مقارنة مع الخلايا السيطرة السلبية.

الرقم 2
الشكل 2: صور CLSM في موضوعي 60X من السكان الخلية من (A) غرفة التحكم و (ب) مقتطفات مركبة الغرفة في بداية ونهاية فترة التعرض مرور الزمن (I: 15 دقيقة والثاني: 5 ساعة، على التوالي ). المناطق الخضراء هي الخلايا الحية والمناطق الحمراء هي الخلايا التالفة. وأظهرت لوحة من الصور تغيير طفيف في كثافة إشارة (انخفاض طفيف في إشارة الخضراء وزيادة طفيفة جدا في حمراء واحدة). ولم تلاحظ اي تغييرات مورفولوجيا الخلايا في وجود مقتطفات مركبة. كشف خلايا حافظت التشكل على شكل مغزل وأرومي ليفي على شكل خلايا السيطرة.

gether.within صفحة = "دائما"> الرقم 3
الرقم 3: الملف الخط من الخلايا التي لوحظت في الوقت الفاصل بين المجهري خلايا (A) تحكم (ب) خلايا مقتطفات المركبة المكشوفة، (I) في 15 دقيقة و (الثاني) في 5 ساعة. لا يوجد تباين واضح في تطور إشارة خضراء في وجود مركب اختبار بغض النظر عن اتصال الوقت. ومع ذلك، لوحظ زيادة طفيفة للإشارة الحمراء في وجود مركب 5 بعد ساعة من الاتصال.

وقت الاتصال (ساعة) بقاء الخلية (٪)
1 2 3 4 5
الخلايا السيطرة 100 100 100 </ td> 100 100
ELS منخفض خارج انكماش ® 93.9 ± 7 91.3 ± 5 * 89.5 ± 3 * 87.6 ± 2 * 87.7 ± 3 *

وكان يعاير معدل تطور الخلايا الحية HGF بعد 1 و 2 و 3 و 4 و 5 ساعة من الاتصال مع المركبة مقتطفات بقاء الخلية من خلال تلطيخ باستخدام ايف / طقم سمية الخلايا الميتة: الجدول 1. وتظهر بيانات القيم يعني ± SD من خمس صور مداخن التحليل. القيم تختلف اختلافا كبيرا من الخلايا السيطرة على P <0.05.

Discussion

سلوك المواد توافق مع الحياة هو المعلمة الأكثر مسبق ليتم تقييمها قبل الاستعمال الطبي. تغطي المعايير الدولية الأجهزة الطبية ISO 10993 33 وتحديدا مواد طب الأسنان ISO 7405 34. إن عدم وجود آثار سامة على الخلايا المحيطة هو القاعدة الرئيسية في تقييم توافق مع الحياة من هذه المواد. هذا هو السبب في اختبار السمية الخلوية لديه مثل هذه الأهمية في تقييم مواد طب الأسنان التوافق الحيوي 35-37. اقترح ISO يمكن أن تستند طرق الاختبار على النشاط الأيضي أو سلامة الغشاء. يجب النهاية اختيار متابعة شروط محددة لترتيب الآثار السلبية الناجمة عن مادة الاختبار وذلك لتقليل الوقت وتكلفة المقايسات التقييم. الطريقة الحالية من التحقيق (3D الوقت متحد البؤر التصوير مرور) هو سلامة غشاء القائم. ويبدو تقييم السمية الخلوية عبر هذه نقطة النهاية لتكون علامة قيمة من خلية biocompatibility مع المواد المختبرة وأنه هو أيضا وافق ISO نقطة النهاية. في المختبر يتم تصميم اختبارات لتحديد كيفية تأثير عينة مادية نوع خلية معينة. وقد وصف MTT فحص اللونية في الأصل من قبل موسمان (1983) كوسيلة مفيدة لقياس سمية الخلايا في المختبر وتكاثر الخلايا. ويستند اختبار MTT على تحويل الملح نتروبلو إلى بلورات formazan من قبل خلايا نشطة، والذي يحدد نشاط الميتوكوندريا. وهذا يمكن أن تترجم بمعدل 38 الجدوى. وذكرت والمتعاونين غوبتا أن الاختبار الإنتقالي العسكري هو الأسلوب الأكثر استخداما على نطاق واسع لقياس السمية الخلوية من الراتنجات المركبة. كما استخدمت نازعة السكسينيك وردود الفوسفاتيز القلوية لنفس الغرض 39. ومع ذلك، لا يمكن أن تتبع الخلايا مصير ما يصل، لأن الفحص الإنتقالي العسكري يتطلب قتل الخلايا في كل نقطة زمنية القياس. من أجل مراقبة عن كثب سلوك الخلايا الملون في الدراسة الحالية، ديتم إجراء المراقبة مصحح من الخلايا الحية، وذلك بفضل لوقت التصوير مرور CLSM جنبا إلى جنب مع تلطيخ بروتوكول القصير، تحليل الصور آليا والكمي إشارة الفلورسنت.

المركبة الأسنان تأتي في اتصال وثيق مع أنسجة الفم واللثة وخصوصا اللب الخلايا. أن الخلايا الليفية يكون الهدف من مكونات صدر من هذه المركبات التصالحية 40-41. وعلاوة على ذلك، فقد ذكرت العديد من الدراسات أن الخلايا خلد والخلايا الأولية قد تكون الاستجابات الخلوية المختلفة في اتصال مع المواد الحيوية. تم العثور على الخلايا الأولية لتكون أكثر ملاءمة لتقييم آثار المواد الحيوية 42. هذا ما يفسر استخدام الخلايا الليفية اللثة الإنسان الأساسية كنموذج خلية لتقييم السمية الخلوية للمركب الأسنان اختبرت في الدراسة الحالية. وقد درس على نطاق واسع احتمال سمية المواد التي تطلق من مركب الأسنان 43-44. من أجل تقييم رانه السامة المحتملة من المواد، ويمكن أن يؤديها خلايا نموذج الاتصال اثنين. في نظام نموذجي اتصال مباشر يتم وضع المواد مباشرة مع الخلايا المستهدفة بينما في نظام الاتصال غير المباشر، استهداف الخلايا هي على اتصال مع elutes من وسائل الاعلام البيولوجي. في التطبيقات السريرية والإجراءات التصالحية، وتوضع حشوة ضوئية على اتصال غير مباشر مع أنسجة اللثة. لهذا السبب، كان يركز البروتوكول التجريبي الحالي على نظام اتصال غير مباشر مع الخلايا الليفية الإنسان اللثة (خلايا بحضور مقتطفات مركبة اختبار). كما ذكرت سابقا دال والمتعاونين، كانت في المرتبة استجابات شديدة السمية الخلوية مثل (<30٪)، متوسطة (30-60٪)، خفيف (60-90٪) أو غير السامة للخلايا (> 90٪) على أساس النشاط النسبي ل القيم التي تم الحصول عليها لضوابط 45. وبالتالي، وفقا لهذا الترتيب، وفي ضوء النتائج التي تم الحصول عليها (الجدول 1)، يمكن أن يكون في المرتبة مركب ELS انكماش منخفض خارج كما الاصدارذ السامة للخلايا قليلا، وأظهر سلوك مماثل للسيطرة على الخلايا خلال فترة الفاصل الزمني بأكملها. باستخدام نفس الطريقة بالضبط التحقيق، يمكن مقارنة نتائج هذه الدراسة إلى أن من دراسة نشرت مؤخرا. أظهر ELS إضافية منخفضة انكماش مركب توافق مع الحياة متفوقة مقارنة مع اثنين من اختبار المركبة المستخدمة سابقا لنفس التطبيق السريري الذي هو استعادة مباشرة 11. دراسات أخرى لا تزال ضرورية لإقامة المقارنة أكثر اكتمالا.

عند البت فيها فحص السمية الخلوية للموافقة على إجراء تقييم نقطة نهاية محددة، فإنه من المهم فهم مزايا وحدود كل فحص. الغرض الرئيسي من التصوير متحد البؤر هو تحقيق العمارة 3-D من الخلايا والأعضاء. هذه التقنية قادرة على كشف ليس فقط سطح العينة، ولكن أيضا تحت السطحية لها. بروتوكول الموصوفة هنا يؤكد استخدام 3D CLSM وقت التصوير مرور متحد البؤر، كما سينسيطريقة موانع لتقييم السلوك توافق مع الحياة في المختبر من مركب الأسنان. ومع ذلك، من أجل تجنب القيود التي واجهتها في هذا العمل، يمكن أن تستخدم محطات العمل المضادة للاهتزاز وذلك للسماح أكثر استقرارا وأطول وقت التصوير مرور. الطاولة يمكن عزل نظام متحد البؤر المستخدمة من الآثار الضارة التي الاهتزازات في المختبر قد يسبب. وعلاوة على ذلك، ومواد لاستخدامها في جوف الفم يجب أن يكون مثاليا غير ضارة للأنسجة اللثة ويجب أن لا تحتوي على المواد التي يمكن أن تسبب سمية جهازية. وفقا للمنهجية المتبعة والنتائج المتحصل عليها من هذه الدراسة يمكن استنتاج أن مركب اختبار (ELS انكماش منخفض خارج) لا السامة للخلايا في الظروف التجريبية الحالية. كما أن طريقة CLSM يمكن أن تعطي بحساسية معدل الأولي للخلايا قابلة للحياة، يمكن أن يتوقع احتمالات أخرى لتقييم نقاط نهاية أخرى. على وجه الخصوص، كما أفيد مؤخرا أن تؤثر على الخلايا أحادية المركبة عبتيough أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS) 46- 48، هناك حاجة إلى إجراء مزيد من التحقيقات لتقييم الارتباطات إن وجدت بين السمية الخلوية وشبكات إنتاج ROS الإشارة. ويمكن تصميم البروتوكول المقبل لتقييم الانتاج في وقت واحد ريوس (H 2 O 2 و / أو O 2 - تلوين) ونسبة السمية الخلوية (لايف / تلطيخ الميت) باستخدام التصوير مرور الوقت CLSM.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Olympus Fluoview FV10i  Olympus Confocal microscope
O2/CO2 Incubator Pnasonic MCO 5M Cell incubation
Live/Dead Kit Invitrogen  MP 03224 Stain 
ELS extra low shrinkage   Saremco  Dental composite
DMEM medium Sigma D 6046 Culture medium
Trypsin Sigma T1426 harvesting cells
chamber slide system   PAA 14220040X Culture chamber
penicillin/streptomycin  PAA P11-010 Cell culture
Amphotericin B PAA P11-001 Cell culture
Fetal bovine serum  PAA A11-101 Cell culture
Cell Counter Merck Millipore 00110230TP1 Cell counting 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Van Landuyt, K. L., et al. How much do resin-based dental materials release? A meta-analytical approach. Dent. Mater. 27 (8), 723-747 (2011).
  2. Moharamzadeh, K., Van Noort, R., Brook, I. M., Scutt, A. M. Cytotoxicity of resin monomers on human gingival fibroblasts and HaCaT keratinocytes. Dent. Mater. 23 (1), 40-44 (2007).
  3. Santerre, J. P., Shajii, L., Leung, B. W. Relation of dental composite formulations to their degradation and the release of hydrolyzed polymeric-resin-derived products. Crit. Rev. Oral Biol. Med. 12 (2), 136-151 (2001).
  4. Geurtsen, W. Biocompatibility of resin-modified filling materials. Crit. Rev. Oral Biol. Med. 11 (3), 333-355 (2000).
  5. Hensten-Pettersen, A. Skin and mucosal reactions associated with dental materials. Eur. J. Oral Sci. 106 (2), 707-712 (1998).
  6. Paranjpe, A., Sung, E. C., Cacalano, N. A., Hume, W. R., Jewett, A. N-acetyl cysteine protects pulp cells from resin toxins in vivo. J. Dent. Res. 87 (6), 537-541 (2008).
  7. Falconi, M., Teti, G., Zago, M., Pelotti, S., Breschi, L., Mazzotti, G. Effects of HEMA on type I collagen protein in human gingival fibroblasts. Cell. Biol. Toxicol. 23 (5), 313-322 (2007).
  8. Jontell, M., Hanks, C. T., Bratel, J., Bergenholtz, G. Effects of unpolymerized resin components on the function of accessory cells derived from the rat incisor. 74 (5), 1162-1167 (1995).
  9. Urcan, E., Scherthan, H., Styllou, M., Haertel, U., Hickel, R., Reichl, F. -X. Induction of DNA double-strand breaks in primary gingival fibroblasts by exposure to dental resin composites. Biomaterials. 31 (8), 2010-2014 (2010).
  10. Sigusch, B. W., et al. Resin-composite cytotoxicity varies with shade and irradiance. 28 (3), 312-319 (2012).
  11. Attik, G. N., Pradelle-Plasse, N., Campos, D., Colon, P., Grosgogeat, B. Toxicity Evaluation of Two Dental Composites: Three-Dimensional Confocal Laser Scanning Microscopy Time-Lapse Imaging of Cell Behavior. Microsc. Microanal. 19, 596-607 (2013).
  12. Ausiello, P., et al. Cytotoxicity of dental resin composites: an in vitro evaluation. J. Appl. Toxicol. 33 (6), 451-457 (2011).
  13. Durner, D., Obermaier, J., Draenert, M., Ilie, N. Correlation of the degree of conversion with the amount of elutable substances in nano-hybrid dental composites. Dent. Mat. 28 (11), 1146-1153 (2013).
  14. Sigusch, B. W., Völpel, A., Braun, I., Uhl, A., Jandt, K. D. Influence of different light curing units on the cytotoxicity of various dental composites. Dent. Mater. 23 (11), 1342-1348 (2007).
  15. Knezevic, A., Zeljezic, D., Kopjar, N., Tarle, Z. Influence of curing mode intensities on cell culture cytotoxicity/genotoxicity. Am. J. Dent. 22 (1), 43-48 (2009).
  16. Krifka, S., Seidenader, C., Hiller, K. -A., Schmalz, G., Schweikl, H. Oxidative stress and cytotoxicity generated by dental composites in human pulp cells. Clin. Oral Investig. 16 (1), 215-224 (2012).
  17. Harorli, O. -T., Bayindir, Y. -Z., Altunkaynak, Z., Tatar, A. Cytotoxic effects of TEGDMA on THP-1 cells in vitro. Med. Oral Patol. Oral Cir. Bucal. 14 (9), 489-493 (2009).
  18. Reichl, F. X., et al. Cytotoxicity of dental composite (co)monomers and the amalgam component Hg(2+) in human gingival fibroblasts. Arch. Toxicol. 80 (8), 465-472 (2006).
  19. Aranha, A. M. F., Giro, E. M. A., Hebling, J., Lessa, F. C. R., Costa, C. A. deS. Effects of light-curing time on the cytotoxicity of a restorative composite resin on odontoblast-like cells. J. Appl. Oral Sci. 18 (5), 461-466 (2010).
  20. Schulz, S. D., König, A., Steinberg, T., Tomakidi, P., Hellwig, E., Polydorou, O. Human gingival keratinocyte response to substances eluted from Silorane composite material reveal impact on cell behavior reflected by RNA levels and induction of apoptosis. Dent. Mater. 28 (8), 135-142 (2012).
  21. Tadin, A., Marovic, D., Galic, N., Kovacic, I., Zeljezic, D. Composite-induced toxicity in human gingival and pulp fibroblast cells. Acta Odontol. Scand. 72 (4), 304-311 (2014).
  22. Schweikl, H., Schmalz, G. Toxicity parameters for cytotoxicity testing of dental materials in two different mammalian cell lines. Eur. J. Oral Sci. 104 (3), 292-299 (1996).
  23. Issa, Y., Watts, D. C., Brunton, P. A., Waters, C. M., Duxbury, A. J. Resin composite monomers alter MTT and LDH activity of human gingival fibroblasts in. 20 (1), 12-20 (2004).
  24. Brambilla, E., Gagliani, M., Ionescu, A., Fadini, L., García-Godoy, F. The influence of light-curing time on the bacterial colonization of resin composite surfaces. 25, 1067-1072 (2009).
  25. Modareszadeh, M. R., et al. Cytotoxicity of set polymer nanocomposite resin root-end filling materials. Int. Endod. J. 44, 154-161 (2011).
  26. Tamilselvam, S., Divyanand, M. J., Neelakantan, P. Biocompatibility of a conventional glass ionomer, ceramic reinforced glass ionomer, giomer and resin composite to fibroblasts: in vitro study. J. Clin Pediatr. Dent. 37 (4), 403-406 (2013).
  27. White, J. G., Amos, W. B., Fordham, M. An evaluation of confocal versus conventional imaging of biological structures by fluorescence light microscopy. J. Cell Biol. 105 (1), 41-48 (1987).
  28. Alpino, P. H. P., Pereira, J. C., Svizero, N. R., Rueggeberg, F. A., Pashley, D. H. Use of fluorescent compounds in assessing bonded resin-based restorations: a literature review. J. Dent. 34 (9), 623-634 (2006).
  29. Chen, Y., Liang, C. -P., Liu, Y., Fischer, A. H., Parwani, A. V., Pantanowitz, L. Review of advanced imaging techniques. J. Pathol. Inform. 3, 22 (2012).
  30. Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. C. Advanced Fluorescence Microscopy Techniques—FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM. Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).
  31. Stoddart, M. J., Furlong, P. I., Simpson, A., Davies, C. M., Richards, R. G. A comparison of non-radioactive methods for assessing viability in ex vivo cultured cancellous bone: technical note. Eur. Cell Mater. 12, 16-25 (2006).
  32. Louvet, J. N., Attik, G., Dumas, D., Potier, O., Pons, M. N. Simultaneous Gram and viability staining on activated sludge exposed to erythromycin: 3D CLSM time-lapse imaging of bacterial disintegration. Int. J. Hyg. Environ. Health. 214 (6), 470-477 (2011).
  33. Dentistry - Preclinical evaluation of biocompatibility of medical devices used in dentistry - Test methods for dental materials. International Standards Organization. , (2009).
  34. Biological evaluation of dental devices. International Standards Organization. , (2009).
  35. Elshahawy, W. M., Watanabe, I., Kramer, P. In vitro cytotoxicity evaluation of elemental ions released from different prosthodontic material. Dent. Mater. 25 (12), 1551-1556 (2009).
  36. Williams, D. F. On the mechanisms of biocompatibility. Biomaterials. 29 (20), 2941-2953 (2008).
  37. Illeperuma, R. P., et al. Immortalized gingival fibroblasts as a cytotoxicity test model for dental materials. J. Mater. Sci. Mater. Med. 23 (3), 753-762 (2012).
  38. Wataha, J. C., Lockwood, P. E., Bouillaguet, S., Noda, M. In vitro biological response to core and flowable dental restorative materials. Dent. Mater. 19 (1), 25-31 (2003).
  39. Ergun, G., Egilmez, F., Yilmaz, S. Effect of reduced exposure times on the cytotoxicity of resin luting cements cured by high-power led. J. Appl. Oral Sci. 19 (3), 286-292 (2011).
  40. Yap, A. U., Han, V. T., Soh, M. S., Siow, K. S. Elution of leachable components from composites after LED and halogen light irradiation. Operative Dentistry. 29 (4), 448-453 (2004).
  41. Lee, S. Y., Greener, E. H., Menis, D. L. Detection of leached moieties from dental composites in fluids stimulating food and. 11 (6), 348-353 (1995).
  42. Anselme, K., Davidson, P., Popa, A. M., Giazzon, M., Liley, M., Ploux, L. The interaction of cells and bacteria with surfaces structured at the nanometre scale. Acta Biomateriala Journa. 6 (10), 3824-3846 (2010).
  43. Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J. Immunol. Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
  44. Gupta, S. K., Saxena, P., Pant, V. A., Pant, A. B. Release and toxicity of dental resin composite. Toxicol. Int. 19 (3), 225-234 (2012).
  45. Dahl, J. E., Frangou-Polyzois, M. J., Polyzois, G. L. In vitro biocompatibility of denture relining materials. Gerodontology. 23 (1), 17-22 (2006).
  46. Krifka, S., Seidenader, C., Hiller, K. A., Schmalz, G., Schweikl, H. Oxidative stress and cytotoxicity generated by dental composites in human pulp cells. Clin. Oral Investig. 16 (1), 215-224 (2012).
  47. Krifka, S., Spagnuolo, G., Schmalz, G., Schweikl, H. A review of adaptive mechanisms in cell responses towards oxidative stress caused by dental resin monomers. Biomaterials. 34 (19), 4555-4563 (2013).
  48. Chang, M. C., et al. The role of reactive oxygen species and hemeoxygenase-1 expression in the cytotoxicity, cell cycle alteration and apoptosis of dental pulp cells induced by BisGMA. Biomaterials. 31, 8164-8171 (2010).

Tags

الطب، العدد 93،
التصوير متحد البؤر الفاصل الزمني كما وسيلة فعالة لتقييم Cytocompatibility من المركبات الأسنان
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Attik, G. N., Gritsch, K., Colon,… More

Attik, G. N., Gritsch, K., Colon, P., Grosgogeat, B. Confocal Time Lapse Imaging as an Efficient Method for the Cytocompatibility Evaluation of Dental Composites. J. Vis. Exp. (93), e51949, doi:10.3791/51949 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter