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Medicine

दंत कंपोजिट के Cytocompatibility मूल्यांकन के लिए एक कारगर तरीका के रूप में confocal समय चूक इमेजिंग

Published: November 9, 2014 doi: 10.3791/51949
Automatic Translation
1, 1,2, 1,3, 1,2
1Laboratoire des Multimatériaux et Interfaces, UMR CNRS 5615, Université Lyon1, 2UFR d'Odontologie, Université Lyon1; Service de Consultations et de Traitements Dentaires, Hospices Civils de Lyon, 3UFR d'Odontologie, Université Paris Diderot; Service d'Odontologie, APHP, Hôpital Rothschild

Summary

दंत कंपोजिट के biocompatibility के सबसे अधिक अध्ययन पहलू फ्लोरोसेंट संकेत मात्रा का ठहराव के साथ संयुक्त उनके cytotoxicity 3 डी CLSM समय चूक इमेजिंग समय के साथ सेल भाग्य का संवेदनशील मूल्यांकन की अनुमति देता है. इस विधि का उपयोग दंत कंपोजिट cytocompatibility का आकलन करने के लिए एक कुशल उपकरण हो सकता है.

Abstract

यह आम तौर पर इन विट्रो सेल सामग्री बातचीत दंत सामग्री biocompatibility के मूल्यांकन में एक उपयोगी कसौटी है कि स्वीकार कर लिया है. इस अध्ययन का उद्देश्य दंत कंपोजिट में इन विट्रो biocompatibility का आकलन करने के लिए 3 डी CLSM समय व्यतीत confocal इमेजिंग का इस्तेमाल किया गया. इस विधि समग्र दंत निष्कर्षों के साथ संपर्क में व्यवहार्य सेल दर का सही और संवेदनशील संकेत प्रदान करता है. एल्स अतिरिक्त कम दबाव, प्रत्यक्ष बहाली के लिए इस्तेमाल एक समग्र दंत, उदाहरण के रूप में लिया गया है. इन विट्रो आकलन लाइव / मृत धुंधला का उपयोग सुसंस्कृत प्राथमिक मानव मसूड़ों fibroblast कोशिकाओं पर प्रदर्शन किया गया था. छवियाँ FV10i confocal जैविक उल्टे प्रणाली के साथ प्राप्त की है और FV10-ASW 3.1 सॉफ्टवेयर के साथ विश्लेषण किया गया. छवि विश्लेषण समय चूक के 5 घंटे के बाद जांच की समग्र की उपस्थिति में एक बहुत ही मामूली cytotoxicity दिखाया. सेल व्यवहार्यता का एक मामूली कमी का परीक्षण समग्र अर्क compar साथ संपर्क में दिखाया गया थाएड कोशिकाओं को नियंत्रित करने के लिए. निष्कर्ष गुणात्मक और मात्रात्मक दंत कंपोजिट biocompatibility के व्यवहार का मूल्यांकन करने के लिए एक संवेदनशील तरीके के रूप में 3 डी CLSM समय चूक इमेजिंग के उपयोग पर प्रकाश डाला.

Introduction

Biocompatibility परिभाषित करने के लिए आईएसओ सिफारिशों में उद्धृत मुख्य मानकों में से एक की कोशिकाओं के लिए सामग्री विषाक्तता का अभाव है. राल आधारित दंत कंपोजिट समय 1-4 से अधिक और / या बाद में होने के कारण गिरावट प्रक्रियाओं को आंशिक polymerization के लिए शुरू में होने के कारण हो सकता है जो राल मैट्रिक्स से घटकों, जारी कर सकते हैं. ये जारी घटकों मौखिक ऊतकों के साथ संपर्क में आते हैं और urticarial और mucosal प्रतिक्रियाओं 5, रोगियों 6 में एलर्जी और अतिसंवेदनशीलता प्रतिक्रियाओं का विकास, माइटोजन पर प्रकार पर मसूड़ों fibroblasts आकृति विज्ञान और कमी के संशोधनों मैं कोलेजन प्रोटीन 7, प्रतिरक्षादमन या immunostimulation जैसे विभिन्न कमियां हो सकती है उनके genotoxic संभावित 9 रेखांकित करता है जो शुद्ध टी लिम्फोसाइट और तिल्ली कोशिकाओं 8 और प्राथमिक मानव मसूड़ों fibroblasts में डीएनए की क्षति की संचालित प्रसार,. कई मापदंडों ऐसी ग की छाया के रूप में समग्र दंत विषाक्तता को प्रभावित कर सकते हैंomposite, प्रकाश इलाज, राल मोनोमर की रासायनिक संरचना, भराव और रूपांतरण 10- 13 डिग्री. सामग्री की इन विट्रो विषाक्त संभावित विवो परिस्थितियों में भविष्यवाणी कर सकते हैं और कुछ प्रासंगिक समापन के अध्ययन से नैदानिक ​​स्थितियों की तुलना में किया जा सकता है. दंत कंपोजिट और उनके घटकों के cytotoxicity व्यापक रूप से सेल संस्कृति सिस्टम 14- 16 का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया है.

ये इन विट्रो प्रणालियों की अवधि में दंत कंपोजिट biocompatibility का आकलन करने के लिए विकसित किया गया है: सेल के विकास, और सेल एपोप्टोसिस कोशिकाओं 17 तरह THP-1monocytes का उपयोग, मानव मसूड़ों fibroblasts के 18 में cytotoxicity, HaCaT में भड़काऊ संभावित कोशिकाओं 2, सेल कार्यक्षमता की तरह keratinocytes odontoblast- MDPC-23 कोशिकाओं 19, कुल शाही सेना के स्तर में कमी, और मानव मसूड़ों पर apoptosis की प्रेरण में उल्लेखनीय वृद्धि की तरह keratinocytes 20 औरमसूड़ों और लुगदी fibroblast कोशिकाओं 21 पर डीएनए की क्षति.

विभिन्न तरीकों दंत कंपोजिट के biocompatibility जांच करने के लिए सुझाव दिया है. विशिष्ट colorants और प्रकाश सोखना माप शामिल है जो वर्णमिति assays, कारण उनके रिश्तेदार सादगी और कम लागत 22- 26 को, सबसे अधिक इस्तेमाल किया रहते हैं. प्रकाश विपरीत माइक्रोस्कोपी विश्लेषण अक्सर अधिक समय खपत और उच्च लागत incurs. हालांकि, इन माइक्रोस्कोपी तकनीक कुछ महत्वपूर्ण लाभ है. सेल संरचना का अवलोकन इस प्रकार अधिक प्रासंगिक और संवेदनशील डाटा उपलब्ध कराने, अनुभवी विषाक्त प्रभाव के बारे में विस्तृत जानकारी देता है. विशेष रूप से, confocal माइक्रोस्कोपी 27 की शुरूआत पारंपरिक व्यापक क्षेत्र इमेजिंग प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी की तुलना में अक्षीय संकल्प में सुधार के साथ जैविक संरचनाओं के अवलोकन के लिए अनुमति दी गई है. इसलिए, confocal इमेजिंग के विभिन्न क्षेत्रों में एक शक्तिशाली खोजी उपकरण बन गया हैचिकित्सा और विज्ञान शोध. इलेक्ट्रॉनिक माइक्रोस्कोपी तकनीक के विपरीत, स्कैनिंग confocal माइक्रोस्कोपी विशिष्ट फ्लोरोसेंट मार्कर के समावेश से कोशिकाओं के अलग घटकों कल्पना करने की क्षमता प्रदान करता है. इन विशिष्ट ट्रेसर से ज्यादातर उनके नैदानिक ​​में उपयोग के साथ-साथ प्रयोगशाला अनुसंधान अध्ययन की अनुमति, एक जलीय वातावरण में स्थिर समझदारी से औसत दर्जे का, सस्ती और 28 गैर विषाक्त कर रहे हैं. इसके अलावा, पारंपरिक इलेक्ट्रॉनिक माइक्रोस्कोपी विश्लेषण के लिए आवश्यक नमूना सुखाने और निर्धारण के समय चूक confocal इमेजिंग के लिए आवश्यक नहीं है, इस प्रकार समय पर निर्भर अधिग्रहण के नमूने पर भी संभव है. दो आयामी इमेजिंग की तुलना में, confocal इमेजिंग सिद्धांत एक नमूना उपसतह दृश्य और विभिन्न प्राप्त गहराई छवियों से तीन आयामी संरचना के पुनर्निर्माण के लिए सक्षम बनाता है; में परिणाम है, जो अधिक सटीक और अधिक संरचनात्मक विवरण 29, 30. वर्तमान वीडियो अध्ययन तीन आयामी समय चूक सी के उपयोग का एक उदाहरण हैएक अभिनव पद्धति के रूप में रहने / मृत फ्लोरोसेंट लेबलिंग और संकेत मात्रा का ठहराव के साथ संयुक्त onfocal लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (3 डी-CLSM). इस पत्र में प्रस्तुत तकनीक का मूल्यांकन सेल संरचना को बदलने के बिना जीवित कोशिकाओं के संवेदनशील मूल्यांकन और समय चूक इमेजिंग सक्षम करने का लाभ दिया है. कोई तैयारी चरणों में confocal विश्लेषण से पहले आवश्यक हैं. इससे पहले, एक ही धुंधला सुसंस्कृत जालीदार हड्डी कोर 31 की व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए, लेकिन निम्न confocal समय चूक के बिना इस्तेमाल किया गया था. इसी प्रकार एक ही समय चूक confocal प्रक्रिया / एक विशिष्ट जीवाणु लाइव मृत धुंधला का उपयोग उनके ग्राम प्रकार 32 के अनुसार सक्रिय कीचड़ के बैक्टीरिया में इरिथ्रोमाइसिन समय-मारने गतिविधि का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. इन विधियों हाल ही में रूपांतरित किया और मेथाक्रिलेट मोनोमर्स 11 के आधार पर दंत कंपोजिट की विषाक्तता तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया गया है.

Protocol

प्रोटोकॉल तीन प्रमुख चरण होते हैं: पहला कदम संस्कृति मीडिया में समग्र निकालने की तैयारी शामिल है; दूसरे की चिंताओं प्राथमिक मानव मसूड़ा fibroblasts (HGF) सेल संस्कृति, समग्र अर्क और सेल धुंधला के साथ कोशिकाओं के संपर्क; तीसरे चरण के confocal इमेजिंग और फ्लोरोसेंट संकेत विश्लेषण के होते हैं. मसूड़ों के ऊतकों लेने के लिए, प्रोटोकॉल फ्रांसीसी कानून, सूचित सहमति और स्थानीय नैतिक समिति के अनुपालन में अनुमोदित किया गया था.

1. समग्र अर्क तैयार

क्षालन माध्यम के रूप में Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) का प्रयोग करें. नमूनों की सतह क्षेत्र और निकासी माध्यम की मात्रा के बीच अनुपात आईएसओ 10993/12 आवश्यकताओं के निम्नतम स्तर पर है कि सुनिश्चित करें. प्रक्रिया हाल ही में 11 में वर्णित है और नीचे संक्षेप में उल्लिखित है:

  1. एक bespoke पकड़ का उपयोग uncured समग्र दंत की गोलाकार नमूने पर्चाएर. धारक आकार मौखिक चिकित्सीय उपचार में आम तौर पर सलाह दी इलाज गहराई के अनुसार है जो त्रिज्या में 2 मिमी, है.
  2. थाली कुओं तैयार, एक 5% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के मिश्रण और Amphotericin के 1% के साथ, लेकिन भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के बिना संस्कृति के माध्यम से प्रत्येक युक्त 1 मिलीलीटर (DMEM),.
  3. 40 सेकंड के लिए एक 1,070 मेगावाट सेमी -2 तीव्रता (λ = 465-475 एनएम) के साथ एक एलईडी प्रकाश दीपक का उपयोग अच्छी तरह से युक्त DMEM मध्यम भीतर इलाज के नमूने. इलाज टिप और नमूने के बीच की दूरी 0.5 मिमी की रेंज में है कि सुनिश्चित करें. दांत और uncured समग्र दंत बीच अस्थायी संपर्क अनुकरण करने के लिए इस इलाज मोड का प्रयोग करें. दृढ समग्र मौखिक गुहा में रखा जाता है जब नैदानिक ​​स्थिति में, संपर्क होता है.
  4. हवा में 5% सीओ 2 के humidified माहौल के तहत 37 डिग्री सेल्सियस के नमूने (DMEM मध्यम में कंपोजिट नमूनों) सेते हैं. उसी स्थिति में नियंत्रण कक्षों के लिए (समग्र नमूने के बिना) DMEM मध्यम सेते हैं.

2. HGF सेल संस्कृति, समग्र अर्क परीक्षण और प्रकोष्ठों धुंधला

  1. विकास और सेल संस्कृतियों का रखरखाव
    दिनचर्या orthodontic एक्सट्रेक्शन के दौरान लिया रोगियों के स्वस्थ मसूड़ों के ऊतकों बायोप्सी से मानव मसूड़ों fibroblasts के अलग.
    1. 10% FBS की उपस्थिति में DMEM में मानव मसूड़ों fibroblasts खेती, 5% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन और 1% Amphotericin बी हवा में 5% सीओ 2 के एक humidified वातावरण के तहत इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को बनाए रखने.
    2. बदला मध्यम हर 3 दिन, और पारित होने कोशिकाओं हर 5 दिनों. Trypsinization द्वारा confluency, फसल कोशिकाओं तक पहुँचने के बाद.
    3. 5 मिनट के लिए 90 XG पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं संस्कृति के माध्यम में उन्हें फिर से निलंबित. एक राजदंड हाथ में स्वचालित सेल काउंटर के साथ कोशिकाओं की संख्या.
    4. एक कक्ष स्लाइड प्रणाली में 2.5 एक्स 10 4 कोशिकाओं / एमएल के एक सेल घनत्व में बीज सेल निलंबन. एक 5% माहौल में रातोंरात 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं के ऊष्मायन की अनुमति दें.
  2. संस्कृति में कोशिकाओं को समग्र अर्क के अलावा
    1. (ऊष्मायन के 24 घंटे के बाद) का परीक्षण समग्र अर्क के 1 मिलीलीटर से चैम्बर स्लाइड के दो कुओं की मीडिया बदलें.
    2. उसी स्थिति में शेष दो कुओं (नियंत्रण कोशिकाओं) बनाए रखें.
    3. हवा में 5% सीओ 2 के एक humidified वातावरण के तहत, इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस से कम चार कुओं युक्त चैम्बर स्लाइड सेते हैं.
  3. फ्लोरोसेंट धुंधला
    निर्माता के निर्देशों के अनुसार यूकेरियोटिक कोशिकाओं के लिए लाइव / मृत cytotoxicity दाग का प्रयोग करें.
    नोट: किट प्लाज्मा झिल्ली अखंडता और esterase गतिविधि के आधार पर आबादी में कोशिकाओं की व्यवहार्यता का निर्धारण करने के लिए एक त्वरित दो रंग फ्लोरोसेंट परख प्रदान करता है. दाग membran के intracellular esterase गतिविधि और लाल फ्लोरोसेंट ethidium homodimer-1 (EthD-1) से संकेत मिलता है नुकसान इंगित करने के लिए एक साथ हरी फ्लोरोसेंट Calcein-पूर्वाह्न साथ लेबलिंग से क्षतिग्रस्त कोशिकाओं से लाइव भेदई अखंडता.
    1. Calcein AM 2 माइक्रोन और 4 माइक्रोन EthD -1 (तंतुप्रसू धुंधला के लिए उपयुक्त होने की सूचना दी अंतिम एकाग्रता) युक्त दो दाग अभिकर्मकों की एक काम समाधान तैयार करें. चयनित समग्र अर्क की उपस्थिति या अनुपस्थिति में सुसंस्कृत पक्षपाती कोशिकाओं को दाग जोड़ें.
    2. धुंधला के बाद और समय चूक इमेजिंग के माध्यम से कम से कम 15 मिनट में सीधे और तेजी से दाग सेल आबादी को ध्यान से देखें. नहीं अपकेंद्रित्र करो और दाग कोशिकाओं fixe नहीं है.

3. Confocal समय चूक इमेजिंग और सिग्नल विश्लेषण

इस्तेमाल किया प्रणाली एक चार डायोड लेजर इकाइयों और प्रत्येक नमूना के लिए अप करने के लिए चार फ्लोरोसेंट रंगों के लिए एक बहु-दाग छवि से सुसज्जित है. प्रणाली एक ब्याज (600x बढ़ाई) के एक क्षेत्र का निरीक्षण करने के लिए स्थानांतरित कर सकते हैं जिस पर परीक्षण नमूना के एक सिंहावलोकन देता है कि एक मानचित्रण छवि (10x बढ़ाई) प्रदर्शन कर सकते हैं.

  1. समय चूक इमेजिंग
    1. जगहpecimens confocal एकीकृत इनक्यूबेटर के अंधेरे कमरे पर (चैम्बर स्लाइड दाग नमूने युक्त) (37 डिग्री सेल्सियस, सीओ 2 और उमस भरे वातावरण के 5%).
    2. इसी लेसरों का चयन करें. Calcein और EthD -1 उत्तेजित करने के लिए दो लेजर स्रोतों 473 एनएम (15 मेगावाट) और 559 एनएम (18 मेगावाट) का प्रयोग करें.
    3. दो इस्तेमाल प्रतिदीप्ति रंगों के साथ इमेजिंग में crosstalk के बिना लाइन दृश्यों के माध्यम से छवियों को प्राप्त करने के लिए एक दो अनुक्रमिक मोड का प्रयोग करें.
    4. स्वचालित रूप से स्कैनिंग इकाई में प्रतिदीप्ति डाई के अनुसार शर्तों सेट करने के लिए एक नव विकसित स्पेक्ट्रम के साथ एक डिटेक्टर का उपयोग करें.
    5. अधिकतम करने के लिए प्रत्येक चैनल के लिए पता लगाया प्रतिदीप्ति की बैंडविड्थ का अनुकूलन. रिकॉर्ड सभी अधिग्रहण क्रमिक रूप से संभावित पार बात कर से बचने के लिए.
    6. अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का उपयोग फ्लोरोसेंट रंजक चयन के आधार पर सबसे उपयुक्त इमेजिंग शर्तों का चयन करें.
    7. स्वचालित रूप से, एक सर्पिल पैटर्न में केंद्र से बनाया जाता है कि एक नक्शा छवि मोलब्याज के क्षेत्र के साथ आसानी से करीब परीक्षा के लिए चयनित किया जा रहा है.
    8. चयन अवलोकन मोड. समय चूक, z ढेर, और जरूरत के रूप में बहु क्षेत्र सहित अवलोकन मोड के पांच प्रकार अप करने के लिए चुनें. वर्तमान अध्ययन में z ढेर और समय चूक मोड के संयोजन का प्रयोग करें और तेजी से छवि पर कब्जा पूरा,
    9. बदलें और फ्लोरोसेंट रंजक स्विच. वैकल्पिक रूप से, फ्लोरोसेंट और एक दूसरे के साथ प्रकाश विपरीत ओवरले छवियों. बाएं कम मानचित्र स्क्रीन पर चयनित बिंदु का उपयोग कर Live छवि को ध्यान से देखें.
    10. तैयार का उपयोग और कार्यों zooming द्वारा इमेजिंग क्षेत्र का निर्धारण करते हैं. वैकल्पिक रूप से, प्रतिदीप्ति डाई के प्रत्येक प्रकार के लिए प्रदर्शित करता है के बीच स्विच.
      नोट: इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल माइक्रोस्कोप एक कॉम्पैक्ट डिजाइन में एक उच्च पारंपरिक confocal रूप में एक ही कार्यक्षमता है. माइक्रोस्कोप बेहतर एक सरलीकृत में निर्मित इनक्यूबेटर साथ जीवित कोशिकाओं के स्थिर समय चूक इमेजिंग के लिए उपयुक्त हैं जो उल्टे पानी विसर्जन उद्देश्यों के साथ सुसज्जित है.
    11. सिग्नल विश्लेषण और मात्रा का ठहराव
      1. प्रतिदीप्ति संकेत यों इमेजिंग सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें. दोनों का परीक्षण नमूना और सेल नियंत्रण के लिए 10X उद्देश्य के साथ पांच नक्शा छवियों प्राप्त करते हैं.
      2. एक 0.231 माइक्रोन × 0.231 माइक्रोन पिक्सेल आकार के साथ, 1024 × 1024 पिक्सेल नियमित चित्र प्राप्त. संकेत विश्लेषण के लिए ओलिंप छवि प्रारूप (ओआइएफ) के रूप में स्टोर छवियों. इस प्रारूप एक साथ विभिन्न पैरामीटर सेटिंग्स और छवियों के भंडारण के लिए सक्षम बनाता है. अलग विश्लेषण उपकरण (तीव्रता प्रोफाइल की माप, दो इस्तेमाल किया चैनलों के बीच तीव्रता अनुपात) का प्रयोग करें.
      3. 12 बिट / पिक्सेल झगड़ा फ़ाइलों के रूप में अधिक से अधिक प्रक्षेपण छवियों की दुकान.
      4. आर कमांडर सॉफ्टवेयर का उपयोग सांख्यिकीय विश्लेषण पहिले. एक पुनरावृत्ति परीक्षण के साथ विचरण (एनोवा) की एक तरह से विश्लेषण का उपयोग अंतर का विश्लेषण. रिपोर्ट (एसडी ±) के रूप में मतलब मानक विचलन और पी <0.05 पर सांख्यिकीय महत्व यह परिणाम है.

Representative Results

चित्रा 1 नियंत्रण और परीक्षण समग्र अर्क (एल्स अतिरिक्त कम दबाव) के संपर्क में कोशिकाओं दोनों के लिए प्राप्त मानचित्रण छवियों (10X उद्देश्य) में लाइव / मृत दाग कोशिकाओं का अवलोकन से पता चला है. कोशिकाओं के तीन आयामी संरचना बढ़ाई 600x पर देखे जा सकते थे. नियंत्रण कक्ष में और जांच की समग्र निष्कर्षों की उपस्थिति में चैम्बर में एकत्र कोशिकाओं के एकत्र कोशिकाओं के दृश्य चित्रा 2 में प्रस्तुत किया है. अधिक से अधिक प्रक्षेपण (उद्देश्य 60X) समय चूक के शुरू में चयनित सेल आबादी के भाग्य से पता चलता है (15 मिनट पर) और समय व्यतीत अवधि के अंत में (5 घंटा पर). छवियों के पचास सात ढेर (xyzt आधुनिक स्कैन, ढेर प्रति 39 छवियों, voxel गहराई 1.00 मीटर) इस अवधि के दौरान प्राप्त किया गया. लाल फ्लोरोसेंट में एक हरे रंग फ्लोरोसेंट संकेत में मामूली कमी और बहुत मामूली बदलाव उजागर कोशिकाओं में प्राप्त किया गया. कोई महत्वपूर्ण बदलाव के नियंत्रण के लिए मनाया गयाकोशिकाओं. समग्र अर्क उजागर कोशिकाओं कोशिकाओं को नियंत्रित करने के लिए इसी तरह की धुरी आकृति विज्ञान मान लिया; आकृति विज्ञान (हरी झंडी कमी और परीक्षण समग्र की उपस्थिति में लाल संकेत वृद्धि के बावजूद) इन प्रयोगात्मक शर्तों में बदल नहीं था. छवि विश्लेषण हरी और लाल दोनों संकेत के लिए नकारात्मक नियंत्रण कोशिकाओं की तुलना में परीक्षण किया समग्र लिए प्राप्त छवियों से अलग सेल आबादी के लिए इसी पांच चयनित अलग छवि के ढेर पर प्रदर्शन किया गया था. दाग कोशिकाओं की तीव्रता प्रोफाइल चित्रा 3 में सचित्र है; जांच की समग्र के साथ संपर्क में कोशिकाओं की हरी और लाल संकेत विकास नियंत्रण कक्षों की उन लोगों के बराबर था. Calcein और EthD -1 प्रतिदीप्ति उत्सर्जन तीव्रता नियंत्रण कोशिकाओं पर और समग्र उजागर कोशिकाओं पर मापा गया. माप अप करने के लिए पांच घंटे के लिए एक घंटे के अंतराल पर किया गया था. हरे 495-515 एनएम की एकीकृत तीव्रता और लाल 620-650 एनएम संकेतों के आधार पर हरी / लाल प्रतिदीप्ति अनुपात () समय चूक अवधि के दौरान गणना की गई. एल्स अतिरिक्त कम दबाव के अर्क को व्यवहार्यता नियंत्रण के लिए अनुपात और उजागर कोशिकाओं 1 में सक्षम टी में दिखाया गया है. परीक्षण किया मिश्रित की उपस्थिति में, जीवित कोशिकाओं के प्रतिशत के 1 घंटे के बाद 93.9% से 100% से थोड़ा कम पाया गया संपर्क. महत्वपूर्ण अंतर संकेत समय व्यतीत अवधि के 5 घंटा के बाद जांच की समग्र और (किसी भी समग्र अर्क के बिना कोशिकाओं) नकारात्मक नियंत्रण के बीच मनाया गया.

चित्रा 1
चित्रा 1: मानचित्रण छवि का अवलोकन समय व्यतीत अवधि (टी = 15 मिनट) की शुरुआत में समग्र अर्क (एल्स अतिरिक्त कम दबाव) की उपस्थिति में उद्देश्य 10X, (ए) के नियंत्रण कक्षों और (बी) कोशिकाओं में कोशिकाओं दाग दिखाया. ग्रीन क्षेत्रों जीवित कोशिकाओं हैं और लाल क्षेत्रों क्षतिग्रस्त कोशिकाओं रहे हैं. इस मेंप्रयोग की स्थिति, (दोनों हरे और लाल प्रतिदीप्ति के लिए) कोई भिन्नता नकारात्मक नियंत्रण कोशिकाओं की तुलना में कंपोजिट उजागर कोशिकाओं के लिए मनाया गया.

चित्रा 2
चित्रा 2: (ए) के नियंत्रण कक्ष और शुरुआत में (बी) के समग्र अर्क कक्ष और जोखिम समय व्यतीत अवधि के अंत से एक सेल की आबादी का उद्देश्य 60X पर CLSM छवियों (मैं: 15 मिनट और द्वितीय: क्रमशः 5 घंटा, ). ग्रीन क्षेत्रों जीवित कोशिकाओं हैं और लाल क्षेत्रों क्षतिग्रस्त कोशिकाओं रहे हैं. छवियों के पैनल तीव्रता संकेत में मामूली परिवर्तन (हरी झंडी में मामूली कमी और लाल एक में बहुत मामूली वृद्धि) का प्रदर्शन किया. कोई सेल आकारिकी परिवर्तन समग्र निष्कर्षों की उपस्थिति में मनाया गया; नियंत्रण कोशिकाओं के रूप में उनके धुरी के आकार और तंतुप्रसू आकृति विज्ञान बनाए रखा कोशिकाओं को बेनकाब.


चित्रा 3: समय चूक माइक्रोस्कोपी में मनाया कोशिकाओं की लाइन प्रोफाइल 15 मिनट और 5 घंटा में (द्वितीय) में (ए) नियंत्रण कोशिकाओं (बी) कम्पोजिट अर्क उजागर कोशिकाओं, (मैं).. परवाह किए बिना जांच की समग्र की उपस्थिति में हरी झंडी विकास में नहीं दिखाई भिन्नता समय संपर्क. हालांकि, लाल सिग्नल की मामूली वृद्धि संपर्क के 5 घंटे के बाद समग्र की उपस्थिति में मनाया गया.

संपर्क समय (घंटे) सेल व्यवहार्यता (%)
1 2 3 4 5
नियंत्रण कोशिकाओं 100 100 100 </ TD> 100 100
एल्स अतिरिक्त कम दबाव ® 93.9 ± 7 91.3 ± 5 * 89.5 ± 3 * 87.6 ± 2 * 87.7 ± 3 *

तालिका 1:. समग्र निष्कर्षों के साथ सेल व्यवहार्यता संपर्क की 1, 2, 3, 4 और 5 घंटे के बाद लाइव HGF कोशिकाओं के विकास की दर लाइव / मृत cytotoxicity किट का उपयोग कर धुंधला assayed द्वारा किया गया था. पांच छवियों के एसडी विश्लेषण ढेर ± डाटा मतलब मूल्यों दिखा. मान पी <0.05 पर नियंत्रण कोशिकाओं से काफी अलग हैं.

Discussion

Biocompatibility सामग्री व्यवहार चिकित्सा उपयोग करने से पहले मूल्यांकन किया जाना सबसे शर्त पैरामीटर है. अंतर्राष्ट्रीय मानकों चिकित्सा उपकरणों आईएसओ 10993 33 और विशेष रूप से दंत चिकित्सा सामग्री आईएसओ 7405 34 को कवर किया. आसपास की कोशिकाओं को विषाक्त प्रभाव के अभाव में ऐसी सामग्री के biocompatibility के मूल्यांकन में महत्वपूर्ण मानदंड है. 37 - cytotoxicity परीक्षण दंत सामग्री biocompatibility 35 के आकलन में इस तरह के महत्व है यही कारण है कि. आईएसओ परीक्षण तरीकों चयापचय गतिविधि या झिल्ली अखंडता के आधार पर किया जा सकता का सुझाव दिया. चयनित समापन समय और मूल्यांकन assays के लागत को कम करने के क्रम में एक परीक्षण सामग्री द्वारा प्रेरित प्रतिकूल प्रभाव रैंकिंग के लिए विशिष्ट शर्तों का पालन करना चाहिए. जांच की मौजूदा पद्धति (3 डी confocal समय चूक इमेजिंग) आधारित झिल्ली अखंडता है. इस समापन बिंदु के माध्यम से cytotoxicity मूल्यांकन सेल biocompa की एक मूल्यवान मार्कर हो रहा हैजांच की सामग्री और यह है साथ tibility भी आईएसओ समापन बिंदु को मंजूरी दे दी. इन विट्रो परीक्षण एक सामग्री का नमूना एक विशेष सेल प्रकार प्रभावित करता है कि कैसे निर्धारित करने के लिए तैयार कर रहे हैं. वर्णमिति MTT परख मूल रूप में इन विट्रो cytotoxicity और सेल प्रसार की माप के लिए एक उपयोगी विधि के रूप में (1983) Mossman द्वारा वर्णित किया गया था. MTT परीक्षण माइटोकॉन्ड्रियल गतिविधि को निर्धारित करता है जो सक्रिय कोशिकाओं द्वारा formazan क्रिस्टल में tetrazolium नमक का रूपांतरण पर आधारित है. इस व्यवहार्यता दर 38 से अनुवाद किया जा सकता है. गुप्ता और सहयोगियों MTT परीक्षण समग्र रेजिन की cytotoxicity को मापने के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया विधि है कि सूचना दी. Succinic डिहाइड्रोजनेज और alkaline फॉस्फेट प्रतिक्रियाएं भी इसी उद्देश्य से 39 के लिए इस्तेमाल किया गया है. MTT परख प्रत्येक माप समय बिंदु पर कोशिकाओं को मारने की आवश्यकता के बाद से हालांकि, भाग्य कोशिकाओं, पीछा नहीं किया जा सकता. वर्तमान अध्ययन में और अधिक बारीकी से सना हुआ कोशिकाओं के व्यवहार पर नजर रखने के आदेश, Di मेंजीवित कोशिकाओं के रंगरूट अवलोकन, एक छोटी प्रोटोकॉल धुंधला, स्वचालित छवि विश्लेषण और फ्लोरोसेंट संकेत मात्रा का ठहराव के साथ संयुक्त समय व्यतीत CLSM इमेजिंग के लिए धन्यवाद किया गया था.

चिकित्सकीय कंपोजिट मौखिक ऊतकों, विशेष रूप से मसूड़ों और pulpal कोशिकाओं के साथ निकट संपर्क में आते हैं. 41 - fibroblasts इन दृढ कंपोजिट 40 से रिहा घटकों का लक्ष्य होगा. इसके अलावा, कई अध्ययनों अमर कोशिकाओं और प्राथमिक कोशिकाओं biomaterials के साथ संपर्क में विभिन्न सेलुलर प्रतिक्रियाओं हो सकता है कि सूचना दी है. प्राथमिक कोशिकाओं biomaterials के प्रभाव 42 का आकलन करने के लिए अधिक उपयुक्त पाए गए. यह वर्तमान अध्ययन में परीक्षण दंत समग्र cytotoxicity मूल्यांकन के लिए सेल मॉडल के रूप में प्राथमिक मानव मसूड़ों fibroblast कोशिकाओं के उपयोग बताते हैं. 44 - दंत समग्र से जारी पदार्थों की विषाक्तता संभावित व्यापक रूप से 43 अध्ययन किया गया है. टी का आकलन करने के क्रम मेंवह माल के संभावित साइटोटोक्सिक, दो संपर्क मॉडल कोशिकाओं प्रदर्शन किया जा सकता है. अप्रत्यक्ष संपर्क प्रणाली में, कोशिकाओं जैविक मीडिया से elutes के साथ संपर्क में हैं को लक्षित करते हुए सीधे संपर्क मॉडल प्रणाली में सामग्री सीधे लक्ष्य कोशिकाओं के साथ रखा गया है. नैदानिक ​​अनुप्रयोगों में और दृढ प्रक्रियाओं के लिए, समग्र दंत मसूड़ों के ऊतकों के साथ अप्रत्यक्ष संपर्क में रखा जाता है. इस कारण से, वर्तमान प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल (परीक्षण समग्र निष्कर्षों की उपस्थिति में कोशिकाओं) मानव मसूड़ों fibroblasts के साथ अप्रत्यक्ष संपर्क प्रणाली पर ध्यान केंद्रित किया गया. पहले से Dahl और सहयोगियों द्वारा रिपोर्ट, cytotoxicity प्रतिक्रियाओं को गतिविधि रिश्तेदार पर आधारित <(90%), (30% मध्यम (30-60%), मामूली (60-90%) या गैर साइटोटोक्सिक)> गंभीर रूप आंका गया मूल्यों नियंत्रण 45 के लिए प्राप्त की. इसलिए, प्राप्त परिणामों के प्रकाश (1 टेबल) इस रैंकिंग को और अनुसार, समग्र एल्स अतिरिक्त कम दबाव देखें रूप में स्थान दिया जा सकता हैY थोड़ा साइटोटोक्सिक और पूरे समय व्यतीत अवधि के दौरान कोशिकाओं को नियंत्रित करने के लिए तुलनीय व्यवहार दिखाया. ठीक उसी जांच विधि का उपयोग करना, इस अध्ययन के परिणाम एक हाल ही में प्रकाशित एक अध्ययन के उन लोगों की तुलना में किया जा सकता है. एल्स अतिरिक्त कम दबाव समग्र प्रत्यक्ष बहाली 11 है कि एक ही नैदानिक ​​आवेदन के लिए इस्तेमाल दो पहले परीक्षण किया कंपोजिट की तुलना में बेहतर biocompatibility प्रदर्शन किया. आगे के अध्ययन अभी भी अधिक पूरा तुलना की स्थापना के लिए आवश्यक हैं.

एक विशिष्ट समापन बिंदु मूल्यांकन के लिए स्वीकृत करने के लिए जो cytotoxicity परख निर्णय लेने, यह फायदे और प्रत्येक परख की सीमाओं को समझना महत्वपूर्ण है. confocal इमेजिंग का मुख्य उद्देश्य कोशिकाओं और अंगों की एक 3-डी वास्तुकला को प्राप्त है. तकनीक एक नमूना की सतह, बल्कि इसके उपसतह न केवल प्रकट करने में सक्षम है. इस के साथ साथ वर्णित प्रोटोकॉल एक sensi के रूप में, 3 डी CLSM समय व्यतीत confocal इमेजिंग के उपयोग को रेखांकितसक्रिय विधि एक समग्र दंत की इन विट्रो biocompatibility के व्यवहार का आकलन करने के लिए. हालांकि, इस काम में आई सीमाओं से बचने के लिए, विरोधी कंपन कार्यस्थानों अधिक स्थिर और लंबे समय चूक इमेजिंग अनुमति देने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है; टेबलटॉप प्रयोगशाला में कंपन के कारण हो सकता है कि हानिकारक प्रभाव से इस्तेमाल किया confocal प्रणाली को अलग कर सकता है. इसके अलावा, माल आदर्श मसूड़ों के ऊतकों को नुकसान न पहुंचाने होना चाहिए मौखिक गुहा में इस्तेमाल किया जाएगा और प्रणालीगत विषाक्तता का कारण बन सकता है कि कोई पदार्थों को शामिल करना चाहिए. इस्तेमाल किया पद्धति के अनुसार और वर्तमान अध्ययन से प्राप्त परिणामों में यह परीक्षण समग्र (एल्स अतिरिक्त कम दबाव) वर्तमान प्रयोगात्मक शर्तों में साइटोटोक्सिक नहीं है कि यह निष्कर्ष निकाला जा सकता है. CLSM विधि संवेदनशीलता व्यवहार्य कोशिकाओं की प्रारंभिक दर दे सकते हैं, अन्य संभावनाएं अधिक समापन का आकलन करने के लिए सोच हो सकती है. विशेष रूप से, यह हाल ही में रिपोर्ट की गई है के रूप में समग्र मोनोमर्स thr कोशिकाओं को प्रभावित करने वालेough प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) 46 48, आगे की जांच पड़ताल cytotoxicity के बीच किसी भी नेटवर्क और आरओएस उत्पादन संकेत अगर सहसंबंध का आकलन करने की जरूरत है. भविष्य प्रोटोकॉल एक साथ आरओएस उत्पादन का मूल्यांकन करने के लिए (एच 2 ओ 2 और / या ओ 2 - धुंधला) बनाया जा सकता है और समय व्यतीत हो CLSM इमेजिंग का उपयोग cytotoxicity अनुपात (लाइव / मृत धुंधला).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Olympus Fluoview FV10i  Olympus Confocal microscope
O2/CO2 Incubator Pnasonic MCO 5M Cell incubation
Live/Dead Kit Invitrogen  MP 03224 Stain 
ELS extra low shrinkage   Saremco  Dental composite
DMEM medium Sigma D 6046 Culture medium
Trypsin Sigma T1426 harvesting cells
chamber slide system   PAA 14220040X Culture chamber
penicillin/streptomycin  PAA P11-010 Cell culture
Amphotericin B PAA P11-001 Cell culture
Fetal bovine serum  PAA A11-101 Cell culture
Cell Counter Merck Millipore 00110230TP1 Cell counting 

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चिकित्सा अंक 93, दंत कंपोजिट लाइव / Deadstaining 3 डी इमेजिंग confocal माइक्रोस्कोपी समय चूक इमेजिंग
दंत कंपोजिट के Cytocompatibility मूल्यांकन के लिए एक कारगर तरीका के रूप में confocal समय चूक इमेजिंग
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Attik, G. N., Gritsch, K., Colon,… More

Attik, G. N., Gritsch, K., Colon, P., Grosgogeat, B. Confocal Time Lapse Imaging as an Efficient Method for the Cytocompatibility Evaluation of Dental Composites. J. Vis. Exp. (93), e51949, doi:10.3791/51949 (2014).

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