Protocol
두 A. 1. 유생 양육 albopictus 그룹은 성인기
- 두 최적의 휴면 식 (16)에 대해 21 ° C에서 프로그램 조명 광주 캐비닛과 약 80 %의 상대 습도를 설정합니다.
- 16L를위한 프로그램 하나 캐비닛 : 8D 등 : 어두운주기 (비 휴면는 LD의 광주를 유도). 8L의 두 번째 캐비닛을 설정합니다 16D 빛 : 어두운주기 (유도 휴면) 13.
- 모두 캐비닛에 동시에 프로그램 '에 조명'photoperiods 사이의 일주기 시간을 동기화합니다.
- 실험을 수행하는 데 필요한 계란의 금액을 계산한다. 케이지 당 300 ~ 500 달걀을 목표로하고 있습니다. 세 적어도 휴면 케이지를 복제하고 세 비 휴면 케이지가 RNA 생성에 필요한 복제합니다. 이 실험 당 1,800-3,000 계란을시켜 대략 합계.
- 약에 탈 H 2 O의 500 ml에 계란 논문을 잠수하여 해치 계란
- 추가 <EM> 캘리포니아. 지상 개 음식과 소금물 새우로 구성된 1 ml의 음식 슬러리는 이전에 24 설명했다. 메쉬 컨테이너를 커버하고, 고무 밴드와 장소에 메쉬를 유지합니다.
- 약 24 시간 동안 LD의 광주 캐비닛에 넣습니다.
- 전송 부화 유충에 10 × 10 × 2cm 페트리 약 90 ml로 채워진 요리 탈 H 2 O
- 접시 당 약 30 유충을 유지한다. 예를 들어, 매주 월요일, 수요일, 금요일 (MWF) (24) 요리마다 48 ~ 72 시간을 청소하는 유충을 전송합니다.
- 이전으로 탈 이온수에 지상 개 음식과 소금물 새우의 모든 MWF를 구성 피드 약 1 ml의 음식 슬러리 (24)을 설명했다.
- 각 케이지는 생물 복제를 포함하는 각각의 광주 처리를 위해 3-4 성인 케이지를 설정합니다.
- 9.5 L 버킷의 반대편에서 한 10 별 14cm의 구멍을 잘라, 그리고 15cm 직경이 다른 구멍. 공동메쉬와 첫 VER. 정형 스타킹의 약 다리 길이를 절단하고, 다른 구멍의 주위에 내측 일단 접착제.
- 스타킹 오프 매듭 차단의 발 끝을 잘라 - 케이지의 내부에 대한 액세스가 필요한 경우에만 열립니다. 케이지 덮개를 들어, 만 림을 떠나, 내부를 모두 잘라, 메쉬 (24) 내부 플라스틱을 대체합니다.
- 케이지의 측면에 영구 마커 실험에 관련된 번호, 케이지 시작 날짜 및 기타 정보를 복제, 광주를합니다.
- 젖은 종이 필터와 성인 케이지의 하단 라인. 종이 필터 (24)에 산란을 자극 할 수있는, 새장 현지 습도를 증가하지만, 고인 물을 피하기 위해 충분히 탈 H 2 O와 여과지를 적 십니다. 필요한 경우, 건조 매일 다시 젖은 여과지를 확인합니다.
- 적어도 100 명의 여성을 포함, RNA 라이브러리에 대한 충분한 계란을 생산 / 9.5 L의 캘리포니아GE, 케이지 당 500 개 이상의 모기와.
- 더 이상 50 번데기 (25) 당 ML의 H 2 O의 밀도로 깨끗한 H 2 O의 작은 컵에 번데기의 MWF과 장소를 수집 성인 케이지에 번데기 컵을 전송합니다. 각각의 광주 캐비닛에 넣어 케이지 - A. albopictus의 번데기는 15 감광 있습니다.
- 죽은 번데기의 축적 대량 사망을 일으킬 수 있기 때문에, 컵에서 H 2 O는 맑고 깨끗한 있는지 매일 확인하고 죽은 번데기를 제거합니다. 모든 번데기가 등장 O 컵 후 H 2를 제거합니다.
- 등장 성인 설탕을 제공하는 케이지의 상단 메쉬 유기농 건포도를 놓습니다. 건포도를 모니터링하고, 금형 축적을 방지하기 위해 모든 3~5일을 변경합니다.
성인 2. 유지 보수 상대와 계란 생산을 허용하는
- (섹션에 ì을 습윤 여과지로 케이지 바닥을 안감으로 높은 습도 (약. 80 %)에서 케이지를 유지하고, 전술 한 바와 같이, 비 곰팡이가 핀 건포도에 대한 액세스를 제공기능 1.5 및 1.9).
3. 혈액 공급
- 산란은 거의 100 % 휴면 계란 14 시작하기 전에 여성은 적어도 8 모호 짧은 일에 노출되었는지 확인하기 위해 우화 후 2-6일 사이의 혈액 공급 여성을 준비합니다.
- Hemotek 막 먹이 시스템을 준비합니다. 전원 공급 장치에 공급 장치를 연결합니다. 조정 나사를 사용하여 37 ° C에 각 부의 온도를 조절합니다. 교정시 급지 유닛의 온도를 측정하기 위해 전자 온도계 및 프로브를 사용한다.
- 식사 저수지를 준비합니다. 식사 저수지의 구멍을 통해 콜라겐 공급 막의 광장 스트레칭과 O 링으로 고정합니다. 조심스럽게 주름을 제거하기 위해 모서리를 당겨; 가위로 초과 막 트림.
참고 : 콜라겐 멤브레인은 모든 모기 종에 대해 잘 작동하지 않을 수 있습니다, 그리고 작업하는 경우 최적의 멤브레인을 찾기 위해 여러 종류를 시도 할 필요가있다A. 종 이외 albopictus. 파라 필름은 쿨 렉스 pipiens 잘 작동합니다.- 혈액을 사용하기 전에 최소한 1 시간 동안 실온에서 동결, 해동 저장되어있는 경우.
- 멤브레인이 아래를 향하도록 용기를 잡고, 지원되지 않는 및 충전 포트는 최대 직면하고있다. 항응고제로서 시트르산 나트륨을 갖는 닭에서 전혈 약 3 ml로 저장조를 채우기 위해 전송 피펫 또는 주사기를 사용한다. 플라스틱 플러그와 충전 포트를 밀봉합니다.
- 공급 장치 하단의 열 전달 접시에 스터드에 나사를 조이기에 의해 공급에 준비 저수지를 연결합니다. 모기는 케이지의 메쉬를 통해 공급할 수 있도록 공급 전환과 케이지의 위, 아래로 막면에 놓습니다. 공급을 최대화하기 위해 약 45 분 동안 케이지의 공급을 유지합니다.
4. 산란을 자극
- 4 ~ 5 일 컬러 어두운 각 케이지를 장착, 혈액 식사를 게시 50 ㎖의 C표백 종자 발아 용지 (계란 용지) 또는 질감 비 표백 된 종이 타월로 줄 지어 탈 이온수 9 반쯤 채우까지. 250 개 이상의 모기가 케이지에있는 경우, 두 컵을 사용합니다.
참고 : 작은 케이지 또는 단일 여성 병의 경우, 산란 컨테이너에서 "건초 주입은"인해 미생물 식물 (25)의 냄새에 산란을 증가시킬 수있다.
5. 수집 및 저장 계란
- 계란 생산은 일반적으로 다음 주에 걸쳐 진정 후 오일 혈액 공급 후 약 봉우리, 그리고 있기 때문에 혈액 공급 4 ~ 5 일 이내에 달걀 수집을 개시합니다.
- 실험의 필요성에 달걀 수집 주파수를 다양합니다. 일반 목적을 위해, MWF 일정에 계란 서류를 수집합니다. 각 케이지에서 계란 서류를 제거하고 새 용지로 교체합니다. 계란 저장의 혼란 효과를 방지하기 위해 SD의 광주 캐비닛의 배양 접시와 저장소에 최근에 제거 서류를 놓습니다.
- 계란 논문을 다시 허용 계란 건조에 저항 (26)을 증가 장막 표피 형성을 허용하는 후 산란 2 일간 젖은 주.
- 약 48 시간 게시물 수집, 야외에서 건조 계란. 이 논문은 H 2 O에서 어두운 또는 계란의 부화 자극하는 너무 젖은 다리를 저는 터치에 물기가 약간 있지만되도록 용지를 건조.
참고 : 6.5 "× 4"종이 건조하는 데 약 3.5 시간이 걸릴 수 있습니다. 이 계란 건조로 (27)가 발생합니다으로, 끝나지 건조 계란 논문에주의해야합니다. - LD와 SD 두 photoperiods에서 예약 추가 계란 휴면 발생률을 평가하고 (휴면 측정 제 6 장 참조) photoperiodic 효과를 해석합니다.
- 장기 저장을 위해 21 ° C에서 계란 논문을 유지하고 페트리 접시에 약 80 % 습도. 배아 발달는 21 ° C에서 4~5일 사용되기 때문에 지역의 습도를 유지하기 위해 물을 플라스크와 유리 섬유 복합 재질의 저장 용기에서 배양 접시를 유지합니다.
- 추가 예약 배아 휴면 응답을 정량화하기 7-20일 나이 (산란, 4 장을 자극 참조)를 사용합니다.
- 각 계란 종이에있는 계란의 수를 기록한다.
- 완전히 약 80 ml의 탈 H 2 O와 함께 90 ml의 배양 접시에서 개별 계란 논문을 잠수하여 부화 달걀을 자극 약 0.25 ml의 음식 슬러리를 추가합니다.
- 24 시간 후에 부화 첫번째 령 유충의 수를 집계. 애벌레를 시각화하고 접시의 한면에 광원을 배치하는 검은 색 표면에 페트리 접시를 놓습니다. 유충은 각각의 애벌레의 명확한 집계를 허용, 광원으로부터 멀리 이동합니다. 개별 유충을 열거 방지하기 위해 계산하는 동안 피펫 개별 유충을 제거합니다.
- 새로운 배양 접시 및 재 건조에 넣어 달걀 논문입니다. 다시 해치 계란은 다시 1 ~ 일주일 후 위의 방법을 사용하여 부화 달걀을 집계.
- 나머지 U와 장소 달걀 논문 약 80 ml의 표백 액 28 ml의 90 새로운 배양 접시에 달걀을 N-화. 계란 논문이 완전히 표백 용액에 침수되어 있는지 확인하고 표백제 냄새를 방지하기 위해 흄 후드하에 밤새 둡니다.
주 : 표백 용액을 39 ° C에서 1 주간 ~ 저장 될 수 있지만, 그렇지 않은 신선한 이루어져야한다. - 융모막을 취소하고 발육, 취소 부화 달걀의 시각화를 허용 할 표백 광학 현미경을 이용하여 계란을 검사합니다. 난자가 발육 경우, 계란 등의 측면에서 서로 반대 두 개의 작은 검은 점으로 나타나는 눈 오프 화이트 색상이있을 것이다. 해칭되지 않은, 유정란 13의 수를 집계.
- 없음 = %의 휴면 다음 식에 휴면 발생률을 결정합니다. 인간 백신 않은 부화 달걀 / (NO. 부화 달걀 + NO. 인간 백신 않은 부화 계란) (100) (13) X.
계란 / pharate 애벌레 7. RNA 추출
"ontent> 참고 : 층류 후드에서 사용 트리 졸.- 낙타 털 브러시를 사용하여 유리 분쇄기에 달걀 논문에서 별개의 개발 시점에서 개발 배아 또는 pharate 유충을 포함하는 브러시 모기 계란. 완전히 분쇄 될 때까지 트리 졸에서 계란 (조직의 50 ~ 100 mg의 당 1 ml)에 갈기. 충분한 RNA를 생성하는 라이브러리 당 적어도 400 알을 사용합니다.
- 또한, 액체 질소에 동결 계란을 스냅 트리 졸 분쇄하기 전에 한 달까지를위한 마이크로 원심 튜브에서 -80 ° C에 저장됩니다.
- 트리 졸에 RNA 추출을 수행은 제조업체의 지시에 따라 이소프로판올 침전 하였다.
- RNA 저하를 방지하기 위해 잔류 클레아 제를 제거하는 RNase 오염 제거 용액 또는 다른 에이전트와 벤치를 처리합니다.
- DNase의와 추출 된 RNA를 취급합니다. 제조업체의 지시에 따라, 37 ° C에서 30 분 동안의 DNase와 RNA 샘플을 배양한다. 1 #을 사용하여181; 50 μL 반응에서 RNA의 최대 10 μg의에 대한 리터의 DNase. 하나의 반응으로 RNA의 10 μg의가있는 경우의 DNase의 양을 늘립니다.
- 5 μL 현탁 DNase의 불활 화 시약을 첨가하여 DNase의 불활. 잠복기 (부드러운 와동) 중 세 번을 혼합, 실온에서 5 분 품어.
- 1.5 분 동안 10,000 XG에 원심 분리기. 후속 단계에 대한 신선한 튜브로 처리 된 RNA 샘플을 포함하는 상층 액을 전송합니다.
- 형광 측정에 의해 총 RNA 샘플의 품질을 평가. 이 작업에 대한 적절한 장비와 전문 시설로 샘플을 보낼 수 있습니다. 시설은 칩에 주입 형광 색소로 가시화 샘플 RNA 종의 크기를 결정하기 위해 온 - 칩 전기 영동을 수행한다. 결과는 electropherogram로 반환됩니다.
- 프리젠 O를 보면 알 수있는 바와 같이, 존재 또는 분해 생성물의 유무에 의해 총 RNA 샘플들의 무결성을 결정결과 electropherogram (그림 1B)의 18S와 5S 리보솜 RNA의 피크 사이의 F 봉우리.
8. RNA 시퀀싱
- 표준 프로토콜 다음 농축 쌍 엔드 mRNA의 라이브러리와 mRNA의 염기 서열의 건설을위한 상업 시퀀싱 센터에 충분히 높은 품질 (그림 1A)과 양 (라이브러리 당 보통> 3 μg의)와 함께 총 RNA 샘플을 보낼 수 있습니다.
- 둘 이상의 레인 하나를 시퀀싱 실험에 사용되는 경우, 시퀀스 동안 레인 기술 중 변동을 고려하여 시퀀싱 개의 레인으로 개인 라이브러리를 분할.
9. lllumina 읽기 청소
참고 : 그림 2는이 프로토콜의 생물 정보학 부분을 요약 한 것입니다. 이 프로토콜의 생물 정보학 섹션에 사용 된 모든 프로그램과 자료의 전체 목록은 표 1을 참조하십시오.에또한, 보조 파일 (1)는 다음과 같은 생물 정보학 프로토콜의 각 단계의 명령 줄 예제가 들어 있습니다.
- NCBI UniVec 코어 데이터베이스에 95 % 이상의 신원을 식별하기 위해 일치 ssaha2 29 (표 1)을 사용하여 (표 1), A. albopictus rRNA 유전자 서열 (GenBank 등록 번호의 L22060.1), 시퀀싱 어댑터 (보충 파일 1에서 제공하는 상세한 명령 줄 예제). 제공되는 Perl 스크립트 (보충 파일 2)를 적용하여, 예를 들어 펄을 사용하여 일치 또는 유사한 스크립트 도구와 읽기 쌍을 제거합니다.
- 나머지 청소 SolexaQA 패키지 (30)와 읽기 (표 1, 보충 파일 1) : DynamicTrim.pl의 기본 설정을 사용하여 20 미만의 phred 점수 동등한 영역을 트림.
- 제거는 앞으로 모두 LengthSort.pl와보다 짧은 25 BP를 읽고 역을 동시에 읽습니다. FastQC (표 1 fastq 세정 파일의 품질을 평가
10. 디지털 정규화
- K-메르 크기 20, 20의 범위 차단하고, X를 사용 (특히 normalize-by-median.py, (보충 파일 1 표 1) 크메르 도구 (31)를 사용하여 읽어 청소에 디지털 정상화 한 라운드를 수행 = 1E10).
- 높은 RAM을 가진 기계를 사용할 수 (GB를 수백) 인 경우 또는, 삼위 일체의 normalize_by_kmer_coverage.pl 스크립트 (표 1)를 사용합니다.
11. 드 노보 사체 조립
- 어셈블리의 크기에 따라, RAM의 최대 256 기가 24 CPU가있는 컴퓨터 또는 컴퓨터 클러스터에 대한 액세스 권한을 획득 할 수 있습니다.
- 콘티로 설정 디지털 표준화 된 읽기를 조립; 삼위 일체 (32) (보충 파일 1 표 1)를 사용합니다. 줄이기 위해메모리 사용, --min_kmer_cov 2를 사용합니다.
12. 조립 평가
- 삼위 일체 인접 출력에 Assemblathon2 프로젝트 (33)로부터 assemblathon_stats.pl를 실행합니다. (; 기업 파일 1 표 1)이 스크립트는 비계의 개수, N50, 어셈블리 조성물 등과 같은 조립 품질 평가에 관련된 기본적인 계산을 수행한다.
조립 사체 13. 주석
- 기준 집합에 대해 단백질의 조립체 BLASTX (표 1)을 수행; 모기, 초파리,과 아노 펠 레스 gambiae, (Culex pipiens), 큘 및 Aedes aegypti 적합한 참조이다. 특히, BLASTX (보충 파일 1) 다음에 폭발에 대한 기준 단백질 FASTA 파일을 포맷합니다.
(14)지도 RSEM (34)를 사용하여 총회에 읽습니다 (표 1)
- '성적 증명서 - 투 - 유전자지도'파일을 생성하는에첫 번째 열은 참조 유전자 ID 및 두 번째 열에 인접 ID를 포함합니다. 스프레드 편집기에서 BLASTX 출력으로부터 제 1 및 제 2 열을 교환하고,이 .txt 파일에 이러한 열 물품. 유닉스 형식으로 결과 .txt 파일에 줄 바꿈을 변환 할 LINEBREAK 프로그램을 사용하십시오.
- RSEM 패키지 (보조 파일 1)에서 제공하는 rsem-준비 참조 스크립트를 사용하여 사체의 FASTA 파일에서 참조 데이터 집합을 만듭니다.
- RSEM 패키지 (보조 파일 1)에 구비 rsem 계산할 표현식 명령을 이용하여 각각의 라이브러리에 대해 개별적 식 값을 계산한다. 읽을 때, 읽기 세척 단계 (단계 9.2)으로 인한 fastq 쌍 파일을 사용합니다.
- 생체로부터 RNA 복제가 시퀀싱 개의 레인으로 분리 된 경우, 하나의 파일을 생성하는 연산 식 모두 fastq 파일을 포함한다.
- 쉽게 다른 페이지에서 처리 행렬에 각 도서관에서 발현 결과를 변환RSEM 패키지 (보조 파일 1)에 설치된 설치 스크립트 rsem - 생성 - 매트릭스 데이터를 사용 rograms.
15. 차등 발현 분석
- R 및 에저 (표 1)를 설치합니다.
- 단계 14.3 (보충 파일 1)에서 RSEM 결과를로드 할 수 read.delim를 사용합니다. 필요한 경우, 가장 가까운 정수로 반올림 카운트.
참고 : EDGER 가이드는 중요성을 감지 충분히 높은 발현과 유전자 데이터 집합을 제한하는 것이 좋습니다. - EDGER에 대한 데이터 서식을 지정하려면로드 된 데이터 파일 (보충 파일 1)에서 DGEList 객체를 생성합니다. 이어서, TMM 정규화 (보조 파일 1)를 사용하여 데이터를 정상화. 데이터 (보충 파일 1)의 공통 및 tagwise 분산을 추정합니다.
- Benjamini - 호흐 베르크로 발현 된 유전자를 확인하고 p- 값 <0.05 (보충 파일 1) 수정. 풍부한 대 로그 배 변화 (보충 파일 1)의 분포를 그린다.
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Representative Results
두 대표 RNA 샘플의 형광 측정 (그림 1A, B) NT 약 2,000 개의 밴드를 보여 주었다. 곤충, 28S 리보솜 RNA 쉽게 간단한 가열 또는 수소 결합을 방해 35 에이전트 파쇄되어 수소 결합에 의해 함께 유지 개의 폴리 뉴클레오티드 사슬로 구성된다. 생성 된 두 성분은 약 18S 리보솜 RNA와 같은 크기이다. 두 번째 RNA 샘플은 저하 높은 수준의 (그림 1B)를 보여 주었다.
A.의 대표 그룹의 Photoperiodic 치료 반복 실험 중 몇 가지 변화 (표 2)이 있었지만 albopictus 모기, 긴 하루 양육 모기 짧은 - 일 - 양육 모기 높은 휴면 발생률, 낮은 휴면 부각 결과. 예를 들어, SD2 나머지 복제물보다 낮은 (80 %) 휴면 발생률 (- 97.67 % 87.18 %)을 나타내고 복제. 이러한 복제는 또한 작은 SAMPL 있었다 E 크기는 정확한 결과를 얻기 위해서 휴면 따로 측정 달걀 (> 150)의 충분한 수를 설정할 수 있도록 권장한다.
이후 순서는 성인 A.에서 한 대표 라이브러리에 청소 읽기 albopictus의 여성 (83,853,322 52,736,065에 총 대표 한 라이브러리의 읽기에서) 상당한 수의 읽기 제거. 디지털 정상화가 총의 수는 41,435,934 읽 감소. 이들의 삼위 일체 어셈블리는 1879의 N50, 1,023.1의 평균 인접 길이, 20892 (그림 3)의 최대 인접 길이, 76,377 콘티를 생성 읽습니다. 차동 표현은 후 산란 (그림 4)이 두 기간 사이의 3128 발현 된 유전자를 밝혀 11, 21 일째에 휴면 유도 조건에서 자란 배아의 유사한 흐름에서 분석한다.
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도 1 : A.에서 형광 측정 예 고품질 (A)과 낮은 품질의 프로파일 (B)의 RNA 추출 albopictus. X 축은 뉴클레오티드 단편의 크기를 나타내고, y 축은 형광 판독을 나타낸다. 패널 사이에 Y 축 배율 차이 (A) 및 (B)를 참고. 화살표 리보솜 RNA를 상이한의 위치를 표시한다. 녹색 마커 밴드에 가까운 명백한 밴드 저하를 나타냅니다.
그림 2 : 읽기 준비에서 생물 정보학 워크 플로우의 요약 식 차동 각 상자에는 각 프로토콜 단계의 해당 번호를 동반이 프로토콜의 생물 정보학 섹션의 단계를 나타냅니다..
그림 3 :. 히스토그램 트리니티 드 노보 사체 어셈블리에서 인접 길이의 평균 인접 길이는 1,023.1입니다. 인접 길이의 분포가 짧은 콘티쪽으로 많이 기울어합니다; 이 드 노보 사체 어셈블리의 전형이다.
그림 4 : 십일일 대 이십일일 후 산란에서 휴면의 pharate 애벌레의 TMM 정규화 유전자 발현의 풍부한 대 2 -fold 변화 로그의 각 점은 유니젠를 지정;. 발현 된 unigenes 빨간색에 있습니다. 후 산란 십일일에서 높은 표정으로 Unigenes은 여기서 긍정적 인 배 변화 값이높은 표정으로 unigenes로 후 산란 이십일일 부정적인 배 변화 값을 갖는다.
| 프로그램 / 자원 | 웹 사이트 URL (2014년 1월 13일 액세스) |
| 펄 | http://www.perl.org/get.html |
| 파이썬 | http://www.python.org/download/ |
| ssaha2 | http://www.sanger.ac.uk/resources/software/ssaha2/ |
| NCBI UniVec 코어 | ftp://ftp.ncbi.nih.gov/pub/UniVec/UniVec_Core |
| SolexaQA | http://solexaqa.sourceforge.net/ |
| FastQC | http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ |
| 크메르어 | https://github.com/ged-lab/khmer |
| 삼위 일체 | http://trinityrnaseq.sourceforge.net/ |
| 삼위 일체정규화 스크립트 | http://trinityrnaseq.sourceforge.net/trinity_insilico_normalization.html |
| 이 평가 스크립트 Assemblathon | https://github.com/ucdavis-bioinformatics/assemblathon2-analysis |
| (makeblastdb 및 BLASTX 포함) BLAST + | ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/ |
| LINEBREAK | https://code.google.com/p/linebreak/ |
| RSEM | http://deweylab.biostat.wisc.edu/rsem/ |
| 에저 사용 설명서 | http://www.bioconductor.org/packages/2.13/bioc/vignettes/edgeR/inst/doc/edgeRUsersGuide.pdf |
| R | http://www.r-project.org/ |
| EDGER | http://www.bioconductor.org/packages/2.13/bioc/html/edgeR.html |
표 1 : 프로그램 및 자원 t에 사용그는이 프로토콜의 절차를 생물 정보학. URL을 쉽게 프로토콜에 필요한 각각의 자원에 액세스 할 수 나열되어 있습니다.
| 치료 | 복제 | 1 차 해치에서 달걀의 번호 | 2 차 해치에서 달걀 호 | 제 발육, 깐 계란 | %의 휴면 |
| SD | (1) | (10) | 0 | (68) | 87.18 |
| SD | 이 | 3 | 0 | (12) | 80.00 |
| SD | 3 | (1) | 0 | (42) | 97.67 |
| SD | 4 | (5) | 0 | (46) | 90.20 |
| SD | (5) | (6) | 0 | 79 | 92.94 |
| LD | (1) | 79 | 4 | 9 | 9.78 |
| LD | 이 | (28) | 0 | 4 | 12.50 |
| LD | 3 | (92) | (1) | (6) | 6.06 |
| LD | 4 | (30) | 0 | (5) | 14.29 |
| LD | (5) | (43) | 0 | 3 | 6.52 |
표 2 :. 휴면 빈도 계산은 휴면 발생률 계산 광주에 5 회 반복에서 결과. 휴면 발생률을 계산하는 데 필요한 모두 해제 부화, 유정란의 수는 같은 두 개의 별도의 선영에서 부화 된 유충의 숫자가 포함되어 있습니다.
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Discussion
이 프로토콜은 A의 유도 휴면를 photoperiodically로 인해 발현 된 유전자를 발견하는 방법을 제시한다 albopictus. photoperiodic 휴면 응답에 초점을 사람들을 위해 특히 - 프로토콜은 고유 초보 사용자가 액세스 할 수있는 분자 생리학 프로그램의 모든 실험적인 측면을 만들기 위해 모기 양육과 생물 정보학 기술을 결합한다는 점에서 중요하다. 양육 실수를 파악하는 것이 필요 - - 기존의 방법은, 우리의 지식, 양육 프로토콜의 많은 세부 사항을 제공하지 않으며 하류 성공적인 생물 정보학 분석을 가능하게 할 것이다 양육 단계에서 실험 설계에 대한 통찰력을 제공 할 수. 여기에 제시된 방법은 A.에 최적화 된 albopictus, 특히 일반적으로 다음 한 실험실 세대로부터 6 주가 걸릴 양육 방법. 그러나, 미래의 응용 프로그램에서이 방법은 겸손으로 적용 할 수 있습니다photoperiodic 휴면 (23)을 나타내는 다른 모기 종에 대한 조정. 또한, 일반 실험 설계 및 생물 정보학 워크 플로는 다른 polyphenisms의 연구에 적용 할 수있다.
A. 양육 때 프로토콜에 설명하지 몇 가지 점을 고려해야한다 albopictus 애벌레. 첫째, A. 36, 37. 사용 타이어 많은 실험실 식민지를 구축하기위한 애벌레의 일반적인 원인입니다 이전 논문에 기술 된 바와 같이 albopictus은 자연과 인공 컨테이너 서식지의 다양한에서 찾을 수 있습니다. 북미에서 32N의 위도 위에 수집 인구가 강한 휴면 응답 (13)을 전시 할 것으로 예상 할 수있다. A. 이 프로토콜에서 사용 albopictus 균주 매나 싸스, VA로부터 수집하고, 실험 전에 수기 여덟 개 세대 실험실 설정에서 사육 하였다. 둘째, 광주 캐비닛 조명은 신중하게 선택해야합니다. 캐비닛 전구조명이 켜지거나 끌 때 내장 조명 기능 캐비닛 내부의 온도 스파이크가 발생할 수 있습니다. 일화 관찰은 이러한 온도 스파이크가 휴면 응답을 방해 할 수 있습니다 제안합니다. 이를 방지하기 위해, 내장 된 조명 기능을 비활성화해야합니다 및 캐비닛은 4 와트의 냉각 형광 전구를 장착해야합니다. 셋째, 유충은 H 2 O의 품질과 음식 풍부에 민감하다. 따라서, 과잉 공급 세균 축적과 애벌레 사망으로 이어질 수 있습니다. 넷째, 혈액 공급의 성인 여성 모기에 다른 방법이있다. HemoTek 시스템은 저자의 경험에서 잘 수행되지만 유리 막은, 다른 인공 막 시스템 (38), (39)이다. 살아있는 동물 (보통 닭 또는 설치류)도 38을 사용할 수있다 -이 경우에는 먼저 기관 동물 관리와 이용위원회 (IACUC)에서 적절한 인증을 얻기 위해 필수적이다. 다섯째, 명확한 게시 된 증거 일이 없지만계란 15 감광 있습니다에서, 일화 관찰은 산란 후 10 일 이내에 LD의 광주에 노출되었을 때 SD 광주 처리 전시회에서 계란이 약간 휴면 발생률을 감소하는 것이 좋습니다. 따라서, SD 계란에 최대 휴면 응답을 생산하고 계란의 저장 중에 광주 (SD LD 대)의 교란 효과를 방지하기 위해 SD 조건에서 모두 SD 및 LD 계란을 저장합니다.
RNA 높은 품질은 고품질 RNA-SEQ 데이터를 생성하기 위해 필수적이다. 풍부한 케어는 클레아 오염을 방지하기 위해 RNA 추출시주의해야한다. 예컨대도 1b에 도시 된 것과 같은 낮은 품질 RNA 샘플은 시퀀싱에 적합하지 않다. 시퀀싱을 위해 샘플을 보내기 전에 RNA의 품질을 평가하는 것은 필수적이다. RNA 분자의 특징적인 밴드는 고품질의 electropherogram RNA에 도시 18S 이하 등 네 띠로 RNA 추출을 위해 사용되는 곤충 조직의 다른 유형, 볼 수도그림 1A에서. 별개의 생물학적 처리에서 샘플에서 18S에있는 두 개의 밴드가 아닌 RNA 밴드의 일관된 패턴은 수 강력하게이 대역은 분해의 결과지만, 실험 설계에서 선택한 특정 조직 유형의 RNA 분자의 생물학적 구성을 나타내지 않는 것을 나타냅니다.
여기에 설명 된 생물 정보학 워크 플로는 실험 조건을 대비 두에서 복제 RNA 라이브러리에서 생성 Illumina의 시퀀싱 데이터로부터 발현 된 유전자의 목록을 얻으려면 몇 가지 명령 줄 및 스크립팅 기술을 가진 사용자를 할 수 있습니다. 이 예에 의한 광주 차등 유전자 발현에 관한 반면,이 흐름은 유기체, 두 개 이상의 치료 어떤 실험 설계에 적용될 수있다. 발현 된 유전자의 목록에 도착하는 다른 많은 방법이있다; 그러나이 프로토콜은 초보자위한 가장 직접적인 방법이 될 가능성이 높다. 더 예겪게의 생명 정보 학자는 어셈블리의 연속성과 중복성을 개선하기 위해 추가 조치를 취할 수 있습니다. 어떤 생물 정보학 경험이 거의 생물 학자 수있는 무료 그래픽 사용자 인터페이스 중심의 분석 환경입니다 iPlant 40 디스커버리 환경 내에서이 파이프 라인의 또한 완전한 적어도 일부입니다. 그것은 iPlant의 기능은 드 노보 사체 조립체로부터 전체 RNA-SEQ 파이프 라인을 수용하기 위해 향후 크게 증가 할 것으로 예상된다. 마지막으로, 우수한 사용자 가이드는 철저하게 차등 발현 분석을위한 에저 (41) (표 1)를 사용하는 여러 가지 방법에 대해 설명합니다 있습니다.
어떤 경우에는, 잘못 어셈블리는 키메라 콘티를 생성 할 수 있습니다. 예를 들어, Uchime (42)이 잘못 어셈블리를 식별하는 데 도움이 될 수있는 여러 가지 방법이 있습니다. 그러나, 과거의 경험에서 발견 키메라의 수는 상당히 낮은 (<0.1 %)이다; 따라서, employin조지아 키메라 탐지 프로그램은 여분의 노력이 가치가되지 않을 수 있습니다.
높은 처리량을 처리 차세대 시퀀싱 데이터는 하나의 프로젝트,> 500 GB)의 데이터 1) 대용량 저장하는 능력을 필요로한다 (; 2) 기존의 워드 프로세서 나 스프레드 시트 프로그램에서 열 수없는 대용량 데이터 파일을 조작; 3) 드 노보 어셈블리 RAM 등의 대용량을 필요로 분석을 수행; 4) 중 하나, 또는 그래픽 사용자 인터페이스 (와 분석 스위트를 통해 종종이 아닌 사소한 이러한 프로그램을 설치하는 기능을) 필요로하는 명령 줄 인터페이스 (에 의해 구동 프로그램을 통해 대규모 데이터 세트를 분석 예를 들어 갤럭시 (43) 또는 iPlant (40) ). 협력자를 통해, 어느 대학 소유, 또는 자신의 실험실 구입 - 유닉스 명령 행에서 어떤 능력과 스크립트 언어와 연구진은 로컬 컴퓨팅 클러스터에 액세스로부터 가장 혜택을 얻게 될 것이다. 예를 들어, AB비켜 워크 플로는 실험실 소유 매킨토시 (12 코어, 64기가바이트 RAM, 1 테라 바이트 하드 드라이브), 삼위 일체의 조립을위한 대학 소유의 컴퓨터 클러스터를 사용하여 수행되었다. 비슷한 자원을 사용할 수없는 경우, 연구자들은 여전히 인해 그래픽 인터페이스 환경 교육에 상대적으로 낮은 투자와 대규모를 무료로 분석을 수행 할 수 iPlant로 전환하고 있습니다. 그러나, 수행 및 분석을 해석하는 사람들은 여전히 사용되는 각 프로그램의 가정을 이해할 필요가있다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Incubator - Model 818 | Thermo-Scientific | 3751 | 120 V |
| Controlled environment room | Thermax Scientific | N/A | Walk-in controlled environment room built to custom specifications by Thermax Scientific Products. A larger alternative to an incubator. http://thermmax.com/ |
| Cool Fluorescent bulb | Philips | 392183 | 4 W |
| Petri Dish 100 mm x 20 mm | Fisher | 08-772-E | |
| Filter Paper 20.5 cm | Fisher | 09-803-6J | |
| 9.5 L Bucket | Plastican | Bway Products | http://www.bwayproducts.com/sites/portal/plastic-products/plastic-open-head-pails/117 |
| Utility Fabric-Mosquito Netting White | Joann | 10173292 | http://www.joann.com/utility-fabric-mosquito-netting-white/10173292.html |
| Orthopedic stockings | Albahealth | 23650-040 | product no. 081420 |
| Organic Raisins | Newman's Own | UPC: 884284040255 | |
| Oviposition cups (brown) | Fisher Scientific | 03-007-52 | The product is actually an amber 125 ml bottle that we saw the top off of. |
| Recycled Paper Towels | Seventh Generation | 30BPT120 | |
| Modular Mates Square Tupperware Set | Tupperware | http://order.tupperware.com/pls/htprod_www/coe$www.add_items | |
| Glass Grinder | Corning Incorporated | 7727-2 | These Tenbroeck tissue grinders break the eggs and release RNA into the TRI Reagent. |
| TRI Reagent | Sigma Aldrich | T9424 | Apply 1 ml TRI Reagent per 50-100 mg of tissue. Caution — this reagent is toxic. |
| TURBO DNA-free | Ambion/Life Technologies | AM1907 | This kit generates greater yield than traditional DNase treatment followed by phenol/chloroform cleanup, and it is simpler to use. |
| RNaseZap | Ambion/Life Technologies | AM9782 | Apply liberally on the bench surfaces and any equipment that might be in contact with the RNA samples. The solution is slightly alkaline/corrosive, can cause irritation and is harmful when swallowed. |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA | Place up to 12 RNA samples on one chip. |
| Hemotek Membrane Feeder | Hemotek | 5W1 | This system provides 5 feeding stations that can be used simultaneously. Includes PS5 Power Unit and Power cord; 5 FUI Feeders + Meal Reservoirs and O-rings; Plastic Plugs, Hemotek collagen feeding membrane; Temperature setting tool; and Plug extracting tool. The company's mailing address is: Hemotek Ltd; Unit 5 Union Court; Alan Ramsbottom Way; Great Harwood; Lancashire, UK; BB6 7FD; tel: +44 1254 889 307. |
| Digital Thermometer and Probe | Hemotek | MT3KFU | MicroT3 thermometer and KFU probe. This is used to set the temperature of each FUI feeding unit. |
| Chicken Whole Blood, non-sterile with Sodium Citrate | Pel-Freez Biologicals | 33130-1 | The 500 ml of blood were frozen and stored in 20 ml aliquots at -80 °C for up to 1 year. Thaw blood at room temperature for at least 1 hr before using. |
References
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