Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

En experimentell och bioinformatik Protokoll för RNA-seq Analyser av fotoperiodisk diapaus i den asiatiska tigern Mosquito, Published: November 30, 2014 doi: 10.3791/51961

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Larv Uppfödning av Two A. albopictus Grupper till vuxenlivet

  1. Ställ två fotoperioden skåp med programmerbar belysning vid 21 ° C för optimal diapaus uttryck 16 och cirka 80% relativ fuktighet.
    1. Program ett skåp för en 16L: 8D ljus: mörker-cykel (en icke-diapaus inducerande LD fotoperiod). Ställ den andra skåp för en 8L: 16D ljus: mörker-cykel (diapaus framkallande) 13.
    2. Program "lampor på" samtidigt i båda skåpen för att synkronisera dygnsrytm tid mellan fotoperioder.
  2. Beräkna mängden ägg som behövs för att utföra experimentet. Sikta på 300-500 ägg per bur. Minst tre replikera diapaus burar och tre replikera icke diapaus burar behövs för RNA generation. Detta uppgår till ca 1,800-3,000 ägg per försök.
    1. Hatch äggen genom att sänka ned ägg papper i ca 500 ml avjoniserat H2O
    2. Lägg <em> ca. 1 ml mat slurry bestående av mark hundmat och artemia som tidigare beskrivits 24. Täck behållaren med mesh, och hålla nätet på plats med ett gummiband.
    3. Placera i LD fotoperiod skåpet i ca 24 timmar.
  3. Överföring kläckta larverna till 10 x 10 x 2 cm Petri-skålar fyllda med ca 90 ml avjoniserat H2O
    1. Bibehåll ca 30 larver per skål. Överför larver att rengöra rätter varje 48-72 tim, exempelvis varje måndag, onsdag och fredag ​​(MWF) 24.
    2. Feed ca 1 ml livsmedels slurry bestående av mark hundmat och artemia i avjoniserat vatten varje MWF som tidigare beskrivits 24.
  4. Ställ upp 3:57 vuxna burar för varje fotoperiod behandling, där varje bur omfattar en biologisk replikera.
    1. Från motsatta sidor av 9,5 L skopor, skär ut ett 10-för-14 cm hål, och ett annat hål med 15 cm diameter. Cover den första med mesh. Skär approximativt en fots längd av en ortopedisk strumpa, och limma den ena änden runt insidan av det andra hålet.
    2. Skär fotändan av strumpan av och knut avstängning - öppna endast när det krävs tillgång till det inre av buren. För buren locket, klippa ut alla av interiören, vilket innebär att endast kanten, och ersätta den inre plasten med mesh 24.
    3. Notera fotoperiod, replikera nummer, bur startdatum och annan information som är relevant för experimentet med permanent märkpenna på sidan av buren.
  5. Linje botten av de vuxna burar med vått filterpapper. Fukta filterpappret med tillräckligt avjoniserat H2O för att öka den lokala luftfuktigheten i buren, men undvika stående vatten, vilket kan stimulera äggläggning på filterpapper 24. Kontrollera filterpapper dagligen för torkning, åter våt när det behövs.
  6. För att producera tillräckliga ägg för en RNA-bibliotek, omfatta minst 100 kvinnlig / 9,5 L caGE, med högst 500 myggor per bur.
  7. Samla puppor MWF och plats i en liten kopp rent H2O vid en densitet av högst 50 puppor per 25 ml H2O Överför puppor cup till en vuxen bur. Placera burar i respektive fotoperiod skåpet - A. albopictus puppor är ljuskänsliga 15.
  8. Säker dagligen att H2O i koppar är ren och klar, och ta bort döda puppor, eftersom uppbyggnaden av döda puppor kan orsaka massdöd. Ta H2O koppar efter alla puppor fram.
  9. Placera ekologiska russin ovanpå maska ​​i buren för att ge socker för framkommit vuxna. Övervaka russin, och ändra dem var 3-5 dagar för att förhindra mögel ackumulering.

2. Underhåll av vuxna till Tillåt Parning och äggproduktionen

  1. Behåll burar vid hög luftfuktighet (ca. 80%) genom att rada buren botten med en fuktig filterpapper, och ger tillgång till icke-mögliga russin, som beskrivits ovan (avsons 1,5 och 1,9).

3. Blod-matning

  1. Förbered dig på att blod-feed kvinnor mellan 05:58 dagar efter eclosion att säkerställa att kvinnor har utsatts för minst åtta entydiga korta dagar före äggläggning börjar nästan 100% diapaus ägg 14.
  2. Förbered Hemotek Membrane Feeding systemet. Anslut utfodring enheter till strömförsörjningen. Justera temperaturen i varje enhet till 37 ° C med användning av justerskruven. Använd en elektronisk termometer och sond för att mäta temperaturen hos matningsenheten under kalibrering.
  3. Förbereda måltiden behållaren. Sträck en kvadrat av kollagen utfodring membran över öppningen av måltiden behållaren och fäst den med en O-ring. Dra hörnen för att ta bort rynkor försiktigt; klippa av den överflödiga membranet med en sax.
    OBS: Collagen membran kanske inte fungerar bra för alla myggarter, och det kan vara nödvändigt att prova flera typer för att hitta den optimala membranet om att arbeta med enandra än A. arter albopictus. Parafilm fungerar bra med Stickmygga.
    1. Om blod förvaras fryst, tina vid rumstemperatur under åtminstone en timme före användning.
    2. Håll behållaren så membranet är vänd nedåt, inte stöds, och påfyllningsöppningar uppåt. Använd en överföringspipett eller spruta för att fylla behållaren med ca 3 ml helblod från kycklingar som har natriumcitrat som anti-koaguleringsmedel. Täta påfyllnings portar med plastpluggar.
  4. Fäst beredd reservoaren till mataren genom att skruva fast den på stiftet på värmeöverföringsplattan på undersidan av mataren. Vänd matare och placera den på toppen av buren, membransidan nedåt, så att myggor kan mata igenom maskorna i buren. Håll mataren på buren i ca 45 min för att maximera utfodring.

4. Stimulera oviposition

  1. Fyra till fem dagar efter blodmjöl, utrusta varje bur med en mörk färgad 50 ml cupp fodrad med oblekt frögroning papper (ägg papper) eller texturerat icke-blekt pappershandduk och fyll till hälften med avjoniserat vatten 9. Om fler än 250 myggor är i en bur, använd två koppar.
    OBS: För små burar eller enkel kvinnliga flaskor, kan "hö infusion" i äggläggning containrar ökar äggläggning på grund av lukten av den mikrobiella floran 25.

5. Samla och butik Ägg

  1. Påbörja insamling av ägg inom 4-5 dagar av blod utfodring eftersom äggproduktion toppar vanligtvis ungefär fem dagar efter blod utfodring, och sedan avtar under nästa vecka.
  2. Variera insamling av ägg frekvens på nödvändigheter experimentet. För allmänna ändamål, samla ägg papper på en MWF schema. Ta bort ägg papper från varje bur och ersätta med nytt papper. Placera nyligen borttagna papper i petriskålar och lagra i SD fotoperiod skåp för att undvika störande effekter av ägg lagring.
  3. Låt ägg papper att åter huvud våt för två dagar efter oviponering att tillåta serosal ytterhud bildning, vilket ökar ägg uttorkningsmotstånd 26.
  4. Cirka 48 timmar efter insamling, torra ägg i fria luften. Torka pappret så att det är kraftlöst och något fuktig vid beröring, men inte så våt att papperet är mörkt från H2O eller stimulerar kläckning av ägg.
    OBS: En "x 4" papper 6.5 kan ta cirka 3,5 timmar att torka. Var försiktig med att inte över-torr ägg papper, eftersom detta kommer att resultera i ägget uttorkning 27.
  5. Reserve ytterligare ägg från både LD och SD fotoperioder för att bedöma diapaus incidens och tolka fotoperiodisk effekt (se Mätning diapaus, avsnitt 6).
  6. För långtidsförvaring, hålla ägg papper vid 21 ° C och ca 80% luftfuktighet i petriskålar. Håll petriskålar i en Tupperware förvaringsbehållare med en kolv med vatten för att behålla lokal luftfuktighet som embryonal utveckling tar fyra till fem dagar vid 21 ° C.
ove_title "> 6. Mät diapaus Förekomst

  1. Använd ytterligare reserverade embryon (se Stimulera äggläggning, avsnitt 4) som är 7-20 dagar gamla för att kvantifiera diapaus svaret.
  2. Registrera antalet Ägg på varje ägg papper.
  3. Stimulera äggen att kläckas genom att helt sänka ned enskilda ägg papper i en 90 ml petriskål med ca 80 ml ​​avjoniserat H 2 O. Lägg ca 0,25 ml mat slurry.
  4. Efter 24 timmar stämmer antalet kläckta första stadiet larver. Placera petriskål på en svart yta för att visualisera larver och placera en ljuskälla på ena sidan av skålen. Larver kommer att flytta bort från ljuskällan, vilket möjliggör en tydlig sammanställning av individuella larver. Ta bort enskilda larver med en pipett samtidigt räknar att förhindra berätta individuella larver.
  5. Placera ägg papper i en ny petriskål och åter torrt. Re-lucka ägg efter ~ 1 vecka och återigen stämmer ägg kläckta användning av ovanstående metod.
  6. Placera ägg papper med återstående u n-kläckta ägg i nya 90 ml petriskålar med ungefär 80 ml ​​blekningslösning 28. Se till att ägget tidningarna är helt nedsänkt i blekningslösningen och lämna under en huv över natten för att undvika lukt av blekmedel.
    OBS: Blekning lösning kan lagras under ~ 1 vecka vid 4 ° C, men bör i övrigt göras färskt.
  7. Inspektera ägg med hjälp av en ljusmikroskop som blekn rensar chorion och tillåta visualisering av embryone, un-kläckts ägg. Om ägget embryone, kommer ägget att ha en benvit färg med ögonen ser ut som två små svarta prickar mitt emot varandra på ryggsidan. Stämmer antalet icke-streckade, embryone ägg 13.
  8. Bestäm diapaus incidens med följande formel:% diapaus = nej. embryone un-kläckta ägg / (nr. kläckta ägg + nr. embryone un-kläckts ägg) x 100 13.

7. RNA extraktion från ägg / pharate Larver

INNEHÅLL "> OBS: Använd Trizol i ett laminärt flöde huva.

  1. Brush mygga ägg innehåller utvecklings embryon eller pharate larver vid skilda utvecklings tidpunkter från ägg papper till glaskvarnar med en kamel-borste. Slipa äggen i Trizol (1 ml per 50-100 mg vävnad) tills den är helt pulveriseras. Använd minst 400 ägg per biblioteket för att ge tillräcklig RNA.
    1. Alternativt snap frysa ägg i flytande kväve och förvaras vid -80 ° C i mikrocentrifugrör i upp till en månad innan slipning i Trizol.
  2. Utför RNA-extraktion i Trizol följt av isopropanol nederbörd enligt tillverkarens anvisningar.
  3. Behandla bänken med RNas sanering lösning eller andra medel för att ta bort eventuella kvarvarande nukleaser att undvika RNA nedbrytning.
    1. Behandla det extraherade RNA med DNas. Enligt tillverkarens instruktioner, inkubera de RNA-prover med DNas under 30 min vid 37 ° C. Använd 1 & #181; l DNas för upp till 10 mikrogram av RNA i en 50 pl reaktion. Öka mängden DNas om det finns mer än 10 | j, g av RNA i en reaktion.
    2. Inaktivera DNas genom tillsats av 5 pl upphängd DNas inaktive reagens. Inkubera 5 minuter vid rumstemperatur, blanda tre gånger under inkubationsperioden (mild vortexa).
    3. Centrifugera vid 10000 x g under 1,5 min. Överför supernatanten innehållande de behandlade RNA prover till nya rör för efterföljande steg.
  4. Bedöma kvaliteten på de totala RNA-prover från fluorometri. Skicka proverna till en specialitet anläggning med rätt instrument för denna uppgift. Anläggningen kommer att utföra on-chip gelelektrofores för att bestämma storleken på RNA arter i provet, visualiserade genom fluorescerande färgämne ingjutit i chippet. Resultaten kommer att returneras som ett elektroferogram.
    1. Bestämma integriteten av totala RNA-prover genom närvaron eller frånvaron av nedbrytningsprodukter, såsom bevisas genom närvaron of toppar mellan 18S och 5S ribosomala RNA toppar på den resulte electropherogram (Figur 1B).

8. RNA-sekvensering

  1. Skicka totala RNA-prover med tillräckligt hög kvalitet (Figur 1A) och kvantitet (vanligtvis> 3 ug per bibliotek) till ett kommersiellt sekvense centrum för konstruktion av berikade parade-end mRNA bibliotek och mRNA sekvense, följande standardprotokoll.
  2. Om mer än ett körfält används för sekvensering av en enda experiment, dela enskilda biblioteken i två körfält för sekvense att redovisa tekniska variation bland körfält under sekvensering.

9. lllumina Läs Rengöring

OBS: Figur 2 sammanfattar bioinformatik delen av detta protokoll. För en fullständig lista över alla program och resurser som används i avsnittet av detta protokoll bioinformatik, se tabell 1. IDessutom Supple File 1 innehåller kommandoraden exempel för vardera av följande bioinformatik protokollsteg.

  1. Använd ssaha2 29 (tabell 1) för att identifiera matcher 95% identitet eller högre till NCBI UniVec Kärn databas (tabell 1), A. albopictus rRNA-sekvens (GenBank # L22060.1), och sekvenseadaptrar (detaljerad kommandoradsverktyg exempel som i Supple Arkiv 1). Avlägsna lästa par med tändstickor som använder Perl eller liknande skriptverktyg, till exempel genom att anpassa den medföljande Perl-skript (Supple File 2).
  2. Rengör återstående läser med SolexaQA paketet 30 (Tabell 1; Supple File 1): trim regioner med Phred poäng motsvarar mindre än 20 med standardinställningarna för DynamicTrim.pl.
    1. Ta läser kortare än 25 bp med LengthSort.pl både framåt och bakåt läser samtidigt. Utvärdera kvaliteten på de rengjorda fastq filer med FastQC (Tabell 1

10. Digital Normalisering

  1. Utför en omgång av digital normalisering på den rengjorda läser använder khmer verktyget 31 (tabell 1; Supple fil 1), specifikt normalize-by-median.py (med användning av K-mer-storlek 20, en täckning cut-off på 20, och x = 1e10).
  2. Alternativt, om en maskin med hög RAM är tillgängliga (hundratals GBs), använd Trinity s normalize_by_kmer_coverage.pl manus (tabell 1).

11. De Novo transkriptom Assembly

  1. Få tillgång till en dator eller datorkluster med upp till 256 GB RAM och 24 processorer, beroende på storleken av enheten.
  2. Använd Trinity 32 (Tabell 1; Supple Arkiv 1) för att montera den digitalt normaliserade lästa satt i contigs. För att minskaminnesanvändning, använd --min_kmer_cov 2.

12. Assembly Utvärdering

  1. Kör assemblathon_stats.pl från Assemblathon2 projektet 33 på treenigheten contig utgången. Detta skript utför enklare beräkningar som är relevanta för att utvärdera monteringskvaliteten, såsom antal ställningar, N50, montering sammansättning, och mer (Tabell 1; Supple Arkiv 1).

13. Notering av den sammansatta transkriptom

  1. Utför BLASTX (tabell 1) av aggregatet mot en referensproteinuppsättning; för myggor, Drosophila melanogaster, Anopheles gambiae, Stickmygga, och Aedes aegypti är lämpliga referenser. Specifikt formatera referensproteinet FASTA fil för blast, följt av BLASTX (Supple File 1).

14. Kart Läser till församlingen Använda RSEM 34 (tabell 1)

  1. Skapa en fil "transkript-till-gen-kartan", därförsta kolumnen innehåller referens gen-ID, och den andra kolumnen contig-ID. I ett kalkylblad redaktör, byta den första och andra kolumner från BLASTX utgång, och skriver dessa kolumner till en .txt-fil. Använd radbrytning programmet för att konvertera radbrytningar i den resulte txt-fil till Unix-format.
  2. Skapa en referens dataset från transkriptom FASTA filen med rsem-förbereda-referens manus, förutsatt i RSEM paketet (Supple File 1).
  3. Beräkna uttrycksvärden separat för varje bibliotek använder rsem-calculate-uttrycks kommandot, förutsatt i RSEM paketet (Supple File 1). Som läser, använd de parade fastq filerna till följd av läs-rengöringssteget (steg 9,2).
    1. Om RNA från en biologisk replikera delades upp i två körfält för sekvense, inkluderar både fastq filer i räkneuttrycket att generera en enda fil.
  4. Konvertera expressionsresultat från varje bibliotek till en matris lätt bearbetas av andra programs med den medföljande skriptet rsem-generera-datamatris, förutsatt i RSEM paketet (Supple File 1).

15. Differential Expression Analysis

  1. Installera R och kantverk (tabell 1).
  2. Använd read.delim att ladda RSEM resultaten från steg 14,3 (Supple File 1). Om det behövs, runda räkningarna till närmaste heltal.
    OBS: Den kantguiden rekommenderar begränsa dataset till gener med tillräckligt hög uttryck för att upptäcka betydelse.
  3. För att formatera data för Edger, generera en DGEList objekt från inlästa datafilen (Supple File 1). Sedan, normalisera data med hjälp av TMM normalisering (Supple File 1). Uppskatta de gemensamma och tagwise dispersioner av data (Supple Arkiv 1).
  4. Identifiera differentiellt uttryckta gener med Benja-Hochberg korrigerade p-värde <0,05 (Supple File 1). Rita fördelningen av log-faldig-förändring kontra överflöd (Supple File 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Fluorometri av två representativa RNA-prover visade två band vid ungefär 2000 nt (Figur 1A, B). Den insekts 28S ribosomalt RNA är sammansatt av två polynukleotidkedjor som hålls samman av vätebindningar, som lätt störs genom kortvarig upphettning eller medel som stör vätebindningar 35. De resulterande två komponenterna är ungefär samma storlek som den 18S ribosomalt RNA. Den andra RNA-prov visade höga nivåer av nedbrytning (Figur 1B).

Fotoperiodisk behandling av en representativ grupp A. albopictus myggor ledde hög diapaus incidens i korta dags uppfödda myggor, och låg diapaus incidens i långdags uppfödda myggor, även om det fanns en viss variation bland replikat (tabell 2). Exempelvis replikerar SD2 visar lägre (80%) diapaus incidens än de återstående replikaten (87,18% - 97,67%). Detta replikat hade också den minsta sampl e storleken, så det rekommenderas att avsätta ett tillräckligt antal ägg (> 150) för diapaus mätning för att få ett korrekt resultat.

Post-sekvense läste städning på en representant bibliotek från vuxen A. albopictus honor bort ett stort antal läser (från 83.853.322 till 52.736.065 totalt läser för en representant bibliotek). Digital normalisering minskas ytterligare antalet totala läser till 41.435.934. En Trinity montering av dessa läsningar genererade 76.377 contigs, med en N50 på 1.879, medel contig längd 1,023.1, och högst contig längd 20.892 (Figur 3). Differentiell uttryckning analyser från en liknande arbetsflöde av embryon odlats under diapaus-inducerande betingelser vid 11 och 21 dagar efter oviponering avslöjade 3128 differentiellt uttryckta gener mellan dessa två tidsperioder (figur 4).

/ftp_upload/51961/51961fig1highres.jpg "width =" 600px "/>

Figur 1: fluorometri profiler av exempelvis hög kvalitet (A) och låg kvalitet (B) RNA extraktioner från A. albopictus. X-axeln representerar storleken på de nukleotidfragment, och y-axeln representerar de fluorescerande avläsningar. Notera skillnaden i y-axelskalan mellan panelerna (A) och (B). Pilarna markerar positionerna för de olika ribosomala RNA. De uppenbara band nära den grön markör bandet indikerar nedbrytning.

Figur 2

Figur 2: Sammanfattning av bioinformatik arbetsflöde från läst förberedelse till differentialuttryck Varje ruta representerar ett steg i avsnitt i detta protokoll bioinformatik, åtföljas av motsvarande antal varje protokoll steg..


Figur 3:. Histogram av contig längder från en Trinity de novo transkriptom församling är den genomsnittliga contig längd 1,023.1. Notera att fördelningen av contig längder är starkt skevt mot kortare contigs; Detta är typiskt för de novo transkriptom montering.

Figur 4
Figur 4: Log 2-faldigt-förändring kontra överflöd av TMM-normaliserade genuttrycket av diapaus pharate larver vid 11 dagar jämfört med 21 dagar efter oviponering Varje punkt betecknar en Unigene;. differentiellt uttryckta unigenes är i rött. Unigenes med högre uttryck på 11 dagar efter äggläggning ha positiva utfällbar ändra värden, därsom unigenes med högre uttryck 21 dagar efter äggläggning har negativa utfällbar ändra värden.

Program / ​​Resurs Webbadress (nås 2014/01/13)
perl http://www.perl.org/get.html
python http://www.python.org/download/
ssaha2 http://www.sanger.ac.uk/resources/software/ssaha2/
NCBI UniVec Kärna ftp://ftp.ncbi.nih.gov/pub/UniVec/UniVec_Core
SolexaQA http://solexaqa.sourceforge.net/
FastQC http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/
khmer https://github.com/ged-lab/khmer
Trinity http://trinityrnaseq.sourceforge.net/
Trinitynormalisering skript http://trinityrnaseq.sourceforge.net/trinity_insilico_normalization.html
Assemblathon 2 skript utvärderings https://github.com/ucdavis-bioinformatics/assemblathon2-analysis
BLAST + (som inkluderar makeblastdb och BLASTX) ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/
radbrytning https://code.google.com/p/linebreak/
RSEM http://deweylab.biostat.wisc.edu/rsem/
Edger Användarhandbok http://www.bioconductor.org/packages/2.13/bioc/vignettes/edgeR/inst/doc/edgeRUsersGuide.pdf
R http://www.r-project.org/
Kantskärare http://www.bioconductor.org/packages/2.13/bioc/html/edgeR.html

Tabell 1: Program och resurser som används för tHan bioinformatik procedurerna i det här protokollet. webbadresser finns för att enkelt komma åt var och en av de resurser som krävs i detta protokoll.

Behandling Replikera Antal ägg från 1: a luckan Antal ägg från 2: a lucka No. embryone, okläckta ägg % Diapaus
SD 1 10 0 68 87,18
SD 2 3 0 12 80,00
SD 3 1 0 42 97,67
SD 4 5 0 46 90,20
SD 5 6 0 79 92,94
LD 1 79 4 9 9,78
LD 2 28 0 4 12,50
LD 3 92 1 6 6,06
LD 4 30 0 5 14.29
LD 5 43 0 3 6,52

Tabell 2:. Diapaus incidensberäkningar Resultat från fem replikat per fotoperiod av diapaus incidensberäkningar. Antalet kläckta larver från två separata kläckningar ingår, liksom antalet icke-streckade, embryone ägg, som alla är nödvändiga för att beräkna diapaus incidens.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Detta protokoll utgör metoder för att upptäcka differentiellt uttryckta gener pga photoperiodically inducerad diapaus i A. albopictus. Protokollet är betydande i att den unikt sätt kombinerar mygga uppfödning och bioinformatiska metoder för att göra alla experimentella aspekter av en molekylär fysiologi program tillgängligt för nybörjare - i synnerhet för dem som fokuserar på fotoperiodisk diapaus svaret. Befintliga metoder, till vår kunskap, inte ger så mycket detaljer i uppfödningsprotokollet - vilket ofta är nödvändigt för att identifiera uppfödnings misstag - inte heller ge insikt om experimentell design under uppfödningen stadium som gör det möjligt för framgångsrika bioinformatik analys nedströms. Metoderna som presenteras här har optimerats för A. albopictus, speciellt uppfödningsmetoder, som i allmänhet tar sex veckor från en laboratorie generation till nästa. Men i framtida tillämpningar denna metod skulle kunna anpassas med blygjusteringar andra myggarter som uppvisar fotoperiodisk diapaus 23. Vidare allmänna experimentell design och bioinformatik arbetsflöde är tillämpliga på studiet av andra polyphenisms.

Flera punkter inte anges i protokollet bör beaktas vid uppfödning A. albopictus larver. Först, A. albopictus kan hittas i en mängd olika naturliga och konstgjorda containerlivsmiljöer som beskrivs i tidigare tidningar 36, 37. Begagnade massor däck är en vanlig källa till larver för fastställande av laboratoriekolonier. Populationer som samlats ovanför 32N latitud i Nordamerika kan förväntas uppvisa en stark diapaus svar 13. Den A. albopictus stam som används i detta protokoll har samlats in från Manassas, VA, och växte upp i en laboratoriemiljö under mer än åtta generationer före experimentell manipulation. För det andra bör belysning i fotoperioden skåp väljas med omsorg. Lökar i skåpmed inbyggda ljusfunktioner kan orsaka temperaturtoppar inom skåpet när belysningen slås på eller av. Anekdotiska observation tyder dessa temperaturtoppar kan störa diapaus svaret. För att förhindra detta, inbyggda ljusfunktioner bör inaktiveras och skåp bör vara utrustad med en 4-watts cool-lysrör. Tredje, larver är känsliga för H2O kvalitet och mat överflöd. Därför kan övermatning leda till bakteriell ackumulation och larvdödligheten. För det fjärde finns det alternativa metoder till blod-feed vuxna kvinnliga myggor. Glas membran är ett alternativt artificiellt membransystem 38, 39, även om HemoTek systemet presterar bättre i författarnas erfarenhet. Levande djur (vanligen kyckling eller gnagare) kan även användas 38 - i det här fallet, är det viktigt att först få lämplig certifiering från din Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC). Femte, även om det inte finns någon tydlig publicerade bevis thpå ägg är ljuskänsliga 15, anekdotiska observationer tyder på att ägg från ett SD fotoperiod behandling uppvisar minskad diapaus incidensen något när de utsätts för en LD fotoperiod inom 10 dagar efter äggläggning. Således lagra både SD och LD ägg enligt SD förhållanden för att producera en maximal diapaus svar i SD ägg och undvika feltolkning på grund av fotoperiod (SD vs LD) under ägget lagring.

Hög RNA kvalitet är avgörande för att skapa högkvalitativa RNA-Seq uppgifter. Rikligt försiktighet bör iakttas under RNA-extraktion för att undvika kontaminering nukleas. Låg kvalitet RNA-prover, såsom den som visas i figur 1B, är inte lämpliga för sekvensering. Att bedöma RNA kvalitet innan du skickar proverna för sekvense är absolut nödvändigt. Karakteristiska band av RNA-molekyler kan vara synlig för olika insekts vävnad användes för RNA-extraktion, såsom de fyra banden mindre än 18S visas i högkvalitativt RNA elektroferogrami figur 1A. Konsekvent mönster av andra än de två banden på 18S över prover enligt distinkta biologiska behandlingar RNA band indikerar kan starkt att dessa band inte resulterar från nedbrytning, men representerar biologisk sammansättning av RNA-molekyler i de specifika vävnadstyper som valts i experimentell design.

Den bioinformatik arbetsflöde som beskrivs här kan en användare med vissa kommandoraden och skriptkunskaper för att få en lista med differentiellt uttryckta gener från Illumina sekvense data som genereras från replike bibliotek RNA från två kontrasterande experimentella betingelser. Även om detta exempel gäller gener differentiellt uttryckta på grund av fotoperiod, kan detta arbetsflöde tillämpas på alla experimentell design med två eller flera behandlingar, i en organism. Det finns många andra sätt att komma fram till en lista med differentiellt uttryckta gener; dock sannolikt att vara den mest direkta tillvägagångssättet för den ovana användaren detta protokoll. Mer experienced bioinformatiker kanske vill vidta extra åtgärder för att förbättra kontiguiteten och redundans i deras församling. Biologer med liten eller ingen bioinformatik erfarenhet kan också fylla åtminstone en del av denna pipeline inom iPlant 40 Discovery miljö, som är en fri grafisk-användargränssnitt driven analys miljö. Det är troligt att iPlant funktionalitet kommer att växa större i framtiden för att rymma hela RNA-Seq pipelines från de novo transkriptom församlingar. Slutligen, notera att den utmärkta bruksanvisningen diskuterar grundligt många sätt att använda Edger 41 (tabell 1) för differentiell uttrycksanalys.

I vissa fall kan mis heter generera chimära contigs. Det finns flera metoder som kan hjälpa till att identifiera dessa mis heter, till exempel, Uchime 42. Men från tidigare erfarenheter, är antalet upptäckta chimärer ytterst låg (<0,1%); därför employinga chimär upptäckt programmet kanske inte är värt det extra besväret.

Bearbetning med hög genomströmning, kräver nästa generations sekvense uppgifter förmågan att 1) ​​lagra stora mängder data (för samma projekt,> 500 Gb); 2) manipulera stora datafiler som inte kan öppnas i traditionella ordbehandlare eller kalkylprogram; 3) utför analyser som kräver stora mängder RAM, t.ex. för de novo montering; och 4) analysera stora datamängder, antingen genom program som drivs av en kommandoradsgränssnitt (vilket kräver förmåga att installera dessa program, som ofta är icke-trivial), eller genom analys sviter med grafiska användargränssnitt (t.ex. Galaxy 43 eller iPlant 40 ). Forskare med viss färdighet i Unix kommandoraden och ett skriptspråk kommer att få mest nytta av tillgång till en lokal datorkluster - antingen University ägda, via en kollaboratör, eller köpt för eget laboratorium. Till exempel above arbetsflöde fördes med hjälp av en laboratorie ägda Macintosh (12 kärnor, 64 GB RAM, 1 Tb hårddisk), och ett universitet ägd datorkluster för Trinity montering. Om liknande resurser inte finns tillgängliga, kan forskarna fortfarande vända sig till iPlant att utföra storskaliga analyser utan kostnad, och med relativt sett lägre investeringar i utbildning på grund av det grafiska gränssnittet miljön. Men de som utför och tolka analyserna fortfarande måste förstå de antaganden för varje program som används.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Incubator - Model 818 Thermo-Scientific 3751 120 V
Controlled environment room Thermax Scientific N/A Walk-in controlled environment room built to custom specifications by Thermax Scientific Products. A larger alternative to an incubator. http://thermmax.com/
Cool Fluorescent bulb Philips 392183 4 W
Petri Dish 100 mm x 20 mm Fisher 08-772-E
Filter Paper 20.5 cm Fisher 09-803-6J
9.5 L Bucket Plastican Bway Products http://www.bwayproducts.com/sites/portal/plastic-products/plastic-open-head-pails/117
Utility Fabric-Mosquito Netting White Joann 10173292 http://www.joann.com/utility-fabric-mosquito-netting-white/10173292.html
Orthopedic stockings Albahealth 23650-040 product no. 081420
Organic Raisins Newman's Own UPC: 884284040255
Oviposition cups (brown) Fisher Scientific 03-007-52 The product is actually an amber 125 ml bottle that we saw the top off of.
Recycled Paper Towels Seventh Generation 30BPT120
Modular Mates Square Tupperware Set Tupperware http://order.tupperware.com/pls/htprod_www/coe$www.add_items
Glass Grinder Corning Incorporated 7727-2 These Tenbroeck tissue grinders break the eggs and release RNA into the TRI Reagent.
TRI Reagent Sigma Aldrich T9424 Apply 1 ml TRI Reagent per 50-100 mg of tissue. Caution — this reagent is toxic.
TURBO DNA-free Ambion/Life Technologies AM1907 This kit generates greater yield than traditional DNase treatment followed by phenol/chloroform cleanup, and it is simpler to use.
RNaseZap Ambion/Life Technologies AM9782 Apply liberally on the bench surfaces and any equipment that might be in contact with the RNA samples. The solution is slightly alkaline/corrosive, can cause irritation and is harmful when swallowed.
2100 Bioanalyzer Agilent Technologies G2939AA Place up to 12 RNA samples on one chip.
Hemotek Membrane Feeder Hemotek  5W1 This system  provides 5 feeding stations that can be used simultaneously. Includes PS5 Power Unit and Power cord; 5 FUI Feeders + Meal Reservoirs and O-rings; Plastic Plugs, Hemotek collagen feeding membrane; Temperature setting tool; and Plug extracting tool. The company's mailing address is: Hemotek Ltd; Unit 5 Union Court; Alan Ramsbottom Way; Great Harwood; Lancashire, UK; BB6 7FD; tel: +44 1254 889 307.
Digital Thermometer and Probe Hemotek  MT3KFU MicroT3 thermometer and KFU probe. This is used to set the temperature of each FUI feeding unit.
Chicken Whole Blood, non-sterile with Sodium Citrate Pel-Freez Biologicals 33130-1 The 500 ml of blood were frozen and stored in 20 ml aliquots at -80 °C for up to 1 year. Thaw blood at room temperature for at least 1 hr before using.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bilyk, K. T., Cheng, C. H. C. Model of gene expression in extreme cold - reference transcriptome for the high-Antarctic cryopelagic notothenioid fish Pagothenia borchgrevinki. BMC Genomics. 14, 634 (2013).
  2. Chapman, M. A., Hiscock, S. J., Filatov, D. A. Genomic divergence during speciation driven by adaptation to altitude. Mol. Biol. Evol. 30, 2553-2567 (2013).
  3. Schwarz, D., et al. Sympatric ecological speciation meets pyrosequencing: sampling the transcriptome of the apple maggot Rhagoletis pomonella. BMC Genomics. 10, 633 (2009).
  4. Barshis, D. J., et al. Genomic basis for coral resilience to climate change. P. Natl Acad. Sci. USA. 110, 1387-1392 (2013).
  5. Urbanski, J. M., Aruda, A., Armbruster, P. A. A transcriptional element of the diapause program in the Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, identified by suppressive subtractive hybridization. J. Insect Physiol. 56, 1147-1154 (2010).
  6. Huang, Y. H., et al. The duck genome and transcriptome provide insight into an avian influenza virus reservoir species. Nat. Genet. 45, 776-783 (2013).
  7. Sessions, O. M., et al. Host cell transcriptome profile during wild-type and attenuated dengue virus infection. PLoS Negl. Trop. Dis. 7, (3), 2107 (2013).
  8. Poelchau, M. F., Reynolds, J. A., Elsik, C. G., Denlinger, D. L., Armbruster, P. A. Deep sequencing reveals complex mechanisms of diapause preparation in the invasive mosquito, Aedes albopictus. P. R. Soc B. 280, (2013).
  9. Poelchau, M. F., Reynolds, J. A., Elsik, C. G., Denlinger, D. L., Armbruster, P. A. Transcriptome sequencing as a platform to elucidate molecular components of the diapause response in Aedes albopictus. Physiol. Entomol. 38, 173-181 (2013).
  10. Poelchau, M. F., Reynolds, J. A., Denlinger, D. L., Elsik, C. G., Armbruster, P. A. A de novo transcriptome of the Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, to identify candidate transcripts for diapause preparation. BMC Genomics. 12, 619 (2011).
  11. Benedict, M. Q., Levine, R. S., Hawley, W. A., Lounibos, L. P. Spread of the tiger: Global risk of invasion by the mosquito Aedes albopictus. Vector-Borne Zoonot. 7, 76-85 (2007).
  12. Lounibos, L. P. Invasions by insect vectors of human disease. Annu. Rev. Entomol. 47, 233-266 (2002).
  13. Urbanski, J. M., et al. Rapid adaptive evolution of photoperiodic response during invasion and range expansion across a climatic gradient. Am. Nat. 179, 490-500 (2012).
  14. Lounibos, L. P., Escher, R. L., Lourenco-de-Oliveria, R. Asymmetric evolution of photoperiodic diapause in temperate and tropical invasive populations of Aedes albopictus (Diptera Culicidae). Ann. Entomol. Soc. Am. 96, 512-518 (2003).
  15. Mori, A., Oda, T., Wada, Y. Studies on the egg diapause and overwintering of Aedes albopictus in Nagasaki. Trop. Med. 23, 79-90 (1981).
  16. Pumpuni, C. B. Factors influencing photoperiodic control of egg diapause in Aedes albopictus [dissertation]. (1989).
  17. Wang, R. L. Observations on the influence of photoperiod on egg diapause in Aedes albopictus Skuse. Acta Entomol. Sinica. 15, 75-77 (1966).
  18. Sota, T., Mogi, M. Survival-time and resistance to desiccation of diapause and non-diapause eggs of temperate Aedes (Stegomyia) mosquitoes. Entomol. Exp. Appl. 63, 155-161 (1992).
  19. Reynolds, J. A., Poelchau, M. F., Rahman, Z., Armbruster, P. A., Denlinger, D. L. Transcript profiling reveals mechanisms for lipid conservation during diapause in the mosquito, Aedes albopictus. J. Insect Physiol. 58, 966-973 (2012).
  20. Andrewartha, H. G. Diapause in relation to the ecology of insects. Biol. Rev. 27, 50-107 (1952).
  21. Danks, H. V. Insect Dormancy: An Ecological Perspective. Biological Survey of Canada (Terrestrial Arthropods). Ottowa, Canada. (1987).
  22. Denlinger, D. L. Regulation of diapause. Ann. Rev. Entomol. 47, 93-122 (2002).
  23. Rev Entomol, A. nn 59, 93-122 (2014).
  24. Armbruster, P. A., Conn, J. E. Geographic variation of larval growth in North American Aedes albopictus (Diptera). Culicidae). Ann. Entomol. Soc. Am. 99, 1234-1243 (2006).
  25. Reiter, P., Amador, M. A., Colon, N. Enhancement of the CDC ovitrap with hay infusions for daily monitoring of Aedes aegypti populations. J. Am. Mosquito Contr. Association. 7, (1), 52 (1991).
  26. Rezende, G. L., et al. Embryonic desiccation resistance in Aedes aegypti: presumptive role of the chitinized serosal cuticle. BMC Dev. Biol. 8, 182 (2008).
  27. Munstermann, L. Care and maintenance of Aedes mosquito colonies. The Molecular Biology of Insect Disease Vectors. Crampton, J., Beard, C., C, L. ouis Springer. Netherlands. 13-20 (1997).
  28. Trpis, M. A new bleaching and decalcifying method for general use in zoology. Can. J. Zoolog. 48, 892-893 (1970).
  29. Ning, Z. M., Cox, A. J., Mullikin, J. C. SSAHA: A fast search method for large DNA databases. Genome Res. 11, (10), 1725-1729 (2001).
  30. Cox, M. P., Peterson, D. A., Biggs, P. J. SolexaQA: At-a-glance quality assessment of Illumina second-generation sequencing data. BMC Bioinformatics. 11, 485 (2010).
  31. Brown, C. T., Howe, A., Zhang, Q., Pyrkosz, A. B., Brom, T. H. A reference-free algorithm for computational normalization of shotgun sequencing data [Internet]. Available at: http://arxiv.org/abs/1203.4802 (2012).
  32. Grabherr, M. G., et al. Full-length transcriptome assembly from RNA-Seq data without a reference genome. Nat. Biotechnol. 29, (7), 644-652 (2011).
  33. Bradnam, K. R., et al. Assemblathon 2: evaluating de novo methods of genome assembly in three vertebrate species. GigaScience. 2, 10 (2013).
  34. Li, B., Dewey, C. RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome. BMC Bioinformatics. 12, 323 (2011).
  35. White, B. N., De Lucca, F. L. Preparation and analysis of RNA. Analytical Biochemistry of Insects. Turner, R. B. Elsevier Scientific Publishing Company. Philadelphia, PA. (1977).
  36. Hawley, W. A. The biology of Aedes albopictus. J. Am. Mosq. Contr. Assoc. 4, 1-39 (1988).
  37. Dowling, Z., Ladeau, S. L., Armbruster, P., Biehler, D., Leisnham, P. T. Socioeconomic status affect mosquito (Diptera:Culicidae) larval habitat type availability and infestation level. J. Med Entomol. 50, 764-772 (2013).
  38. Benedict, M. Q. Chapter 2,4,10. Bloodfeeding: Membrane apparatuses and animals. Methods in Anopheles Research. Malaria Research and Reference Reagent Resource Center(MR4). (2010).
  39. Das, S., Garver, S., Ramirez, J. R., Xi, Z., Dimopolous, G. Protocol for dengue infections in mosquitoes (A. aegypti) and infection phenotype determination. J. Vis. Exp. 5, (220), (2007).
  40. Goff, S. A., et al. The iPlant collaborative: cyberinfrastructure for plant biology. Plant Sci. 2, (34), (2011).
  41. Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26, 139-140 (2010).
  42. Edgar, R. C., Haas, B. J., Clemente, J. C., Quince, C., Knight, R. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection. Bioinformatics. 27, (16), 2194-2220 (2011).
  43. Goecks, J., et al. Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences. Genome Biol. 11, (8), 86 (2010).
En experimentell och bioinformatik Protokoll för RNA-seq Analyser av fotoperiodisk diapaus i den asiatiska tigern Mosquito,<em&gt; Asiatisk tigermygga</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Poelchau, M. F., Huang, X., Goff, A., Reynolds, J., Armbruster, P. An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus. J. Vis. Exp. (93), e51961, doi:10.3791/51961 (2014).More

Poelchau, M. F., Huang, X., Goff, A., Reynolds, J., Armbruster, P. An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus. J. Vis. Exp. (93), e51961, doi:10.3791/51961 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter