Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

एशियाई टाइगर मच्छर में Photoperiodic diapause की शाही सेना seq के विश्लेषण के लिए एक प्रयोगात्मक और जैव सूचना विज्ञान प्रोटोकॉल, Published: November 30, 2014 doi: 10.3791/51961
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Department of Biology, Georgetown University, 2Insect Physiology Lab, EEOB, The Ohio State University

Protocol

दो ए के 1. लारवल पालन albopictus समूह वयस्कता के लिए

  1. दो इष्टतम diapause अभिव्यक्ति 16 के लिए 21 डिग्री सेल्सियस पर से प्रोग्राम प्रकाश व्यवस्था के साथ photoperiod अलमारियाँ और लगभग 80% सापेक्ष आर्द्रता सेट करें।
    1. एक 16L के लिए कार्यक्रम एक कैबिनेट: 8D प्रकाश: अंधेरे चक्र (एक गैर-diapause एलडी photoperiod उत्प्रेरण)। एक 8L के लिए दूसरा कैबिनेट सेट करें: 16D प्रकाश: अंधेरे चक्र (उत्प्रेरण diapause) 13।
    2. दोनों मंत्रिमंडल में एक ही समय में प्रोग्राम 'पर रोशनी' photoperiods के बीच circadian समय सिंक्रनाइज़ करने के लिए।
  2. प्रयोग करने की जरूरत अंडे की मात्रा की गणना। पिंजरे प्रति 300-500 अंडे के लिए निशाना लगाओ। तीन कम से कम diapause पिंजरों को दोहराने और तीन गैर diapause पिंजरों शाही सेना पीढ़ी के लिए आवश्यक हैं दोहराने। इस प्रयोग को प्रति 1,800-3,000 अंडे सीए करने के लिए योग।
    1. सीए में विआयनीकृत एच 2 ओ की 500 मिलीलीटर अंडा कागजात जलमग्न द्वारा हैच अंडे
    2. जोड़ें <उन्हें> सीए। जमीन कुत्ते के भोजन और नमकीन चिंराट से मिलकर 1 मिलीलीटर खाद्य घोल के रूप में पहले 24 में वर्णित है। जाल के साथ कंटेनर कवर, और एक रबर बैंड के साथ जगह में जाल रखना।
    3. सीए 24 घंटा के लिए एलडी photoperiod कैबिनेट में रखें।
  3. स्थानांतरण रची लार्वा के लिए 10 एक्स 10 एक्स 2 सेमी पेट्री सीए 90 एमएल के साथ भरा बर्तन विआयनीकृत एच 2 ओ
    1. पकवान प्रति सीए 30 लार्वा बनाए रखें। उदाहरण के लिए, हर सोमवार, बुधवार और शुक्रवार (MWF) 24 व्यंजन हर 48-72 घंटा साफ करने के लिए लार्वा स्थानांतरण।
    2. पहले से ही विआयनीकृत पानी में जमीन कुत्ते के भोजन और नमकीन चिंराट के हर MWF मिलकर फ़ीड सीए 1 मिलीलीटर खाद्य घोल 24 में वर्णित है।
  4. प्रत्येक पिंजरे एक जैविक दोहराने शामिल हैं, जहां प्रत्येक photoperiod उपचार के लिए 3-4 वयस्क पिंजरों सेट करें।
    1. 9.5 एल बाल्टी के विपरीत दिशा से, एक 10-दर-14 सेमी के छेद से बाहर कटौती, और 15 सेमी व्यास के साथ एक और छेद। सहजाल के साथ पहले देखें। एक आर्थोपेडिक मोजा के लगभग एक फुट लंबाई में कटौती, और अन्य छेद के अंदर चारों ओर एक छोर गोंद।
    2. मोजा बंद और गाँठ बंद के पैर अंत कट - पिंजरे के इंटीरियर के लिए उपयोग करने की जरूरत है केवल जब खुला। पिंजरे ढकने के लिए, केवल रिम छोड़ने, इंटीरियर के सभी बाहर में कटौती, और मेष 24 के साथ आंतरिक प्लास्टिक की जगह।
    3. पिंजरे के किनारे पर स्थायी मार्कर के साथ प्रयोग करने के लिए प्रासंगिक संख्या, पिंजरे प्रारंभ दिनांक, और अन्य जानकारी को दोहराने, photoperiod ध्यान दें।
  5. गीले फिल्टर पेपर के साथ वयस्क पिंजरों की रेखा के नीचे। फिल्टर पेपर पर 24 oviposition प्रोत्साहित कर सकते हैं, जो पिंजरे में स्थानीय आर्द्रता वृद्धि, लेकिन पानी खड़ा से बचने के लिए पर्याप्त विआयनीकृत एच 2 ओ के साथ फिल्टर पेपर गीला हो जाना। जब आवश्यक हो, सुखाने के लिए दैनिक फिर से गीला फिल्टर पेपर की जाँच करें।
  6. कम से कम 100 महिलाओं में शामिल हैं, एक शाही सेना पुस्तकालय के लिए पर्याप्त अंडे का उत्पादन / 9.5 एल सीएजीई, पिंजरे प्रति कोई 500 से ज्यादा मच्छरों के साथ।
  7. कोई 50 से अधिक pupae 25 प्रति मिलीलीटर एच 2 ओ के घनत्व पर साफ एच 2 ओ के एक छोटे कप में pupae MWF और जगह ले लीजिए एक वयस्क के पिंजरे में pupae कप स्थानांतरण। संबंधित photoperiod कैबिनेट में जगह पिंजरों - ए albopictus pupae 15 सहज हैं।
  8. मृत pupae का निर्माण हुआ बड़े पैमाने पर मृत्यु दर का कारण बन सकती है, क्योंकि कप में एच 2 ओ साफ और स्पष्ट है कि दैनिक सुनिश्चित करने, और मृत pupae को हटा दें। सभी pupae के उभरने हे कप के बाद एच 2 निकालें।
  9. उभरा वयस्कों के लिए चीनी उपलब्ध कराने के लिए पिंजरे के ऊपर जाल पर जैविक किशमिश रखें। किशमिश की निगरानी, ​​और ढालना संचय को रोकने के लिए हर 3-5 दिनों उन्हें बदल जाते हैं।

वयस्क 2. रखरखाव संभोग और अंडा उत्पादन की अनुमति दें करने के लिए

  1. (SECTI एक नम फिल्टर पेपर के साथ पिंजरे नीचे अस्तर द्वारा उच्च आर्द्रता (लगभग। 80%) में पिंजरों बनाए रखें, और ऊपर वर्णित के रूप में, गैर खोटा किशमिश के लिए पहुँच प्रदानऑन्स 1.5 और 1.9)।

3. रक्त-खिला

  1. Oviposition लगभग 100% diapause अंडे 14 के लिए शुरू होने से पहले महिलाओं के कम से कम आठ स्पष्ट ही दिनों को उजागर किया गया है कि यह सुनिश्चित करने के eclosion के बाद 2-6 दिनों के बीच खून-फीड महिलाओं के लिए तैयार करें।
  2. Hemotek झिल्ली खिला प्रणाली तैयार करें। बिजली की आपूर्ति में खिला इकाइयों प्लग। समायोजन पेंच का उपयोग कर 37 डिग्री सेल्सियस के लिए प्रत्येक इकाई के तापमान को समायोजित करें। अंशांकन दौरान खिला इकाई के तापमान को मापने के लिए एक इलेक्ट्रॉनिक थर्मामीटर और जांच का प्रयोग करें।
  3. भोजन जलाशय तैयार करें। भोजन जलाशय के एपर्चर अधिक कोलेजन खिला झिल्ली का एक वर्ग खिंचाव और एक हे अंगूठी के साथ सुरक्षित। ध्यान से झुर्रियों को दूर करने के लिए कोनों खींच; कैंची से अतिरिक्त झिल्ली ट्रिम।
    नोट: कोलेजन झिल्ली सभी मच्छर प्रजातियों के लिए अच्छी तरह से काम नहीं हो सकता है, और यह एक साथ काम कर रहे हैं अगर इष्टतम झिल्ली को खोजने के लिए कई प्रकार के प्रयास करने के लिए आवश्यक हो सकता हैए के अलावा अन्य प्रजातियों albopictus। Parafilm क्युलेक्स pipiens के साथ अच्छी तरह से काम करता है।
    1. खून उपयोग करने से पहले कम से कम 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर जमे हुए, पिघलना संग्रहीत है।
    2. झिल्ली के नीचे का सामना करना पड़ रहा है इसलिए जलाशय पकड़ो, असमर्थित, और भरने बंदरगाहों का सामना करना पड़ रहे हैं। एक विरोधी कौयगुलांट के रूप में सोडियम साइट्रेट है कि मुर्गियों से पूरे रक्त का लगभग 3 मिलीलीटर के साथ जलाशय को भरने के लिए एक हस्तांतरण पिपेट या सिरिंज का प्रयोग करें। प्लास्टिक प्लग के साथ भरने के बंदरगाहों सील।
  4. फीडर के तल पर गर्मी हस्तांतरण थाली पर संवर्धन पर यह पंगा लेना द्वारा फीडर के लिए तैयार जलाशय संलग्न। मच्छरों पिंजरे के जाल के माध्यम से फ़ीड कर सकते हैं, इसलिए है कि फीडर पलटना और पिंजरे के ऊपर, नीचे झिल्ली पक्ष पर जगह है। खिला अधिकतम करने के लिए लगभग 45 मिनट के लिए पिंजरे पर फीडर रखें।

4. oviposition उत्तेजित

  1. चार से पांच दिन रंग का एक अंधेरे के साथ एक पिंजरे से लैस, रक्त भोजन पोस्ट 50 मिलीलीटर गसख़्त बीज अंकुरण पेपर (अंडा कागज) या बनावट गैर प्रक्षालित कागज तौलिया के साथ लाइन में खड़ा करके विआयनीकृत पानी 9 के साथ आधे रास्ते को भरने के ऊपर। 250 से अधिक मच्छरों एक पिंजरे में हैं, तो दो कप का उपयोग करें।
    नोट: छोटे पिंजरों या एकल महिला शीशियों के लिए, oviposition कंटेनरों में "घास का अर्क" की वजह से माइक्रोबियल वनस्पतियों 25 की गंध को oviposition वृद्धि हो सकती है।

5. लीजिए और स्टोर अंडे

  1. अंडा उत्पादन आम तौर पर अगले सप्ताह से अधिक उतरे तो पांच दिन खून खिलाने के बाद लगभग चोटियों, और क्योंकि खून खिलाने के 4-5 दिनों के भीतर अंडे संग्रह शुरू।
  2. प्रयोग की आवश्यकताओं पर अंडा संग्रह आवृत्ति बदलती हैं। सामान्य प्रयोजनों के लिए, एक MWF समय पर अंडा कागजात इकट्ठा। प्रत्येक पिंजरे से अंडा कागजात निकालें और ताजा पेपर के साथ की जगह। अंडा भंडारण के confounding प्रभाव से बचने के लिए एसडी photoperiod कैबिनेट में पेट्री डिश और दुकान में हाल ही में हटा दिया कागजात रखें।
  3. अंडा कागजात फिर से करने की अनुमति दें अंडा सुखाना प्रतिरोध 26 से बढ़ जाती है, जो serosal छल्ली गठन की अनुमति देने के बाद की oviposition दो दिनों के लिए गीला मुख्य।
  4. लगभग 48 घंटे बाद संग्रह, खुली हवा में सूखे अंडे। यह कागज एच 2 ओ से अंधेरा है या अंडे के अंडे सेने को उत्तेजित करता है ताकि गीला लंगड़ा और स्पर्श करने के लिए थोड़ा नम है, लेकिन नहीं है कि इस तरह के कागज सूखी।
    ध्यान दें: एक 6.5 "एक्स 4" कागज सूखने के लिए लगभग 3.5 घंटा लग सकता है। इस अंडे सुखाना 27 में परिणाम होगा, के रूप में खत्म नहीं हुआ-सूखी अंडा कागजात के लिए सतर्क रहें।
  5. एलडी और एसडी दोनों photoperiods से रिजर्व अतिरिक्त अंडे diapause घटनाओं का आकलन और (diapause मापने धारा 6 देखें) photoperiodic प्रभाव की व्याख्या करने के लिए।
  6. लंबी अवधि के भंडारण के लिए, 21 डिग्री सेल्सियस पर अंडा कागजात रखने के लिए और पेट्री डिश में लगभग 80% आर्द्रता। भ्रूण के विकास के 21 डिग्री सेल्सियस से कम चार से पांच दिन लग जाते हैं के रूप में स्थानीय नमी बनाए रखने के लिए पानी की एक कुप्पी के साथ एक Tupperware भंडारण कंटेनर में पेट्री डिश रखें।
ove_title "> 6। diapause घटना उपाय

  1. अतिरिक्त आरक्षित भ्रूण diapause प्रतिक्रिया यों के लिए 7-20 दिन पुराने हैं कि (oviposition, धारा 4 उत्तेजित देखें) का प्रयोग करें।
  2. प्रत्येक अंडे कागज पर मौजूद अंडे की संख्या रिकॉर्ड।
  3. पूरी तरह से लगभग 80 मिलीलीटर विआयनीकृत एच 2 ओ के साथ एक 90 मिलीलीटर पेट्री डिश में अलग-अलग अंडा कागजात जलमग्न द्वारा पक्षियों के बच्चे अंडे उत्तेजित लगभग 0.25 मिलीग्राम भोजन घोल जोड़ें।
  4. 24 घंटे के बाद रची पहले instar लार्वा की संख्या का मिलान। लार्वा कल्पना और पकवान के एक तरफ एक प्रकाश स्रोत स्थान के लिए एक काले रंग की सतह पर पेट्री डिश रखें। लार्वा व्यक्ति लार्वा का एक स्पष्ट मिलान के लिए अनुमति देता है, प्रकाश स्रोत से दूर चले जाएँगे। व्यक्तिगत लार्वा देखते रोकने के लिए गिनती जबकि एक विंदुक के साथ अलग-अलग लार्वा निकालें।
  5. एक नया पेट्री डिश और फिर से शुष्क में जगह अंडा कागजात। री-पक्षियों के बच्चे अंडे फिर ~ एक सप्ताह और बाद उपरोक्त विधि का उपयोग कर रची अंडे मिलान।
  6. शेष यू के साथ प्लेस अंडा कागजात लगभग 80 मिलीलीटर विरंजन समाधान 28 के साथ मिलीलीटर 90 नई पेट्री डिश में अंडे एन रची। अंडा कागजात पूरी तरह से विरंजन समाधान में डूबे हुए हैं कि यह सुनिश्चित करें और ब्लीच की गंध से बचने के लिए एक धूआं हुड रातोंरात के तहत छोड़ दें।
    नोट: समाधान विरंजन 4 डिग्री सेल्सियस पर ~ एक सप्ताह के लिए भंडारित किया जा सकता है, लेकिन अन्यथा ताजा किया जाना चाहिए।
  7. जरायु स्पष्ट और embryonated, संयुक्त राष्ट्र रची अंडे के दृश्य की अनुमति देगा विरंजन के रूप में एक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग अंडे का निरीक्षण किया। अंडा embryonated जाता है, तो अंडा पृष्ठीय पक्ष पर एक दूसरे के विपरीत दो छोटे काले बिंदु के रूप में प्रदर्शित आंखों के साथ एक सफेद रंग का होगा। संयुक्त राष्ट्र के रची, embryonated अंडे 13 की संख्या टैली।
  8. कोई =% diapause: निम्न सूत्र के साथ diapause घटना का निर्धारण करते हैं। embryonated संयुक्त राष्ट्र-रची अंडे / (सं। रची अंडे + कोई। embryonated संयुक्त राष्ट्र-रची अंडे) 100 13 x।

अंडे / pharate लार्वा से 7. आरएनए एक्सट्रैक्शन

"ontent> नोट: एक लामिना का प्रवाह हुड में इस्तेमाल की Trizol।

  1. एक ऊंट-बाल ब्रश का उपयोग कर गिलास grinders के लिए अंडा कागजात से अलग विकास के समय बिंदुओं पर विकासशील भ्रूण या pharate लार्वा युक्त ब्रश मच्छर अंडे। पूरी तरह से pulverized तक TRIzol में अंडे (ऊतक के 50-100 मिलीग्राम प्रति 1 मिलीलीटर) पीस लें। पर्याप्त शाही सेना उपज के लिए पुस्तकालय के अनुसार कम से कम 400 अंडे का उपयोग करें।
    1. वैकल्पिक रूप से, तरल नाइट्रोजन में फ्रीज अंडे तस्वीर और TRIzol में पीस से पहले एक महीने तक के लिए microcentrifuge ट्यूब में -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत।
  2. TRIzol में शाही सेना के निष्कर्षण प्रदर्शन निर्माता के निर्देशों के अनुसार isopropanol तेज़ी से पीछा किया।
  3. आरएनए गिरावट से बचने के लिए किसी भी अवशिष्ट न्युक्लिअसिज़ दूर करने के लिए RNase परिशोधन समाधान या अन्य एजेंटों के साथ बेंच समझो।
    1. DNase के साथ निकाली गई शाही सेना को समझो। निर्माता के निर्देशों के अनुसार, 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए DNase के साथ शाही सेना के नमूने सेते हैं। एक & # का प्रयोग करें181; एक 50 μl प्रतिक्रिया में शाही सेना के ऊपर से 10 माइक्रोग्राम प्रति के लिए एल DNase। एक प्रतिक्रिया में शाही सेना के 10 से अधिक माइक्रोग्राम प्रति अगर वहाँ DNase की मात्रा में वृद्धि।
    2. 5 μl निलंबित DNase निष्क्रियता अभिकर्मक जोड़कर DNase निष्क्रिय। ऊष्मायन अवधि (कोमल vortexing) के दौरान तीन बार मिश्रण, कमरे के तापमान पर 5 मिनट सेते हैं।
    3. 1.5 मिनट के लिए 10,000 XG पर अपकेंद्रित्र। बाद के चरणों के लिए ताजा ट्यूबों के लिए इलाज शाही सेना के नमूने युक्त सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण।
  4. Fluorometry द्वारा कुल शाही सेना के नमूने की गुणवत्ता का आकलन। इस कार्य के लिए उचित उपकरण के साथ एक विशेषता की सुविधा के लिए नमूने भेजे। सुविधा चिप में डाले फ्लोरोसेंट रंजक द्वारा कल्पना नमूने में शाही सेना प्रजातियों का आकार निर्धारित करने के लिए पर चिप जेल वैद्युतकणसंचलन प्रदर्शन करेंगे। परिणाम एक electropherogram के रूप में लौटा दी जाएगी।
    1. उपस्थिति ओ इसका सबूत है, उपस्थिति या गिरावट उत्पादों की अनुपस्थिति से कुल शाही सेना के नमूने की अखंडता को निर्धारितजिसके परिणामस्वरूप electropherogram (चित्रा 1 बी) पर 18S और 5 एस ribosomal शाही सेना चोटियों के बीच एफ चोटियों।

8. शाही सेना अनुक्रमण

  1. मानक प्रोटोकॉल का पालन समृद्ध बनती अंत mRNA के पुस्तकालयों और mRNA अनुक्रमण, के निर्माण के लिए एक वाणिज्यिक अनुक्रमण केंद्र के लिए पर्याप्त रूप से उच्च गुणवत्ता (चित्रा 1 ए) और मात्रा (पुस्तकालय प्रति आमतौर पर> 3 माइक्रोग्राम प्रति) के साथ कुल शाही सेना के नमूने भेजे।
  2. एक से अधिक लेन एक ही प्रयोग क्रमबद्ध करने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है, अनुक्रमण के दौरान गलियों के बीच में तकनीकी बदलाव के लिए खाते में अनुक्रमण के लिए दो गलियों में व्यक्तिगत पुस्तकालयों विभाजित।

9. lllumina पढ़ें सफाई

नोट: चित्रा 2 इस प्रोटोकॉल के जैव सूचना विज्ञान भाग सार। इस प्रोटोकॉल के जैव सूचना विज्ञान खंड में प्रयुक्त सभी कार्यक्रमों और संसाधनों की एक पूरी सूची के लिए, 1 टेबल को देखें। मेंइसके अलावा, पूरक फ़ाइल एक निम्नलिखित जैव सूचना विज्ञान प्रोटोकॉल चरणों में से प्रत्येक के लिए कमांड लाइन उदाहरण हैं।

  1. एन सी बी आई UniVec कोर डेटाबेस के लिए 95% पहचान या उच्चतर के मैचों की पहचान के लिए ssaha2 29 (1 टेबल) का प्रयोग करें (तालिका 1), ए albopictus rRNA के अनुक्रम (GenBank # L22060.1), और अनुक्रमण एडेप्टर (पूरक फ़ाइल एक में प्रदान की विस्तृत कमांड लाइन उदाहरण)। प्रदान की पर्ल स्क्रिप्ट (पूरक फ़ाइल 2) आदत डाल द्वारा उदाहरण के लिए पर्ल का उपयोग कर मैच या एक समान पटकथा उपकरण के साथ पढ़ा जोड़े, निकालें।
  2. शेष स्वच्छ SolexaQA पैकेज 30 के साथ पढ़ता है (1 टेबल; पूरक फ़ाइल 1): DynamicTrim.pl की डिफ़ॉल्ट सेटिंग का उपयोग कम से कम 20 की एक phred स्कोर बराबर के साथ क्षेत्रों ट्रिम।
    1. निकालें आगे दोनों पर LengthSort.pl के साथ कम से कम 25 बीपी पढ़ता है और रिवर्स एक साथ पढ़ता है। FastQC (1 टेबल के साथ fastq साफ फ़ाइलों की गुणवत्ता का मूल्यांकन

10 डिजिटल सामान्यीकरण

  1. कश्मीर मेर आकार 20, 20 की कवरेज कट-ऑफ, और एक्स का उपयोग कर (विशेष रूप से normalize-by-median.py,, (पूरक फाइल एक टेबल 1) खमेर उपकरण 31 का उपयोग कर पढ़ता साफ पर डिजिटल सामान्य बनाने का एक दौर सम्पन्न = 1e10)।
  2. उच्च रैम के साथ एक मशीन उपलब्ध (जीबीएस के सैकड़ों) है, तो वैकल्पिक रूप से, ट्रिनिटी की normalize_by_kmer_coverage.pl लिपि (तालिका 1) का उपयोग करें।

11. डी नोवो transcriptome विधानसभा

  1. विधानसभा के आकार पर निर्भर करता है, राम के ऊपर से 256 जीबी और 24 CPUs के साथ एक कंप्यूटर या कंप्यूटर क्लस्टर के लिए पहुँच प्राप्त करें।
  2. Contigs में सेट डिजिटल सामान्यीकृत पढ़ें इकट्ठा करने के लिए, ट्रिनिटी 32 (पूरक फाइल एक टेबल 1) का प्रयोग करें। कम करने के लिएस्मृति के उपयोग, --min_kmer_cov 2 का उपयोग करें।

12. विधानसभा मूल्यांकन

  1. ट्रिनिटी contig उत्पादन पर Assemblathon2 परियोजना 33 से assemblathon_stats.pl चलाएँ। (; पूरक फाइल एक टेबल 1) यह स्क्रिप्ट ऐसी scaffolds के नंबर, N50, विधानसभा संरचना, और अधिक के रूप में मूल्यांकन के विधानसभा गुणवत्ता के लिए प्रासंगिक बुनियादी गणना करता है।

इकट्ठे transcriptome 13. एनोटेशन

  1. एक संदर्भ प्रोटीन सेट के खिलाफ विधानसभा के Blastx (तालिका 1) प्रदर्शन; मच्छरों के लिए, ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर, एनोफ़ेलीज़ gambiae, क्युलेक्स pipiens, और एडीज एजिप्टी उपयुक्त जिक्र कर रहे हैं। विशेष रूप से, blastx (पूरक फ़ाइल 1) द्वारा पीछा विस्फोट के लिए संदर्भ प्रोटीन FASTA फ़ाइल प्रारूप।

14. मानचित्र RSEM 34 का प्रयोग सभा के लिए पुस्तकें (1 टेबल)

  1. एक 'प्रतिलिपि करने वाली जीन-नक्शे के' फाइल बनाएं, जिसमेंपहले कॉलम संदर्भ जीन आईडी, और दूसरा कॉलम contig id हैं। एक स्प्रेडशीट संपादक में, Blastx उत्पादन से पहले और दूसरे कॉलम स्वैप, और एक .txt फ़ाइल के लिए इन स्तंभों में लिखें। यूनिक्स प्रारूप करने के लिए जिसके परिणामस्वरूप .txt फ़ाइल में लाइन टूट कन्वर्ट करने के लिए LINEBREAK प्रोग्राम का उपयोग करें।
  2. RSEM पैकेज (पूरक फ़ाइल 1) में प्रदान की rsem-तैयार करने के संदर्भ स्क्रिप्ट का उपयोग कर transcriptome FASTA फ़ाइल से एक संदर्भ डाटासेट बनाएँ।
  3. RSEM पैकेज (पूरक फ़ाइल 1) में प्रदान की rsem गणना अभिव्यक्ति आदेश का उपयोग करते हुए प्रत्येक पुस्तकालय के लिए अलग से अभिव्यक्ति मूल्यों की गणना। पढ़ता के रूप में, पठन-सफाई कदम (कदम 9.2) से उत्पन्न fastq बनती फ़ाइलों का उपयोग करें।
    1. एक जैविक को दोहराने से शाही सेना अनुक्रमण के लिए दो गलियों में विभाजित किया गया था, तो एक एकल फाइल उत्पन्न करने के लिए अभिव्यक्ति गणना में दोनों fastq फ़ाइलें शामिल हैं।
  4. आसानी से अन्य पी द्वारा संसाधित एक मैट्रिक्स के लिए प्रत्येक पुस्तकालय से अभिव्यक्ति परिणाम कन्वर्टRSEM पैकेज (पूरक फ़ाइल 1) में प्रदान की जाती प्रदान की स्क्रिप्ट rsem-उत्पन्न-डाटा मैट्रिक्स, का उपयोग कर rograms।

15. विभेदक अभिव्यक्ति विश्लेषण

  1. आर और Edger (तालिका 1) स्थापित करें।
  2. कदम 14.3 (पूरक फ़ाइल 1) से RSEM परिणाम लोड करने के लिए read.delim का प्रयोग करें। यदि आवश्यक हो, निकटतम पूर्णांक के लिए मायने रखता दौर।
    नोट: Edger गाइड महत्व का पता लगाने के लिए पर्याप्त उच्च अभिव्यक्ति के साथ जीन से डाटासेट सीमित सिफारिश की।
  3. Edger के लिए डेटा प्रारूप करने के लिए लोड डेटा फ़ाइल (पूरक फ़ाइल 1) से एक DGEList वस्तु उत्पन्न करते हैं। फिर, TMM सामान्यीकरण (पूरक फ़ाइल 1) का उपयोग कर डेटा मानक के अनुसार। डेटा (पूरक फ़ाइल 1) के आम और tagwise dispersions का अनुमान है।
  4. एक Benjamini-Hochberg साथ विभिन्न व्यक्त जीनों की पहचान पी मूल्य 0.05 <(पूरक फ़ाइल 1) सही। बहुतायत बनाम लॉग-गुना-परिवर्तन (पूरक फ़ाइल 1) के वितरण साजिश है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

दो प्रतिनिधि शाही सेना के नमूने की Fluorometry (चित्रा 1 ए, बी) NT लगभग 2,000 से कम दो बैंड दिखाया। कीट 28S ribosomal शाही सेना आसानी से संक्षिप्त हीटिंग या हाइड्रोजन बांड 35 को बाधित कि एजेंटों द्वारा बाधित कर रहे हैं, जो हाइड्रोजन बांड, द्वारा आयोजित दो polynucleotide चेन के शामिल है। जिसके परिणामस्वरूप दोनों घटकों के लगभग 18S ribosomal शाही सेना के रूप में एक ही आकार के होते हैं। दूसरा शाही सेना नमूना गिरावट के उच्च स्तर (चित्रा 1 बी) दिखाया।

ए के एक प्रतिनिधि समूह के Photoperiodic उपचार प्रतिकृति के बीच में कुछ बदलाव (तालिका 2) वहां गया था, हालांकि albopictus मच्छरों, लंबे समय से दिन-पाला मच्छरों में छोटी-दिन-पाला मच्छरों में उच्च diapause घटना है, और कम diapause घटना में हुई। उदाहरण के लिए, SD2 शेष प्रतिकृति की तुलना में कम (80%) diapause घटना (- 97.67% 87.18%) से पता चलता है दोहराने। यह दोहराने भी छोटी से छोटी sampl था ई आकार, यह एक सटीक परिणाम प्राप्त करने के लिए एक तरफ diapause माप के लिए अंडे (> 150) के लिए पर्याप्त संख्या निर्धारित करने की सिफारिश की है ताकि।

पोस्ट-अनुक्रमण वयस्क ए से एक प्रतिनिधि पुस्तकालय पर सफाई पढ़ा albopictus महिलाओं (83,853,322 52,736,065 के लिए कुल एक प्रतिनिधि पुस्तकालय के लिए पढ़ता से) की एक पर्याप्त संख्या में पुस्तकें हटा दिया। डिजिटल सामान्यीकरण आगे कुल की संख्या 41,435,934 को पढ़ता कम कर दिया। इनमें से एक ट्रिनिटी विधानसभा 1879 के एक N50, 1,023.1 का मतलब contig लंबाई, और 20,892 (चित्रा 3) की एक अधिकतम contig लंबाई के साथ, 76,377 contigs उत्पन्न पढ़ता है। अंतर अभिव्यक्ति के बाद oviposition (चित्रा 4) इन दो समय अवधि के बीच 3128 विभिन्न व्यक्त जीनों का पता चला 11 और 21 दिनों में diapause उत्प्रेरण शर्तों के तहत पाला भ्रूण की एक समान कार्यप्रवाह से विश्लेषण करती है।

/ftp_upload/51961/51961fig1highres.jpg "चौड़ाई =" 600px "/>

चित्रा 1: ए से Fluorometry उदाहरण के लिए उच्च गुणवत्ता वाले (ए) और कम गुणवत्ता की प्रोफाइल (बी) आरएनए एक्सट्रेक्शन albopictus। एक्स-अक्ष न्यूक्लियोटाइड टुकड़ों के आकार का प्रतिनिधित्व करता है, और y अक्ष फ्लोरोसेंट रीडिंग का प्रतिनिधित्व करता है। पैनल के बीच Y अक्ष पैमाने में अंतर (ए) और (बी) पर ध्यान दें। तीर अलग ribosomal RNAs के पदों के निशान। हरे रंग मार्कर बैंड के करीब स्पष्ट बैंड गिरावट का संकेत मिलता है।

चित्रा 2

चित्रा 2: पढ़ा तैयारी से जैव सूचना विज्ञान कार्यप्रवाह का सारांश अभिव्यक्ति अंतर प्रत्येक बॉक्स में प्रत्येक प्रोटोकॉल कदम की इसी संख्या के साथ इस प्रोटोकॉल के जैव सूचना विज्ञान खंड में एक कदम है, का प्रतिनिधित्व करता है।।


चित्रा 3:। हिस्टोग्राम एक ट्रिनिटी डी नोवो transcriptome विधानसभा से contig लंबाई की औसत contig लंबाई 1,023.1 है। Contig लंबाई का वितरण कम contigs की दिशा में भारी विषम है कि नोट; इस नए सिरे से transcriptome विधानसभा की खासियत है।

चित्रा 4
चित्रा 4: 11 दिनों बनाम 21 दिनों के बाद oviposition पर diapause pharate लार्वा की TMM-सामान्यीकृत जीन अभिव्यक्ति की बहुतायत बनाम दो गुना-परिवर्तन लॉग प्रत्येक बिंदु एक UniGene designates;। विभिन्न व्यक्त unigenes लाल रंग में हैं। पोस्ट-oviposition 11 दिनों में उच्च अभिव्यक्ति के साथ Unigenes, जहां सकारात्मक गुना-परिवर्तन मूल्योंउच्च अभिव्यक्ति के साथ unigenes के रूप में पद-oviposition 21 दिनों के नकारात्मक गुना-परिवर्तन मूल्य नहीं है।

कार्यक्रम / संसाधन वेबसाइट यूआरएल (2014/01/13 पहुँचा)
पर्ल http://www.perl.org/get.html
अजगर http://www.python.org/download/
ssaha2 http://www.sanger.ac.uk/resources/software/ssaha2/
एन सी बी आई UniVec कोर ftp://ftp.ncbi.nih.gov/pub/UniVec/UniVec_Core
SolexaQA http://solexaqa.sourceforge.net/
FastQC http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/
खमेर https://github.com/ged-lab/khmer
ट्रिनिटी http://trinityrnaseq.sourceforge.net/
ट्रिनिटीसामान्य बनाने स्क्रिप्ट http://trinityrnaseq.sourceforge.net/trinity_insilico_normalization.html
दो मूल्यांकन लिपियों Assemblathon https://github.com/ucdavis-bioinformatics/assemblathon2-analysis
(Makeblastdb और blastx भी शामिल है) बम विस्फोट + ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/
LINEBREAK https://code.google.com/p/linebreak/
RSEM http://deweylab.biostat.wisc.edu/rsem/
Edger उपयोगकर्ता मार्गदर्शिका http://www.bioconductor.org/packages/2.13/bioc/vignettes/edgeR/inst/doc/edgeRUsersGuide.pdf
आर http://www.r-project.org/
Edger http://www.bioconductor.org/packages/2.13/bioc/html/edgeR.html

तालिका 1: कार्यक्रमों और संसाधनों टी के लिए इस्तेमाल कियावह इस प्रोटोकॉल में प्रक्रियाओं जैव सूचना विज्ञान। यूआरएल आसानी से इस प्रोटोकॉल में आवश्यक संसाधनों में से प्रत्येक का उपयोग करने के लिए सूचीबद्ध हैं।

इलाज दोहराने 1 सेंट हैच से अंडे का नहीं। 2 एन डी हैच से अंडे का नहीं। सं embryonated, unhatched अंडे % Diapause
एसडी 1 10 0 68 87.18
एसडी 2 3 0 12 80.00
एसडी 3 1 0 42 97.67
एसडी 4 5 0 46 90.20
एसडी 5 6 0 79 92.94
एलडी 1 79 4 9 9.78
एलडी 2 28 0 4 12.50
एलडी 3 92 1 6 6.06
एलडी 4 30 0 5 14.29
एलडी 5 43 0 3 6.52

तालिका 2:। Diapause घटना गणना diapause घटना गणना की photoperiod प्रति पांच प्रतिकृति का परिणाम है। Diapause घटना गणना करने के लिए जरूरी हैं, जो सभी के लिए संयुक्त राष्ट्र के रची, embryonated अंडे, की संख्या के रूप में दो अलग-अलग hatchings से रची लार्वा की संख्या, शामिल किए गए हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

इस प्रोटोकॉल ए में प्रेरित diapause photoperiodically की वजह से विभिन्न व्यक्त जीन की खोज करने के तरीकों को प्रस्तुत करता है albopictus। photoperiodic diapause प्रतिक्रिया पर ध्यान केंद्रित कर उन लोगों के लिए विशेष रूप से - प्रोटोकॉल यह विशिष्ट नौसिखिए उपयोगकर्ताओं के लिए सुलभ एक आणविक शरीर क्रिया विज्ञान कार्यक्रम के सभी प्रायोगिक पहलुओं बनाने के लिए मच्छर पालन और जैव सूचना विज्ञान तकनीकों को जोड़ती है कि में महत्वपूर्ण है। पालन ​​गलतियों की पहचान करने के लिए अक्सर आवश्यक है - - जो मौजूदा तरीकों, हमारे ज्ञान को, पालन प्रोटोकॉल में के रूप में ज्यादा विस्तार प्रदान नहीं करते हैं और न ही वे नीचे की ओर सफल bioinformatic विश्लेषण सक्षम हो जाएगा कि पालन चरण के दौरान प्रायोगिक डिजाइन पर अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं। यहाँ प्रस्तुत तरीकों ए के लिए अनुकूलित किया गया है albopictus, विशेष रूप से आम तौर पर अगले करने के लिए एक प्रयोगशाला पीढ़ी से छह सप्ताह का समय लग जो पालन के तरीकों,। हालांकि, भविष्य अनुप्रयोगों में इस पद्धति का मामूली साथ अनुकूलित किया जा सकता हैphotoperiodic diapause 23 दिखा रहे हैं कि अन्य मच्छर प्रजातियों के लिए समायोजन। इसके अलावा, जनरल प्रयोगात्मक डिजाइन और जैव सूचना विज्ञान कार्यप्रवाह अन्य polyphenisms के अध्ययन के लिए लागू कर रहे हैं।

ए पालन जब प्रोटोकॉल में विस्तृत नहीं कई बिंदुओं पर विचार किया जाना चाहिए albopictus लार्वा। सबसे पहले, ए 36, 37। प्रयुक्त टायर बहुत सारी प्रयोगशाला कालोनियों की स्थापना के लिए लार्वा का एक आम स्रोत हैं पिछले कागजात के रूप में वर्णित albopictus प्राकृतिक और कृत्रिम कंटेनर निवास की एक विस्तृत विविधता में पाया जा सकता है। उत्तरी अमेरिका में 32N अक्षांश से ऊपर एकत्र आबादी एक मजबूत diapause प्रतिक्रिया 13 प्रदर्शन करने की उम्मीद की जा सकती है। ए इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया albopictus तनाव Manassas, VA से एकत्र किया गया था, और प्रयोगात्मक हेरफेर करने के लिए पहले से अधिक आठ पीढ़ियों के लिए एक प्रयोगशाला स्थापित करने में पाला गया था। दूसरा, photoperiod मंत्रिमंडल में प्रकाश व्यवस्था के देखभाल के साथ चुना जाना चाहिए। मंत्रिमंडल में बल्बप्रकाश पर बदल जाता है या बंद है जब निर्मित में प्रकाश व्यवस्था के कार्यों के साथ मंत्रिमंडल के भीतर तापमान के spikes पैदा कर सकता है। वास्तविक अवलोकन इन तापमान spikes के diapause प्रतिक्रिया को बाधित कर सकते हैं पता चलता है। इसे रोकने के लिए, निर्मित में प्रकाश कार्यों निष्क्रिय किया जाना चाहिए और मंत्रिमंडल 4 वाट शांत फ्लोरोसेंट बल्ब के साथ सुसज्जित किया जाना चाहिए। तीसरा, लार्वा एच 2 ओ गुणवत्ता और खाद्य बहुतायत के प्रति संवेदनशील हैं। इसलिए, ओवर-खिला बैक्टीरियल संचय और लार्वा मृत्यु दर को जन्म दे सकती। चौथा, रक्त-फीड वयस्क मादा मच्छर के लिए वैकल्पिक तरीके हैं। HemoTek प्रणाली लेखकों के अनुभव में बेहतर प्रदर्शन करती है, हालांकि ग्लास झिल्ली, एक वैकल्पिक कृत्रिम झिल्ली प्रणाली 38, 39 हैं। जीवित पशुओं (आमतौर पर चिकन या कृंतक) ने भी 38 का इस्तेमाल किया जा सकता है - इस मामले में, यह पहले अपने संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) से उपयुक्त प्रमाण पत्र प्राप्त करने के लिए आवश्यक है। पांचवां, कोई स्पष्ट प्रकाशित सबूत वें हालांकि वहाँअंडे 15 सहज हैं, पर वास्तविक टिप्पणियों oviposition के 10 दिनों के भीतर एक एलडी photoperiod उजागर करने के लिए जब एक एसडी photoperiod उपचार प्रदर्शनी से अंडे थोड़ा diapause घटनाओं को कम कर सुझाव देते हैं। इस प्रकार, एसडी अंडे में एक अधिक से अधिक diapause प्रतिक्रिया का उत्पादन और अंडे भंडारण के दौरान photoperiod (एसडी एलडी बनाम) के किसी भी confounding प्रभाव से बचने के लिए एसडी शर्तों के तहत दोनों एसडी और एलडी अंडे की दुकान।

उच्च शाही सेना गुणवत्ता उच्च गुणवत्ता आरएनए Seq डेटा पैदा करने के लिए आवश्यक है। प्रचुर मात्रा में देखभाल के लिए किसी भी nuclease संक्रमण से बचने के लिए शाही सेना निकासी के दौरान लिया जाना चाहिए। ऐसे चित्रा 1 बी में दिखाया गया है कि के रूप में कम गुणवत्ता शाही सेना के नमूने, अनुक्रमण के लिए उपयुक्त नहीं हैं। अनुक्रमण के लिए नमूने भेजने से पहले शाही सेना गुणवत्ता का आकलन जरूरी है। आरएनए अणुओं की विशेषता बैंड उच्च गुणवत्ता आरएनए electropherogram में दिखाया गया 18S की तुलना में छोटे ऐसे चार बैंड के रूप में शाही सेना निकासी के लिए इस्तेमाल किया कीट ऊतक के विभिन्न प्रकार, के लिए दिखाई हो सकता हैचित्रा 1 ए में। विशिष्ट जैविक उपचार के तहत नमूने भर में 18S पर दो बैंड के अलावा अन्य शाही सेना बैंड के अनुरूप पैटर्न कर सकते हैं दृढ़ता से इन बैंड गिरावट से परिणाम है, लेकिन प्रयोगात्मक डिजाइन में चुना विशिष्ट प्रकार के ऊतकों में आरएनए अणुओं की जैविक संरचना का प्रतिनिधित्व नहीं करते कि संकेत मिलता है।

यहाँ रेखांकित जैव सूचना विज्ञान कार्यप्रवाह प्रयोगात्मक शर्तों विषम दो से दोहराया आरएनए पुस्तकालयों से उत्पन्न Illumina अनुक्रमण डेटा से विभिन्न व्यक्त जीनों की एक सूची प्राप्त करने के लिए कुछ कमांड लाइन और पटकथा कौशल के साथ एक उपयोगकर्ता की अनुमति देता है। इस उदाहरण के विभिन्न photoperiod की वजह से व्यक्त जीनों का सवाल है, इस कार्यप्रवाह किसी भी जीव में, दो या दो से अधिक उपचार के साथ किसी भी प्रयोगात्मक डिजाइन करने के लिए लागू किया जा सकता है। विभिन्न व्यक्त जीनों की एक सूची पर पहुंचने के लिए कई अन्य तरीके हैं; हालांकि, इस प्रोटोकॉल नौसिखिए उपयोगकर्ता के लिए सबसे सरल तरीका हो जाने की संभावना है। और अधिक पूर्वperienced bioinformaticians उनकी विधानसभा की समीपता और अतिरेक में सुधार करने के लिए अतिरिक्त कदम उठाने के लिए चाहते हो सकता है। कोई जैव सूचना विज्ञान अनुभव करने के लिए थोड़ा के साथ जीव हो सकता है एक मुक्त चित्रमय-उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस संचालित विश्लेषण वातावरण है जो iPlant 40 डिस्कवरी पर्यावरण के भीतर इस पाइपलाइन का भी पूरा कम से कम हिस्सा है। यह iPlant की कार्यक्षमता डी नोवो transcriptome विधानसभाओं से भरा आरएनए Seq पाइपलाइनों को समायोजित करने के क्रम में भविष्य में बड़ा हो जाना जाएगा संभावना है। अंत में, उत्कृष्ट उपयोगकर्ता के गाइड को अच्छी तरह से अंतर अभिव्यक्ति के विश्लेषण के लिए Edger 41 (1 टेबल) का उपयोग करने के लिए कई तरीके के बारे में चर्चा है कि ध्यान दें।

कुछ मामलों में, एमआईएस असेंबलियों चिमेरिक contigs उत्पन्न कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, Uchime 42 के लिए इन गलत विधानसभाओं की पहचान करने में मदद कर सकते हैं कि कई तरीके हैं। हालांकि, पिछले अनुभव से पता चला काइमेरा की संख्या बेहद कम (<0.1%) है; इसलिए, employinगा कल्पना का पता लगाने के कार्यक्रम अतिरिक्त प्रयास के लायक नहीं हो सकता है।

उच्च throughput प्रसंस्करण, अगली पीढ़ी के अनुक्रमण डेटा एक भी परियोजना,> 500 जीबी) के लिए डेटा का 1) की दुकान से बड़ी मात्रा में करने की क्षमता (आवश्यकता है; 2) परंपरागत शब्द प्रोसेसर या स्प्रेडशीट प्रोग्रामों में खोला नहीं जा सकता है कि बड़े डेटा फ़ाइलों में हेरफेर; 3) डी नोवो विधानसभा के लिए जैसे रैम की बड़ी मात्रा में, आवश्यकता है कि विश्लेषण प्रदर्शन; और 4), या तो या ग्राफिकल यूजर इंटरफेस (साथ विश्लेषण सुइट्स के माध्यम से अक्सर गैर तुच्छ है जो इन कार्यक्रमों को स्थापित करने की क्षमता है,) की आवश्यकता है जो एक कमांड लाइन इंटरफेस (द्वारा संचालित कार्यक्रमों के माध्यम से, बड़े डेटासेट विश्लेषण जैसे आकाशगंगा 43 या iPlant 40 )। एक सहयोगी के माध्यम से, या तो विश्वविद्यालय के स्वामित्व वाली, या अपने स्वयं प्रयोगशाला के लिए खरीदा - यूनिक्स कमांड लाइन में कुछ प्रवीणता और एक स्क्रीप्टिंग भाषा के साथ शोधकर्ताओं ने एक स्थानीय कंप्यूटिंग क्लस्टर के लिए उपयोग से सबसे अधिक लाभ मिलेगा। उदाहरण के लिए, अटल बिहारीove के कार्यप्रवाह एक प्रयोगशाला के स्वामित्व वाली लबादा (12 कोर, 64 जीबी रैम, 1 टीबी हार्ड ड्राइव), और ट्रिनिटी विधानसभा के लिए एक विश्वविद्यालय के स्वामित्व वाली कंप्यूटर क्लस्टर का उपयोग कर पूरा किया गया था। इसी तरह के संसाधन उपलब्ध नहीं हैं, शोधकर्ताओं अभी भी कारण चित्रमय इंटरफेस पर्यावरण के लिए प्रशिक्षण में अपेक्षाकृत कम निवेश के साथ बड़े पैमाने पर कोई भी कीमत पर विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए iPlant के लिए बारी है, और कर सकते हैं। हालांकि, प्रदर्शन और विश्लेषण की व्याख्या उन अभी भी प्रयोग प्रत्येक कार्यक्रम की मान्यताओं को समझने की जरूरत है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Incubator - Model 818 Thermo-Scientific 3751 120 V
Controlled environment room Thermax Scientific N/A Walk-in controlled environment room built to custom specifications by Thermax Scientific Products. A larger alternative to an incubator. http://thermmax.com/
Cool Fluorescent bulb Philips 392183 4 W
Petri Dish 100 mm x 20 mm Fisher 08-772-E
Filter Paper 20.5 cm Fisher 09-803-6J
9.5 L Bucket Plastican Bway Products http://www.bwayproducts.com/sites/portal/plastic-products/plastic-open-head-pails/117
Utility Fabric-Mosquito Netting White Joann 10173292 http://www.joann.com/utility-fabric-mosquito-netting-white/10173292.html
Orthopedic stockings Albahealth 23650-040 product no. 081420
Organic Raisins Newman's Own UPC: 884284040255
Oviposition cups (brown) Fisher Scientific 03-007-52 The product is actually an amber 125 ml bottle that we saw the top off of.
Recycled Paper Towels Seventh Generation 30BPT120
Modular Mates Square Tupperware Set Tupperware http://order.tupperware.com/pls/htprod_www/coe$www.add_items
Glass Grinder Corning Incorporated 7727-2 These Tenbroeck tissue grinders break the eggs and release RNA into the TRI Reagent.
TRI Reagent Sigma Aldrich T9424 Apply 1 ml TRI Reagent per 50-100 mg of tissue. Caution — this reagent is toxic.
TURBO DNA-free Ambion/Life Technologies AM1907 This kit generates greater yield than traditional DNase treatment followed by phenol/chloroform cleanup, and it is simpler to use.
RNaseZap Ambion/Life Technologies AM9782 Apply liberally on the bench surfaces and any equipment that might be in contact with the RNA samples. The solution is slightly alkaline/corrosive, can cause irritation and is harmful when swallowed.
2100 Bioanalyzer Agilent Technologies G2939AA Place up to 12 RNA samples on one chip.
Hemotek Membrane Feeder Hemotek  5W1 This system  provides 5 feeding stations that can be used simultaneously. Includes PS5 Power Unit and Power cord; 5 FUI Feeders + Meal Reservoirs and O-rings; Plastic Plugs, Hemotek collagen feeding membrane; Temperature setting tool; and Plug extracting tool. The company's mailing address is: Hemotek Ltd; Unit 5 Union Court; Alan Ramsbottom Way; Great Harwood; Lancashire, UK; BB6 7FD; tel: +44 1254 889 307.
Digital Thermometer and Probe Hemotek  MT3KFU MicroT3 thermometer and KFU probe. This is used to set the temperature of each FUI feeding unit.
Chicken Whole Blood, non-sterile with Sodium Citrate Pel-Freez Biologicals 33130-1 The 500 ml of blood were frozen and stored in 20 ml aliquots at -80 °C for up to 1 year. Thaw blood at room temperature for at least 1 hr before using.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bilyk, K. T., Cheng, C. H. C. Model of gene expression in extreme cold - reference transcriptome for the high-Antarctic cryopelagic notothenioid fish Pagothenia borchgrevinki. BMC Genomics. 14, 634 (2013).
  2. Chapman, M. A., Hiscock, S. J., Filatov, D. A. Genomic divergence during speciation driven by adaptation to altitude. Mol. Biol. Evol. 30, 2553-2567 (2013).
  3. Schwarz, D., et al. Sympatric ecological speciation meets pyrosequencing: sampling the transcriptome of the apple maggot Rhagoletis pomonella. BMC Genomics. 10, 633 (2009).
  4. Barshis, D. J., et al. Genomic basis for coral resilience to climate change. P. Natl Acad. Sci. USA. 110, 1387-1392 (2013).
  5. Urbanski, J. M., Aruda, A., Armbruster, P. A. A transcriptional element of the diapause program in the Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, identified by suppressive subtractive hybridization. J. Insect Physiol. 56, 1147-1154 (2010).
  6. Huang, Y. H., et al. The duck genome and transcriptome provide insight into an avian influenza virus reservoir species. Nat. Genet. 45, 776-783 (2013).
  7. Sessions, O. M., et al. Host cell transcriptome profile during wild-type and attenuated dengue virus infection. PLoS Negl. Trop. Dis. 7 (3), 2107 (2013).
  8. Poelchau, M. F., Reynolds, J. A., Elsik, C. G., Denlinger, D. L., Armbruster, P. A. Deep sequencing reveals complex mechanisms of diapause preparation in the invasive mosquito, Aedes albopictus. P. R. Soc B. 280, (2013).
  9. Poelchau, M. F., Reynolds, J. A., Elsik, C. G., Denlinger, D. L., Armbruster, P. A. Transcriptome sequencing as a platform to elucidate molecular components of the diapause response in Aedes albopictus. Physiol. Entomol. 38, 173-181 (2013).
  10. Poelchau, M. F., Reynolds, J. A., Denlinger, D. L., Elsik, C. G., Armbruster, P. A. A de novo transcriptome of the Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, to identify candidate transcripts for diapause preparation. BMC Genomics. 12, 619 (2011).
  11. Benedict, M. Q., Levine, R. S., Hawley, W. A., Lounibos, L. P. Spread of the tiger: Global risk of invasion by the mosquito Aedes albopictus. Vector-Borne Zoonot. 7, 76-85 (2007).
  12. Lounibos, L. P. Invasions by insect vectors of human disease. Annu. Rev. Entomol. 47, 233-266 (2002).
  13. Urbanski, J. M., et al. Rapid adaptive evolution of photoperiodic response during invasion and range expansion across a climatic gradient. Am. Nat. 179, 490-500 (2012).
  14. Lounibos, L. P., Escher, R. L., Lourenco-de-Oliveria, R. Asymmetric evolution of photoperiodic diapause in temperate and tropical invasive populations of Aedes albopictus (Diptera Culicidae). Ann. Entomol. Soc. Am. 96, 512-518 (2003).
  15. Mori, A., Oda, T., Wada, Y. Studies on the egg diapause and overwintering of Aedes albopictus in Nagasaki. Trop. Med. 23, 79-90 (1981).
  16. Pumpuni, C. B. Factors influencing photoperiodic control of egg diapause in Aedes albopictus [dissertation]. , (1989).
  17. Wang, R. L. Observations on the influence of photoperiod on egg diapause in Aedes albopictus Skuse. Acta Entomol. Sinica. 15, 75-77 (1966).
  18. Sota, T., Mogi, M. Survival-time and resistance to desiccation of diapause and non-diapause eggs of temperate Aedes (Stegomyia) mosquitoes. Entomol. Exp. Appl. 63, 155-161 (1992).
  19. Reynolds, J. A., Poelchau, M. F., Rahman, Z., Armbruster, P. A., Denlinger, D. L. Transcript profiling reveals mechanisms for lipid conservation during diapause in the mosquito, Aedes albopictus. J. Insect Physiol. 58, 966-973 (2012).
  20. Andrewartha, H. G. Diapause in relation to the ecology of insects. Biol. Rev. 27, 50-107 (1952).
  21. Danks, H. V. Insect Dormancy: An Ecological Perspective. Biological Survey of Canada (Terrestrial Arthropods). , Ottowa, Canada. (1987).
  22. Denlinger, D. L. Regulation of diapause. Ann. Rev. Entomol. 47, 93-122 (2002).
  23. Rev Entomol, A. nn 59, 93-122 (2014).
  24. Armbruster, P. A., Conn, J. E. Geographic variation of larval growth in North American Aedes albopictus (Diptera). Culicidae). Ann. Entomol. Soc. Am. 99, 1234-1243 (2006).
  25. Reiter, P., Amador, M. A., Colon, N. Enhancement of the CDC ovitrap with hay infusions for daily monitoring of Aedes aegypti populations. J. Am. Mosquito Contr. Association. 7 (1), 52 (1991).
  26. Rezende, G. L., et al. Embryonic desiccation resistance in Aedes aegypti: presumptive role of the chitinized serosal cuticle. BMC Dev. Biol. 8, 182 (2008).
  27. Munstermann, L. Care and maintenance of Aedes mosquito colonies. The Molecular Biology of Insect Disease Vectors. Crampton, J., Beard, C., C, L. ouis , Springer. Netherlands. 13-20 (1997).
  28. Trpis, M. A new bleaching and decalcifying method for general use in zoology. Can. J. Zoolog. 48, 892-893 (1970).
  29. Ning, Z. M., Cox, A. J., Mullikin, J. C. SSAHA: A fast search method for large DNA databases. Genome Res. 11 (10), 1725-1729 (2001).
  30. Cox, M. P., Peterson, D. A., Biggs, P. J. SolexaQA: At-a-glance quality assessment of Illumina second-generation sequencing data. BMC Bioinformatics. 11, 485 (2010).
  31. Brown, C. T., Howe, A., Zhang, Q., Pyrkosz, A. B., Brom, T. H. A reference-free algorithm for computational normalization of shotgun sequencing data [Internet]. , Available at: http://arxiv.org/abs/1203.4802 (2012).
  32. Grabherr, M. G., et al. Full-length transcriptome assembly from RNA-Seq data without a reference genome. Nat. Biotechnol. 29 (7), 644-652 (2011).
  33. Bradnam, K. R., et al. Assemblathon 2: evaluating de novo methods of genome assembly in three vertebrate species. GigaScience. 2, 10 (2013).
  34. Li, B., Dewey, C. RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome. BMC Bioinformatics. 12, 323 (2011).
  35. White, B. N., De Lucca, F. L. Preparation and analysis of RNA. Analytical Biochemistry of Insects. Turner, R. B. , Elsevier Scientific Publishing Company. Philadelphia, PA. (1977).
  36. Hawley, W. A. The biology of Aedes albopictus. J. Am. Mosq. Contr. Assoc. 4, 1-39 (1988).
  37. Dowling, Z., Ladeau, S. L., Armbruster, P., Biehler, D., Leisnham, P. T. Socioeconomic status affect mosquito (Diptera:Culicidae) larval habitat type availability and infestation level. J. Med Entomol. 50, 764-772 (2013).
  38. Benedict, M. Q. Chapter 2,4,10. Bloodfeeding: Membrane apparatuses and animals. Methods in Anopheles Research. , Malaria Research and Reference Reagent Resource Center(MR4). (2010).
  39. Das, S., Garver, S., Ramirez, J. R., Xi, Z., Dimopolous, G. Protocol for dengue infections in mosquitoes (A. aegypti) and infection phenotype determination. J. Vis. Exp. 5 (220), (2007).
  40. Goff, S. A., et al. The iPlant collaborative: cyberinfrastructure for plant biology. Plant Sci. 2 (34), (2011).
  41. Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26, 139-140 (2010).
  42. Edgar, R. C., Haas, B. J., Clemente, J. C., Quince, C., Knight, R. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection. Bioinformatics. 27 (16), 2194-2220 (2011).
  43. Goecks, J., et al. Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences. Genome Biol. 11 (8), 86 (2010).

Tags

जेनेटिक्स अंक 93, photoperiodic diapause आरएनए Seq मच्छर पशुपालन
एशियाई टाइगर मच्छर में Photoperiodic diapause की शाही सेना seq के विश्लेषण के लिए एक प्रयोगात्मक और जैव सूचना विज्ञान प्रोटोकॉल,<em&gt; एडीज albopictus</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Poelchau, M. F., Huang, X., Goff,… More

Poelchau, M. F., Huang, X., Goff, A., Reynolds, J., Armbruster, P. An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus. J. Vis. Exp. (93), e51961, doi:10.3791/51961 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter