Protocol
1. larval criação de duas A. Grupos albopictus à Idade Adulta
- Definir dois armários de fotoperíodo com iluminação programável a 21 ° C para a expressão diapause óptima 16 e cerca de 80% de umidade relativa.
- Programa de um gabinete para a 16L: luz 8D: ciclo escuro (a não diapausa induzindo LD fotoperíodo). Defina o segundo armário para um 8L: 16D luz: ciclo escuro (diapausa induzindo) 13.
- 'Luzes sobre' programa ao mesmo tempo em ambos os armários para sincronizar o tempo circadiano entre fotoperíodo.
- Calcular a quantidade de ovos necessários para a realização da experiência. Apontar para 300-500 ovos por gaiola. Pelo menos três réplicas gaiolas diapausa e três réplicas de diapausa gaiolas não são necessários para a produção de ARN. Isso totaliza até cerca de 1,800-3,000 ovos por experimento.
- Chocar os ovos, submergindo papéis de ovos em cerca de 500 ml de H 2 O. deionizada
- Adicionar <em> ca. 1 ml suspensão alimento que consiste em alimentos para cães chão e camarão de água salgada, como descrito anteriormente 24. Cubra o recipiente com malha, e manter a malha no lugar com um elástico.
- Coloque no gabinete LD fotoperíodo durante cerca de 24 horas.
- Transferência larvas eclodidas de 10 x 10 x 2 cm, de Petri pratos cheios com cerca de 90 ml de água desionizada H 2 O.
- Manter cerca de 30 larvas por prato. Larvas de limpar pratos a cada 48-72 hr transferir, por exemplo, todas as segundas, quartas e sexta-feira (MWF) 24.
- Alimentação de cerca de 1 ml suspensão alimento que consiste em alimentos para cães chão e camarão de água salgada em água deionizada cada MWF como descrito anteriormente 24.
- Configurar 3-4 gaiolas adultos para cada tratamento fotoperíodo, onde cada gaiola compreende uma réplica biológica.
- A partir de lados opostos de 9,5 L baldes, cortar um 10-a-14 centímetros buraco, e um outro furo, com 15 cm de diâmetro. CoVer o primeiro com malha. Cortar aproximadamente um comprimento de um pé da meia ortopédica, e cola uma extremidade em torno do interior do outro furo.
- Corte a ponta do pé da meia off e nó fechado - aberto apenas quando o acesso ao interior da gaiola é necessário. Para a tampa gaiola, cortar todo o interior, deixando apenas o aro, e substituir o plástico interior com malha 24.
- Observe o fotoperíodo, replicar número, gaiola data de início, e outras informações relevantes para o experimento com marcador permanente no lado da gaiola.
- Alinhar a parte inferior das gaiolas adultos com papel de filtro molhado. Humedecer o papel de filtro com água desionizada suficiente H2O para aumentar a humidade local na gaiola, mas evite a água de pé, que pode estimular a oviposição sobre o papel de filtro 24. Verifique o filtro de papel por dia, durante a secagem, re-molhado quando necessário.
- Para produzir ovos suficientes para uma biblioteca de RNA, incluir, pelo menos 100 mulheres / 9.5 L cage, com não mais de 500 mosquitos por gaiola.
- Recolha MWF pupas e coloque em um copo pequeno de H 2 O limpo a uma densidade de não mais de 50 pupas por 25 ml de H 2 O. Transfira o copo pupas de uma gaiola de adulto. Coloque as gaiolas no respectivo gabinete de fotoperíodo - A. albopictus pupas são fotossensíveis 15.
- Certifique-se de diário que H 2 O em copos é limpo e claro, e remover pupas morto, porque a acumulação de pupas mortos pode causar mortalidade em massa. Retirar H 2 O copos depois de todos pupas emergir.
- Coloque passas orgânicas na parte superior da gaiola de malha para fornecer açúcar para adultos emergiram. Monitorar passas, e alterá-las a cada 3-5 dias para evitar o acúmulo de mofo.
2. Manutenção de Adultos para Permitir acasalamento e produção de ovos
- Manter gaiolas com alta umidade (aprox. 80%), forrando o fundo da gaiola com um papel de filtro umedecido, e fornecer acesso a passas não mofados, como descrito acima (Sections 1,5 e 1,9).
3. Sangue-feeding
- Prepare-se para as fêmeas de sangue de alimentação entre dois a seis dias após a eclosão de garantir que as fêmeas foram expostos a pelo menos oito dias curtos inequívocas antes oviposição começa por quase 100% dos ovos de diapausa 14.
- Prepare o sistema de alimentação Hemotek membrana. Ligue as unidades de alimentação à fonte de alimentação. Ajustar a temperatura de cada unidade a 37 ° C, utilizando o parafuso de ajustamento. Usar um termómetro electrónico e sonda para medir a temperatura da unidade de alimentação durante a calibração.
- Prepare o reservatório de alimentação. Estique uma praça de alimentação membrana de colágeno sobre a abertura do reservatório de alimentação e fixe-a com um anel-O. Retire cuidadosamente os cantos para remover rugas; aparar o excesso de membrana com uma tesoura.
NOTA: membrana de colagénio pode não funcionar bem para todas as espécies de mosquitos, e pode ser necessário tentar vários tipos para encontrar a membrana óptima se trabalhar com umexceto A. espécies albopictus. Parafilm funciona bem com o Culex pipiens.- Se o sangue é armazenado congelado, descongelar à temperatura ambiente durante pelo menos 1 hr antes de usar.
- Mantenha o reservatório de modo a membrana está voltada para baixo, sem suporte e os orifícios de enchimento estão voltados para cima. Usar uma pipeta ou uma seringa para encher o reservatório com cerca de 3 ml de sangue total a partir de galinhas que tem o citrato de sódio como anti-coagulante. Selar orifícios de enchimento com tampões de plástico.
- Anexar o reservatório preparado para o alimentador rodando no pino na placa de transferência de calor na parte inferior do alimentador. Inverta o alimentador e coloque-o em cima da gaiola, lado membrana para baixo, de modo que os mosquitos podem se alimentar através da malha da gaiola. Mantenha o alimentador na gaiola durante cerca de 45 minutos para maximizar a alimentação.
4. Estimular a oviposição
- Quatro a cinco dias após a farinha de sangue, equipar cada gaiola com uma cor escura 50 ml c-se forrada com papel não branqueado a germinação das sementes (papel de ovo) ou com texturas toalha não-branqueada de papel e encha até a metade com água deionizada 9. Se mais de 250 mosquitos estão em uma gaiola, use dois copos.
NOTA: Para pequenas gaiolas ou frascos single-fêmea ", infusão de feno", em recipientes de oviposição pode aumentar oviposição devido ao odor da flora microbiana 25.
5. coletar e armazenar ovos
- Começar a coleta de ovos dentro de 4-5 dias de alimentação de sangue, porque a produção de ovos tipicamente pico cerca de cinco dias após a alimentação de sangue, e depois desaparece ao longo da próxima semana.
- Varie freqüência de coleta de ovos em necessidades do experimento. Para fins gerais, recolher papéis de ovos em uma programação MWF. Remova papéis de ovos de cada gaiola e substituir por papel novo. Coloque papéis removido recentemente em placas de Petri e guardar no armário fotoperíodo SD para evitar efeitos de confusão de armazenamento de ovos.
- Permitir papéis de ovo para re principal molhado por 2 dias pós-oviposição para permitir a formação da cutícula serosa, o que aumenta a resistência à dessecação ovo 26.
- Posto de Arrecadação aproximadamente 48 hr, ovos secar ao ar livre. Seca-se o papel de tal forma que é mole e ligeiramente húmido ao toque, mas não de modo que o papel molhado é escuro a partir de H 2 O ou estimula a eclosão dos ovos.
NOTA: A "x 4" papel 6.5 pode demorar cerca de 3,5 horas para secar. Tenha cuidado para não sobre-seco papéis de ovos, pois isso irá resultar em ovo dessecação 27. - Reservar ovos adicionais, tanto LD e SD fotoperíodo para avaliar a diapausa e interpretar o efeito photoperiodic (ver medição diapausa, Seção 6).
- Para armazenamento a longo prazo, tenha papéis de ovos a 21 ° C e cerca de 80% de humidade em placas de Petri. Manter pratos de Petri em um recipiente de armazenamento Tupperware com um frasco de água para manter a humidade local como o desenvolvimento embrionário leva quatro a cinco dias a 21 ° C.
- Use embriões reservados adicionais (ver Estimular oviposição, secção 4), que são 7-20 dias de idade para quantificar a resposta diapausa.
- Anote o número de ovos presentes em cada papel ovo.
- Estimular os ovos para chocar, submergindo completamente papéis individuais de ovos em um prato de 90 ml Petri com aproximadamente 80 ml de H 2 O. deionizada Adicionar aproximadamente 0,25 ml de suspensão de alimentação.
- Após 24 h contar o número de larvas eclodidas primeiro instar. Colocar a placa de Petri sobre uma superfície preta para visualizar larvas e colocar uma fonte de luz de um lado do prato. As larvas irão mover-se para longe da fonte de luz, o que permite uma contagem de larvas claro indivíduo. Remover larvas indivíduo com uma pipeta, contando para evitar recontando larvas individual.
- Papers lugar de ovos em uma nova placa de Petri e re-seco. Re-ovos eclodem depois de ~ 1 semana e novamente concordância ovos eclodidos usando o método acima.
- Papers lugar de ovo com o restante u ovos n-eclodidos em novos 90 ml placas de Petri com solução de branqueamento de aproximadamente 80 ml 28. Certifique-se de que os papéis de ovos estão completamente submerso na solução de branqueamento e deixe durante a noite sob uma coifa para evitar o odor de água sanitária.
NOTA: Branqueamento solução pode ser armazenada durante ~ 1 semana a 4 ° C, mas de outro modo deve ser feita. - Inspecione ovos usando um microscópio de luz como o branqueamento irá limpar o chorion e permitir a visualização de embrionados, ovos un-chocados. Se o ovo é embrionados, o ovo terá uma cor off-white com os olhos aparecem como dois pequenos pontos pretos opostos um ao outro na face dorsal. Contar o número de un-chocado, ovos embrionados 13.
- Determinar a diapausa com a seguinte fórmula:% diapausa = nenhum. ovos embrionados un-nascidos / (no. ovos eclodidos + não. ovos un-eclodidas embrionados) x 100 13.
7. Extração de RNA a partir de ovos / larvas pharate
ontent "> NOTA: Use Trizol em uma capela de fluxo laminar.- Ovos do mosquito da escova contendo embriões em desenvolvimento ou larvas pharate em momentos distintos do desenvolvimento de trabalhos de ovos para moedores de vidro usando um pincel de pêlo de camelo. Triture os ovos em Trizol (1 ml por 50-100 mg de tecido) até que esteja completamente pulverizada. Utilize pelo menos 400 ovos per biblioteca para produzir RNA suficiente.
- Alternativamente, encaixe ovos congelados em azoto líquido e armazenado a -80 ° C em tubos de microcentrífuga de até um mês antes da moagem em Trizol.
- Realizar a extracção de ARN em Trizol seguido por precipitação com isopropanol de acordo com as instruções do fabricante.
- Tratar o banco com solução RNase descontaminação ou outros agentes para remover quaisquer nucleases residuais para evitar a degradação do RNA.
- Tratar o RNA extraído com DNase. De acordo com as instruções do fabricante, incubar as amostras de ARN com DNase durante 30 min a 37 ° C. Use 1 & #181; l de ADNase para até 10 ug de RNA numa reacção de 50 ul. Aumentar a quantidade de ADNase, se houver mais do que 10 ug de RNA em uma reacção.
- Inactivar ADNase por adição de 5 ul de reagente de inactivação de DNase suspenso. Incubar 5 min à temperatura ambiente, a mistura três vezes durante o período de incubação (vortex suave).
- Centrifugar a 10.000 xg por 1,5 min. Transferir o sobrenadante contendo as amostras de RNA tratada para tubos frescos para as etapas subsequentes.
- Avaliar a qualidade das amostras de ARN totais por fluorometria. Enviar as amostras para uma instalação de especialidade com o instrumento adequado para esta tarefa. A facilidade vai efectuar a electroforese em gel em chips, para determinar os tamanhos de espécies de RNA presentes na amostra, visualizadas por coloração fluorescente instilada no chip. Os resultados serão retornados como um electroferograma.
- Determinar a integridade das amostras de ARN total por a presença ou ausência de produtos de degradação, tal como evidenciado pela presença of os picos entre 18S e 5S picos de ARN ribossomal no electroferograma resultante (Figura 1B).
8. RNA Sequencing
- Enviar amostras de ARN totais com qualidade suficientemente elevada (Figura 1A) e da quantidade (geralmente> 3 ug por biblioteca) para um centro de sequenciação comercial para a construção de bibliotecas enriquecidas emparelhado-finais de ARNm e a sequenciação de ARNm, seguindo protocolos padrão.
- Se mais de uma faixa está sendo usado para sequenciar um único experimento, dividir bibliotecas individuais em duas pistas de sequenciamento para explicar variação técnica entre pistas durante o seqüenciamento.
9. lllumina Leia Limpeza
NOTA: A Figura 2 resume a porção bioinformática deste protocolo. Para obter uma lista completa de todos os programas e recursos usados na seção bioinformática deste protocolo, consulte a Tabela 1. EmAdicionalmente, Suplementar Arquivo 1 contém exemplos de linha de comando para cada uma das seguintes etapas do protocolo de bioinformática.
- Use ssaha2 29 (Tabela 1) para identificar as correspondências com 95% de identidade ou superior para a base de dados do NCBI UniVec núcleo (Tabela 1), A. albopictus sequência rRNA (GenBank # L22060.1) e adaptadores de seqüenciamento (exemplos detalhados de linha de comando fornecidas em Suplementar Arquivo 1). Remover pares de leitura com jogos usando Perl ou uma ferramenta de scripting semelhante, por exemplo, adaptando o script Perl fornecida (Suplementar Arquivo 2).
- Limpe restante lê com o pacote SolexaQA 30 (Tabela 1; Suplementar Arquivo 1): aparar as regiões com uma pontuação equivalente Phred inferior a 20 usando as configurações padrão de DynamicTrim.pl.
- Remover lê mais curto do que 25 bp com LengthSort.pl em ambos frente e verso lê simultaneamente. Avaliar a qualidade dos arquivos limpos fastq com FastQC (Tabela 1
10. Digital Normalização
- Execute uma rodada de normalização digital no limpos lê usando a ferramenta khmer 31 (Tabela 1; Suplementar Arquivo 1), especificamente normalize-by-median.py (usando tamanho k-mer 20, uma cobertura de corte de 20, e x = 1e10).
- Como alternativa, se uma máquina com alta RAM disponível (centenas de GBs), usar o script normalize_by_kmer_coverage.pl de Trinity (Tabela 1).
11. De Assembléia transcriptoma Novo
- Obter acesso a um grupo de computadores ou computador com até 256 Gb de RAM e CPUs 24, dependendo do tamanho do conjunto.
- Use Trinity 32 (Tabela 1; Suplementar Arquivo 1) para montar a leitura digital normalizado definido em contigs. Para reduziruso de memória, use --min_kmer_cov 2.
12. Avaliação Assembleia
- Execute assemblathon_stats.pl do projeto Assemblathon2 33 na saída contig Trindade. Este script executa cálculos básicos relevantes para a avaliação da qualidade de montagem, tais como número de andaimes, N50, composição de montagem, e mais (Tabela 1; Suplementar arquivo 1).
13. Anotação do transcriptoma montado
- Execute Blastx (Tabela 1) do conjunto contra um conjunto de proteínas de referência; para os mosquitos, Drosophila melanogaster, Anopheles gambiae, Culex pipiens, e Aedes aegypti são referências adequadas. Especificamente, formatar o arquivo fasta proteína de referência para a explosão, seguida de blastx (Suplementar Arquivo 1).
14. Mapa Lê à Assembléia Usando RSEM 34 (Tabela 1)
- Criar um arquivo 'transcrição-to-gene-map', em que oprimeira coluna contém os IDs de genes de referência, e a segunda coluna os IDs contig. Em um editor de planilhas, trocar as primeira e segunda colunas a partir da saída Blastx, e escrever estas colunas em um arquivo .txt. Use o programa LineBreak para converter as quebras de linha no arquivo .txt resultante para formato Unix.
- Criar um conjunto de dados de referência a partir do arquivo fasta transcriptoma usando o script rsem-prepare-referência, fornecido no pacote RSEM (Suplementar Arquivo 1).
- Calcular os valores de expressão separadamente para cada biblioteca usando o comando rsem-calcular-expressão, fornecido no pacote RSEM (Suplementar Arquivo 1). Como lê, utilizar os ficheiros emparelhados fastq resultantes do passo de limpeza de leitura (passo 9.2).
- Se RNA a partir de uma réplica biológica foi dividida em duas pistas para o seqüenciamento, incluem ambos os arquivos fastq no cálculo expressão para gerar um único arquivo.
- Converter os resultados de expressão de cada biblioteca a uma matriz facilmente processados por outro pROGRAMAS usando o rsem-gerar-data-matriz do script fornecido, fornecido no pacote RSEM (Suplementar Arquivo 1).
15. Análise da expressão diferencial
- Instale R e aparador (Tabela 1).
- Use read.delim para carregar os resultados RSEM da etapa 14.3 (Suplementar Arquivo 1). Se necessário, completar a contagem para o número inteiro mais próximo.
NOTA: O guia facetadora recomenda limitar o conjunto de dados de genes com expressão elevada o suficiente para detectar significado. - Para formatar os dados para facetadora, gerar um objeto DGEList do arquivo de dados carregado (Suplementar Arquivo 1). Em seguida, normalizar os dados usando TMM normalização (Suplementar Arquivo 1). Estimar as dispersões comuns e tagwise dos dados (Suplementar arquivo 1).
- Identificar genes diferencialmente expressos com um Benjamini-Hochberg corrigido p <0,05 (File Suplementar 1). Traça-se a distribuição de log-fold-change vs. abundância (Suplementar Arquivo 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fluorometria de duas amostras de RNA representativos mostraram duas bandas a aproximadamente 2000 nt (Figura 1A, B). O ARN ribossómico 28S de insectos é composta de duas cadeias polinucleotídicas mantidas juntas por ligações de hidrogénio, que são facilmente rompidas por breve aquecimento ou agentes que perturbam a 35 ligações de hidrogénio. Os dois componentes resultantes são aproximadamente do mesmo tamanho que o ARN ribossómico 18S. A segunda amostra de RNA apresentaram altos níveis de degradação (Figura 1B).
Tratamento fotoperiódica de um grupo representativo de A. albopictus resultou em alta incidência de diapausa em mosquitos-de dias curtos criados, e baixa incidência diapausa em mosquitos-long-dia criados, embora tenha havido alguma variação entre as repetições (Tabela 2). Por exemplo, replicar SD2 mostra mais baixa (80%) a diapausa do que as repetições restantes (87,18% - 97,67%). Esta réplica também teve o menor sampl e tamanho, por isso, recomenda-se reservar um número suficiente de ovos (> 150) para a medição diapausa, a fim de obter um resultado preciso.
Post-seqüenciamento ler limpeza em uma biblioteca representante de adulto A. albopictus removido um número substancial de lê (de 83.853.322 para 52.736.065 total de lê para uma biblioteca representativa). Normalização Digital reduziu ainda mais o número de total de leituras para 41.435.934. Um conjunto de Trinity destes lê contigs gerados 76.377, com um N50 de 1879, comprimento médio de 1,023.1 contig, e um comprimento máximo contig de 20.892 (Figura 3). Analisa expressão diferencial a partir de um fluxo de trabalho semelhante de embriões cultivados sob condições de indução diapausa em 11 e 21 dias pós-oviposição reveladas 3128 genes diferencialmente expressos entre estes dois períodos de tempo (Figura 4).
/ftp_upload/51961/51961fig1highres.jpg "width =" 600px "/>
Figura 1: Fluorometria perfis de exemplo de alta qualidade (A) e de baixa qualidade (B) extrações de RNA a partir de A. albopictus. O eixo dos x representa os tamanhos dos fragmentos de nucleótidos, e o eixo y representa as leituras fluorescentes. Note-se a diferença na escala do eixo y entre os painéis (A) e (B). Arrows marcar as posições dos diferentes RNAs ribossomais. As bandas aparentes próximas à banda marcador verde indicam degradação.
Figura 2: Resumo do fluxo de trabalho de bioinformática desde a preparação ler a expressão diferencial Cada caixa representa um passo na seção bioinformática deste protocolo, acompanhada do número correspondente de cada etapa do protocolo..
Figura 3:. Histograma de comprimentos contig de um conjunto de transcriptoma novo Trinity A duração média contig é 1,023.1. Note-se que a distribuição de comprimentos contig é fortemente inclinada em direcção contigs mais curtos; isto é típico de montagem transcriptoma de novo.
Figura 4: Log 2 -fold-change vs. abundância de expressão gênica TMM normalizada de larvas diapause pharate em 11 dias contra 21 dias de pós-oviposição Cada ponto designa um UniGene;. unigenes diferencialmente expressos estão em vermelho. Unigenes com maior expressão em 11 dias após a oviposição têm valores positivos fold-change, ondecomo unigenes com maior expressão 21 dias de pós-oviposição ter valores negativos fold-mudança.
| Programa / Resource | Website URL (acessado 2014/01/13) |
| perl | http://www.perl.org/get.html |
| pitão | http://www.python.org/download/ |
| ssaha2 | http://www.sanger.ac.uk/resources/software/ssaha2/ |
| NCBI UniVec Núcleo | ftp://ftp.ncbi.nih.gov/pub/UniVec/UniVec_Core |
| SolexaQA | http://solexaqa.sourceforge.net/ |
| FastQC | http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ |
| khmer | https://github.com/ged-lab/khmer |
| Trindade | http://trinityrnaseq.sourceforge.net/ |
| Trindadescript de normalização | http://trinityrnaseq.sourceforge.net/trinity_insilico_normalization.html |
| Assemblathon 2 scripts de avaliação | https://github.com/ucdavis-bioinformatics/assemblathon2-analysis |
| + BLAST (que inclui makeblastdb e blastx) | ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/ |
| linebreak | https://code.google.com/p/linebreak/ |
| RSEM | http://deweylab.biostat.wisc.edu/rsem/ |
| Guia do Usuário do aparador | http://www.bioconductor.org/packages/2.13/bioc/vignettes/edgeR/inst/doc/edgeRUsersGuide.pdf |
| R | http://www.r-project.org/ |
| Aparador para gramados | http://www.bioconductor.org/packages/2.13/bioc/html/edgeR.html |
Tabela 1: Programas e recursos utilizados para tele bioinformática procedimentos neste protocolo. URLs estão listados para aceder facilmente a cada um dos recursos necessários neste protocolo.
| Tratamento | Repetir | Número de ovos a partir de 1º de escotilha | Número de ovos a partir de 2ª escotilha | No. embrionados, ovos não eclodidos | % Diapausa |
| SD | 1 | 10 | 0 | 68 | 87.18 |
| SD | 2 | 3 | 0 | 12 | 80.00 |
| SD | 3 | 1 | 0 | 42 | 97,67 |
| SD | 4 | 5 | 0 | 46 | 90.20 |
| SD | 5 | 6 | 0 | 79 | 92,94 |
| LD | 1 | 79 | 4 | 9 | 9,78 |
| LD | 2 | 28 | 0 | 4 | 12.50 |
| LD | 3 | 92 | 1 | 6 | 6,06 |
| LD | 4 | 30 | 0 | 5 | 14,29 |
| LD | 5 | 43 | 0 | 3 | 6,52 |
Tabela 2:. Cálculos a diapausa resultados de cinco repetições por fotoperíodo de cálculos a diapausa. O número de larvas eclodidas de dois hatchings separadas estão incluídas, assim como o número de ovos embrionados, un-chocado, todos os quais são necessários para calcular a diapausa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Este protocolo apresenta métodos para descobrir genes diferencialmente expressos, devido à photoperiodically diapausa induzida em A. albopictus. O protocolo é significativo na medida em que combina de forma única de criação do mosquito e técnicas de bioinformática para fazer todos os aspectos experimentais de um programa de fisiologia molecular acessível a usuários novatos - em especial para as que incidam sobre a resposta ao fotoperíodo diapausa. Os métodos existentes, a nosso conhecimento, não forneça o máximo de detalhes no protocolo de criação - o que muitas vezes é necessário para identificar erros de criação - nem fornecem uma visão sobre projeto experimental durante a fase de exploração, que permitirá análise bioinformática sucesso downstream. Os métodos aqui apresentados foram otimizados para A. albopictus, especialmente os métodos de criação, que geralmente levam seis semanas de uma geração de laboratório para a próxima. No entanto, em aplicações futuras este método poderia ser adaptado com modestaajustes em outras espécies de mosquitos que exibem diapause photoperiodic 23. Além disso, a concepção experimental geral e bioinformática fluxo de trabalho são aplicáveis para o estudo de outras polifenismos.
Vários pontos não detalhadas no protocolo deve ser considerado quando da criação de A. larvas albopictus. Em primeiro lugar, A. albopictus pode ser encontrado em uma grande variedade de habitats naturais e artificiais de contêineres como descrito em trabalhos anteriores 36, 37. lotes de pneus usados são uma fonte comum de larvas para o estabelecimento de colônias de laboratório. Populações recolhidos acima da latitude 32N na América do Norte pode ser esperado que exibem uma forte resposta de 13 diapausa. O A. albopictus cepa utilizada neste protocolo foi coletado de Manassas, VA, e foi criado em um laboratório por mais de oito gerações antes de manipulação experimental. Em segundo lugar, a iluminação nos gabinetes fotoperíodo deve ser escolhido com cuidado. Lâmpadas em armárioscom funções de iluminação embutidos podem causar picos de temperatura dentro do gabinete quando a iluminação for ligado ou desligado. Observação anedótica sugere que estes picos de temperatura pode atrapalhar a resposta diapausa. Para evitar isso, built-in funções de iluminação deve ser desativado e armários devem estar equipados com um 4-watt lâmpada cool-fluorescente. Em terceiro lugar, as larvas são sensíveis ao H 2 O e qualidade alimentar abundância. Portanto, o excesso de alimentação pode levar ao acúmulo de bactérias e mortalidade larval. Em quarto lugar, existem métodos alternativos aos mosquitos fêmeas blood-alimentação de adultos. Membranas de vidro são um sistema de membrana artificial alternativa 38, 39, embora o sistema HemoTek tem melhor desempenho na experiência dos autores. Animais vivos (geralmente de galinha ou de roedores) também podem ser usados 38 - neste caso, é essencial para primeiro obter a certificação apropriada de seu Animal Care Institucional e Use Committee (IACUC). Em quinto lugar, embora não haja nenhuma evidência clara publicado them ovos são fotossensíveis 15, observações circunstanciais sugerem que ovos de um cartão SD para exposições fotoperíodo ligeiramente reduzida a diapausa, quando expostos a um fotoperíodo LD no prazo de 10 dias de oviposição. Assim, armazenar ambos os ovos SD e SD LD em condições de produzir uma resposta diapause máxima nos ovos SD e evitar qualquer efeito de confusão do fotoperíodo (SD vs. LD) durante o armazenamento de ovos.
RNA de alta qualidade é essencial para a geração de dados de RNA-Seq alta qualidade. Cuidado abundante deve ser tomado durante a extração de RNA para evitar qualquer contaminação nuclease. As amostras de RNA de baixa qualidade, tal como o mostrado na figura 1B, não são adequados para sequenciação. A avaliação da qualidade RNA antes de enviar as amostras para o seqüenciamento é imperativo. Bandas características de moléculas de RNA podem ser visíveis para os diferentes tipos de tecidos de insecto utilizadas para a extracção de RNA, tais como as quatro bandas menores do 18S mostrados no RNA electroferograma alta qualidadena Figura 1A. Padrões consistentes de outros do que as duas bandas em 18S em todo amostras submetidas aos tratamentos biológicos distintos bandas de RNA pode indicar fortemente que essas bandas não resultam de degradação, mas representam composição biológica das moléculas de RNA nos tipos de tecidos específicos escolhidos no projeto experimental.
A bioinformática fluxo de trabalho descrito aqui permite que um usuário com algumas habilidades de linha de comando e de script para obter uma lista de genes diferencialmente expressos a partir de dados de sequenciamento Illumina gerados a partir de bibliotecas de RNA replicados de dois contrastantes condições experimentais. Embora este exemplo refere-se os genes diferencialmente expressos devido ao fotoperíodo, este fluxo de trabalho pode ser aplicado a qualquer desenho experimental com dois ou mais tratamentos, em qualquer organismo. Há muitas outras maneiras de chegar a uma lista de genes diferencialmente expressos; no entanto, este protocolo é provável que seja a abordagem mais simples para o usuário iniciante. Mais exbioinformatas mentado pode querer tomar medidas adicionais para melhorar a contiguidade e redundância de sua montagem. Biólogos com pouca ou nenhuma experiência de bioinformática também pode completar pelo menos parte deste gasoduto dentro do iPlant 40 Descoberta Ambiente, que é um ambiente de análise orientada livre gráfica-user-interface. É provável que a funcionalidade do iPlant vai crescer mais no futuro, a fim de acomodar pipelines de RNA-Seq completos a partir de novo assembléias transcriptoma. Finalmente, note que o Guia do Usuário do excelente completamente discute as muitas maneiras de usar facetadora 41 (Tabela 1) para análise de expressão diferencial.
Em alguns casos, mis-montagens podem gerar contigs quiméricos. Existem vários métodos que podem ajudar a identificar esses mis-conjuntos, por exemplo, Uchime 42. No entanto, a experiência do passado, o número de quimeras detectadas é extremamente baixo (<0,1%); portanto, employinga programa de detecção de quimera pode não valer a pena o esforço extra.
Processamento de alto rendimento, os dados de sequenciamento de próxima geração requer a capacidade de 1) armazenar grandes quantidades de dados (para um único projeto,> 500 Gb); 2) manipular grandes arquivos de dados que não podem ser abertos em processadores de texto tradicionais ou programas de planilha; 3) realizar análises que exigem grandes quantidades de RAM, por exemplo, para a montagem de novo; e 4) analisar grandes conjuntos de dados, através de programas dirigidos por uma interface de linha de comando (o que requer a habilidade de instalar esses programas, que muitas vezes é não-trivial), ou por meio de análise de suites com interfaces gráficas de usuário (por exemplo, Galaxy 43 ou 40 iPlant ). Pesquisadores com alguma proficiência em linha de comando Unix e uma linguagem de script vai ganhar o maior benefício do acesso a um cluster de computação local - seja Universidade de propriedade, através de um colaborador, ou adquiridos para consumo próprio laboratório. Por exemplo, o abfluxo de trabalho ove foi realizada utilizando um Macintosh propriedade do laboratório (12 núcleos, 64 GB de memória RAM, 1 TB de disco rígido), e um cluster de computação da Universidade de propriedade para a montagem Trindade. Se os recursos similares não estão disponíveis, os pesquisadores ainda pode transformar a iPlant para realizar análises em larga escala, sem nenhum custo, e com relativamente menor investimento em formação devido ao ambiente de interface gráfica. No entanto, aqueles realizar e interpretar as análises ainda precisam compreender os pressupostos de cada programa utilizado.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Incubator - Model 818 | Thermo-Scientific | 3751 | 120 V |
| Controlled environment room | Thermax Scientific | N/A | Walk-in controlled environment room built to custom specifications by Thermax Scientific Products. A larger alternative to an incubator. http://thermmax.com/ |
| Cool Fluorescent bulb | Philips | 392183 | 4 W |
| Petri Dish 100 mm x 20 mm | Fisher | 08-772-E | |
| Filter Paper 20.5 cm | Fisher | 09-803-6J | |
| 9.5 L Bucket | Plastican | Bway Products | http://www.bwayproducts.com/sites/portal/plastic-products/plastic-open-head-pails/117 |
| Utility Fabric-Mosquito Netting White | Joann | 10173292 | http://www.joann.com/utility-fabric-mosquito-netting-white/10173292.html |
| Orthopedic stockings | Albahealth | 23650-040 | product no. 081420 |
| Organic Raisins | Newman's Own | UPC: 884284040255 | |
| Oviposition cups (brown) | Fisher Scientific | 03-007-52 | The product is actually an amber 125 ml bottle that we saw the top off of. |
| Recycled Paper Towels | Seventh Generation | 30BPT120 | |
| Modular Mates Square Tupperware Set | Tupperware | http://order.tupperware.com/pls/htprod_www/coe$www.add_items | |
| Glass Grinder | Corning Incorporated | 7727-2 | These Tenbroeck tissue grinders break the eggs and release RNA into the TRI Reagent. |
| TRI Reagent | Sigma Aldrich | T9424 | Apply 1 ml TRI Reagent per 50-100 mg of tissue. Caution — this reagent is toxic. |
| TURBO DNA-free | Ambion/Life Technologies | AM1907 | This kit generates greater yield than traditional DNase treatment followed by phenol/chloroform cleanup, and it is simpler to use. |
| RNaseZap | Ambion/Life Technologies | AM9782 | Apply liberally on the bench surfaces and any equipment that might be in contact with the RNA samples. The solution is slightly alkaline/corrosive, can cause irritation and is harmful when swallowed. |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA | Place up to 12 RNA samples on one chip. |
| Hemotek Membrane Feeder | Hemotek | 5W1 | This system provides 5 feeding stations that can be used simultaneously. Includes PS5 Power Unit and Power cord; 5 FUI Feeders + Meal Reservoirs and O-rings; Plastic Plugs, Hemotek collagen feeding membrane; Temperature setting tool; and Plug extracting tool. The company's mailing address is: Hemotek Ltd; Unit 5 Union Court; Alan Ramsbottom Way; Great Harwood; Lancashire, UK; BB6 7FD; tel: +44 1254 889 307. |
| Digital Thermometer and Probe | Hemotek | MT3KFU | MicroT3 thermometer and KFU probe. This is used to set the temperature of each FUI feeding unit. |
| Chicken Whole Blood, non-sterile with Sodium Citrate | Pel-Freez Biologicals | 33130-1 | The 500 ml of blood were frozen and stored in 20 ml aliquots at -80 °C for up to 1 year. Thaw blood at room temperature for at least 1 hr before using. |
References
- Bilyk, K. T., Cheng, C. H. C. Model of gene expression in extreme cold - reference transcriptome for the high-Antarctic cryopelagic notothenioid fish Pagothenia borchgrevinki. BMC Genomics. 14, 634 (2013).
- Chapman, M. A., Hiscock, S. J., Filatov, D. A. Genomic divergence during speciation driven by adaptation to altitude. Mol. Biol. Evol. 30, 2553-2567 (2013).
- Schwarz, D., et al. Sympatric ecological speciation meets pyrosequencing: sampling the transcriptome of the apple maggot Rhagoletis pomonella. BMC Genomics. 10, 633 (2009).
- Barshis, D. J., et al. Genomic basis for coral resilience to climate change. P. Natl Acad. Sci. USA. 110, 1387-1392 (2013).
- Urbanski, J. M., Aruda, A., Armbruster, P. A. A transcriptional element of the diapause program in the Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, identified by suppressive subtractive hybridization. J. Insect Physiol. 56, 1147-1154 (2010).
- Huang, Y. H., et al. The duck genome and transcriptome provide insight into an avian influenza virus reservoir species. Nat. Genet. 45, 776-783 (2013).
- Sessions, O. M., et al. Host cell transcriptome profile during wild-type and attenuated dengue virus infection. PLoS Negl. Trop. Dis. 7 (3), 2107 (2013).
- Poelchau, M. F., Reynolds, J. A., Elsik, C. G., Denlinger, D. L., Armbruster, P. A. Deep sequencing reveals complex mechanisms of diapause preparation in the invasive mosquito, Aedes albopictus. P. R. Soc B. 280, (2013).
- Poelchau, M. F., Reynolds, J. A., Elsik, C. G., Denlinger, D. L., Armbruster, P. A. Transcriptome sequencing as a platform to elucidate molecular components of the diapause response in Aedes albopictus. Physiol. Entomol. 38, 173-181 (2013).
- Poelchau, M. F., Reynolds, J. A., Denlinger, D. L., Elsik, C. G., Armbruster, P. A. A de novo transcriptome of the Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, to identify candidate transcripts for diapause preparation. BMC Genomics. 12, 619 (2011).
- Benedict, M. Q., Levine, R. S., Hawley, W. A., Lounibos, L. P. Spread of the tiger: Global risk of invasion by the mosquito Aedes albopictus. Vector-Borne Zoonot. 7, 76-85 (2007).
- Lounibos, L. P. Invasions by insect vectors of human disease. Annu. Rev. Entomol. 47, 233-266 (2002).
- Urbanski, J. M., et al. Rapid adaptive evolution of photoperiodic response during invasion and range expansion across a climatic gradient. Am. Nat. 179, 490-500 (2012).
- Lounibos, L. P., Escher, R. L., Lourenco-de-Oliveria, R. Asymmetric evolution of photoperiodic diapause in temperate and tropical invasive populations of Aedes albopictus (Diptera Culicidae). Ann. Entomol. Soc. Am. 96, 512-518 (2003).
- Mori, A., Oda, T., Wada, Y. Studies on the egg diapause and overwintering of Aedes albopictus in Nagasaki. Trop. Med. 23, 79-90 (1981).
- Pumpuni, C. B. Factors influencing photoperiodic control of egg diapause in Aedes albopictus [dissertation]. , (1989).
- Wang, R. L. Observations on the influence of photoperiod on egg diapause in Aedes albopictus Skuse. Acta Entomol. Sinica. 15, 75-77 (1966).
- Sota, T., Mogi, M. Survival-time and resistance to desiccation of diapause and non-diapause eggs of temperate Aedes (Stegomyia) mosquitoes. Entomol. Exp. Appl. 63, 155-161 (1992).
- Reynolds, J. A., Poelchau, M. F., Rahman, Z., Armbruster, P. A., Denlinger, D. L. Transcript profiling reveals mechanisms for lipid conservation during diapause in the mosquito, Aedes albopictus. J. Insect Physiol. 58, 966-973 (2012).
- Andrewartha, H. G. Diapause in relation to the ecology of insects. Biol. Rev. 27, 50-107 (1952).
- Danks, H. V. Insect Dormancy: An Ecological Perspective. Biological Survey of Canada (Terrestrial Arthropods). , Ottowa, Canada. (1987).
- Denlinger, D. L. Regulation of diapause. Ann. Rev. Entomol. 47, 93-122 (2002).
- Rev Entomol, A. nn 59, 93-122 (2014).
- Armbruster, P. A., Conn, J. E. Geographic variation of larval growth in North American Aedes albopictus (Diptera). Culicidae). Ann. Entomol. Soc. Am. 99, 1234-1243 (2006).
- Reiter, P., Amador, M. A., Colon, N. Enhancement of the CDC ovitrap with hay infusions for daily monitoring of Aedes aegypti populations. J. Am. Mosquito Contr. Association. 7 (1), 52 (1991).
- Rezende, G. L., et al. Embryonic desiccation resistance in Aedes aegypti: presumptive role of the chitinized serosal cuticle. BMC Dev. Biol. 8, 182 (2008).
- Munstermann, L. Care and maintenance of Aedes mosquito colonies. The Molecular Biology of Insect Disease Vectors. Crampton, J., Beard, C., C, L. ouis , Springer. Netherlands. 13-20 (1997).
- Trpis, M. A new bleaching and decalcifying method for general use in zoology. Can. J. Zoolog. 48, 892-893 (1970).
- Ning, Z. M., Cox, A. J., Mullikin, J. C. SSAHA: A fast search method for large DNA databases. Genome Res. 11 (10), 1725-1729 (2001).
- Cox, M. P., Peterson, D. A., Biggs, P. J. SolexaQA: At-a-glance quality assessment of Illumina second-generation sequencing data. BMC Bioinformatics. 11, 485 (2010).
- Brown, C. T., Howe, A., Zhang, Q., Pyrkosz, A. B., Brom, T. H. A reference-free algorithm for computational normalization of shotgun sequencing data [Internet]. , Available at: http://arxiv.org/abs/1203.4802 (2012).
- Grabherr, M. G., et al. Full-length transcriptome assembly from RNA-Seq data without a reference genome. Nat. Biotechnol. 29 (7), 644-652 (2011).
- Bradnam, K. R., et al. Assemblathon 2: evaluating de novo methods of genome assembly in three vertebrate species. GigaScience. 2, 10 (2013).
- Li, B., Dewey, C. RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome. BMC Bioinformatics. 12, 323 (2011).
- White, B. N., De Lucca, F. L. Preparation and analysis of RNA. Analytical Biochemistry of Insects. Turner, R. B. , Elsevier Scientific Publishing Company. Philadelphia, PA. (1977).
- Hawley, W. A. The biology of Aedes albopictus. J. Am. Mosq. Contr. Assoc. 4, 1-39 (1988).
- Dowling, Z., Ladeau, S. L., Armbruster, P., Biehler, D., Leisnham, P. T. Socioeconomic status affect mosquito (Diptera:Culicidae) larval habitat type availability and infestation level. J. Med Entomol. 50, 764-772 (2013).
- Benedict, M. Q. Chapter 2,4,10. Bloodfeeding: Membrane apparatuses and animals. Methods in Anopheles Research. , Malaria Research and Reference Reagent Resource Center(MR4). (2010).
- Das, S., Garver, S., Ramirez, J. R., Xi, Z., Dimopolous, G. Protocol for dengue infections in mosquitoes (A. aegypti) and infection phenotype determination. J. Vis. Exp. 5 (220), (2007).
- Goff, S. A., et al. The iPlant collaborative: cyberinfrastructure for plant biology. Plant Sci. 2 (34), (2011).
- Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26, 139-140 (2010).
- Edgar, R. C., Haas, B. J., Clemente, J. C., Quince, C., Knight, R. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection. Bioinformatics. 27 (16), 2194-2220 (2011).
- Goecks, J., et al. Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences. Genome Biol. 11 (8), 86 (2010).
