Protocol
1. cría de larvas de dos A. albopictus Grupos a la edad adulta
- Establecer dos gabinetes de fotoperiodo con iluminación programable a 21 ° C para la expresión óptima diapausa 16 y una humedad relativa del 80% aproximadamente.
- Programa de un gabinete para un 16L: 8D luz: oscuridad ciclo (un no-diapausa inducir fotoperíodo LD). Establezca el segundo armario para un 8L: 16D luz: oscuridad ciclo (diapausa inducir) 13.
- 'Luces' programa al mismo tiempo en ambos gabinetes para sincronizar el tiempo circadiano entre fotoperíodos.
- Calcular la cantidad de huevos necesarios para llevar a cabo el experimento. Trate de 300-500 huevos por jaula. Al menos tres jaulas replicar diapausa y tres replicados se necesitan jaulas no diapausa para la generación de ARN. Esto asciende a aproximadamente 1,800-3,000 huevos por experimento.
- Hatch los huevos sumergiendo papeles de huevo en aproximadamente 500 ml de H2O desionizada
- Añadir <em> ca. 1 ml suspensión alimentos consistentes en comida para perros suelo y artemia lo descrito previamente 24. Cubra recipiente con malla, y mantener la malla en su lugar con una banda elástica.
- Coloque en el gabinete fotoperíodo LD durante aproximadamente 24 horas.
- Larvas nacidas de transferencia a 10 x 10 x 2 cm Petri platos llenos de ca. 90 ml de agua desionizada H 2 O.
- Mantener ca. 30 larvas por plato. Traslado larvas para limpiar platos cada 48-72 horas, por ejemplo, todos los lunes, miércoles y viernes (MWF) 24.
- RSS aproximadamente 1 ml suspensión alimentos consistentes en comida para perros suelo y artemia en agua desionizada cada MWF lo descrito previamente 24.
- Configure tres y cincuenta y siete jaulas para adultos para cada tratamiento fotoperíodo, donde cada jaula comprende una biológica replicar.
- Desde los lados opuestos de 9,5 L cubos, cortar un agujero de 10 cm por 14, y otro agujero con 15 cm de diámetro. CoVer la primera con malla. Cortar aproximadamente una longitud de pie de una media ortopédica, y la cola de un extremo alrededor del interior de el otro agujero.
- Cortar la parte de los pies de la media apagado y cierre nudo - abierto sólo cuando se necesita acceso al interior de la jaula. Para la tapa de la jaula, cortar todo el interior, dejando sólo la llanta, y sustituir el plástico interior con malla 24.
- Tenga en cuenta el fotoperiodo, replicar número, jaula fecha de inicio, y otra información relevante para el experimento con un marcador permanente en el lado de la jaula.
- Cubra el fondo de las jaulas adultos con papel de filtro húmedo. Humedezca el papel de filtro con suficiente desionizada H 2 O para aumentar la humedad local en la jaula, pero evitar el agua estancada, que puede estimular la oviposición en el papel de filtro 24. Compruebe el filtro de papel diario para el secado, re-húmedo cuando sea necesario.
- Para producir los huevos suficientes para una biblioteca de ARN, incluir al menos 100 mujeres / 9.5 L cage, con no más de 500 mosquitos por jaula.
- Recoger MWF pupas y colocar en una pequeña taza de H 2 O limpia a una densidad de no más de 50 pupas por 25 ml de H 2 O. Transferir la taza pupas a una jaula de adulto. Coloque las jaulas en el gabinete fotoperíodo respectiva - A. albopictus pupas son fotosensibles 15.
- Asegúrese de que todos los días H 2 O en vasos es limpia y clara, y quitar pupas muertas, porque la acumulación de pupas muertas puede causar una mortalidad masiva. Retire H 2 O copas después de todas las pupas emergen.
- Coloque las pasas orgánicas en la malla superior de la jaula para proporcionar azúcar para adultos surgido. Monitorear las pasas, y cambiarlos cada 3-5 días para evitar la acumulación de moho.
2. Mantenimiento de adultos para permitir el acoplamiento y la producción de huevos
- Mantener jaulas en humedad alta (aprox. 80%) por el forro del fondo de la jaula con un papel de filtro húmedo, y proporcionar acceso a las pasas no moho, como se describió anteriormente (SECTIons 1.5 y 1.9).
3. alimentan de sangre
- Prepárese para las mujeres de sangre de alimentación entre dos y seis días después de la eclosión de asegurar que las mujeres han estado expuestos a por lo menos ocho días cortos inequívocos antes de la oviposición comienza por casi 100 huevos% diapausa 14.
- Preparar el sistema de alimentación Hemotek membrana. Conecte las unidades de alimentación en la fuente de alimentación. Ajuste la temperatura de cada unidad a 37 ° C con el tornillo de ajuste. Utilice un termómetro electrónico y la sonda para medir la temperatura de la unidad de alimentación durante la calibración.
- Preparar el depósito de comida. Estire un cuadrado de membrana de colágeno de alimentación sobre la abertura del depósito de comida y seguro que con una junta tórica. Tire con cuidado las esquinas para eliminar las arrugas; recortar el exceso de membrana con unas tijeras.
NOTA: membrana de colágeno puede no funciona bien para todas las especies de mosquitos, y puede ser necesario probar varios tipos de encontrar la membrana óptimo si se trabaja con unespecies distintas de A. albopictus. Parafilm funciona bien con Culex pipiens.- Si la sangre se almacena congelada, descongelar a temperatura ambiente durante al menos 1 hora antes de usar.
- Mantenga el depósito por lo que la membrana se encuentra hacia abajo, y las bocas de llenado no compatibles estén mirando hacia arriba. Usar una pipeta de transferencia o una jeringa para llenar el depósito con aproximadamente 3 ml de sangre total de los pollos que tiene citrato de sodio como un anti-coagulante. Selle los puertos de llenado con tapones de plástico.
- Coloque el depósito preparado para el alimentador atornillándolo en el perno en la placa de transferencia de calor en la parte inferior del alimentador. Invierta el alimentador y colóquelo en la parte superior de la jaula, lado de la membrana hacia abajo, de modo que los mosquitos pueden alimentar a través de la malla de la jaula. Mantenga el alimentador en la jaula por aproximadamente 45 minutos para maximizar la alimentación.
4. Estimular la oviposición
- De cuatro a cinco días después de la harina de sangre, equipar a cada jaula con un color oscuro 50 ml chasta forrada con papel sin blanquear germinación de la semilla (papel huevo) o una toalla no blanqueada con textura de papel y llenar hasta la mitad con agua desionizada 9. Si hay más de 250 mosquitos están en una jaula, utilizar dos tazas.
NOTA: Para pequeñas jaulas o viales de una sola mujer ", la infusión de heno" en recipientes de oviposición puede aumentar la oviposición debido al olor de la flora microbiana 25.
5. Recoja y tienda Huevos
- Comenzar la recolección de huevos dentro de 4-5 días de alimentación de la sangre debido a la producción de huevos normalmente alcanza su máximo aproximadamente cinco días después de la alimentación de sangre, y luego desaparece durante la próxima semana.
- Varíe la frecuencia de recolección de huevos en las necesidades del experimento. Para propósitos generales, recoger los papeles de huevo en un horario de MWF. Retire los papeles de huevo de cada jaula y sustituir por papel nuevo. Coloque los documentos retirados recientemente en placas de Petri y se guardan en el gabinete fotoperíodo SD para evitar los efectos de confusión de almacenamiento de los huevos.
- Permitir que los papeles de huevo para re principal húmedo durante 2 días después de la oviposición para permitir la formación de la cutícula serosa, lo que aumenta la resistencia a la desecación de huevo 26.
- Colección de post Aproximadamente 48 h, huevos secos en aire libre. Secar el papel de manera que es floja y ligeramente húmedo al tacto, pero no tan húmedo que el papel esté oscuro de H 2 O o estimula la eclosión de los huevos.
NOTA: A 6,5 papel "x 4" puede tardar aproximadamente 3,5 horas para secar. Tenga cuidado de no sobre-seca papeles de huevo, ya que esto dará lugar a la desecación de huevo 27. - Reserva huevos adicionales tanto LD y SD fotoperiodos para evaluar la incidencia de la diapausa e interpretar el efecto fotoperiódico (ver Medición de diapausa, Sección 6).
- Para el almacenamiento a largo plazo, mantener los papeles de huevo a 21 ° C y aproximadamente el 80% de humedad en placas de Petri. Mantenga placas de Petri en un contenedor de almacenamiento Tupperware con un frasco de agua para mantener la humedad local como el desarrollo embrionario toma de cuatro a cinco días a 21 ° C.
- Utilice embriones reservados adicionales (ver Estimular oviposición, Sección 4) que son 7-20 días para cuantificar la respuesta diapausa.
- Anote el número de huevos presentes en cada papel huevo.
- Estimular los huevos para incubar sumergiendo completamente papeles individuales de los huevos en un plato de 90 ml Petri con aproximadamente 80 ml de H2O desionizada Añadir aproximadamente 0,25 ml de suspensión de alimentos.
- Después de 24 horas contabilizar el número de tramado larvas de primer estadio. Coloque la placa de Petri sobre una superficie de color negro para visualizar larvas y colocar una fuente de luz en un lado del plato. Las larvas se alejará de la fuente de luz, lo que permite un recuento claro de larvas individual. Retire larvas individuales con una pipeta mientras cuenta para evitar el recuento de larvas individuales.
- Papeles Place de huevo en una nueva placa de Petri y re-seco. Re-huevos eclosionan después de aproximadamente 1 semana y de nuevo coinciden huevos eclosionados utilizando el método anterior.
- Papeles Place de huevo con la u restante huevos eclosionados-n en nuevas placas de Petri de 90 ml con solución de blanqueo de aproximadamente 80 ml 28. Asegúrese de que los documentos de huevo están completamente sumergidos en la solución de blanqueo y dejan toda la noche bajo una campana de humos para evitar el olor a lejía.
NOTA: La decoloración de la solución se puede almacenar durante ~ 1 semana a 4 ° C, pero por lo demás debe ser recién hecho. - Inspeccione los huevos utilizando un microscopio de luz como el blanqueo, se borrará el corion y permitir la visualización de huevos embrionados, un-sombreada. Si se embrionados el huevo, el huevo tendrá un color blanquecino con los ojos que aparecen como dos pequeños puntos negros frente a la otra en el lado dorsal. Cuente el número de un-sombreada, huevos embrionados 13.
- Determinar la incidencia diapausa con la siguiente fórmula:% diapausa = no. huevos eclosionados-un embrionados / (no. huevos eclosionados + no. huevos embrionados de un-sombreada) x 100 13.
7. Extracción de ARN a partir de huevos / larvas pharate
ontenido "> NOTA: El uso Trizol en una campana de flujo laminar.- Huevos de mosquito cepillo contienen embriones en desarrollo o larvas pharate en puntos de tiempo de desarrollo distintos de los papeles de huevo para amoladoras de vidrio utilizando un cepillo de pelo de camello. Moler los huevos en Trizol (1 ml por 50 a 100 mg de tejido) hasta que esté completamente pulverizado. Utilice al menos 400 huevos por la biblioteca para producir suficiente ARN.
- Alternativamente, snap huevos de congelación en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C en tubos de microcentrífuga durante un máximo de un mes antes de la molienda en Trizol.
- Realizar la extracción de ARN en Trizol seguido por precipitación con isopropanol de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Tratar el banco con solución de RNasa descontaminación o otros agentes para eliminar las nucleasas residuales para evitar la degradación del ARN.
- Tratar el ARN extraído con DNasa. De acuerdo con las instrucciones del fabricante, incubar las muestras de ARN con ADNasa durante 30 min a 37 ° C. Utilice 1 y #181; l DNasa para un máximo de 10 g de ARN en una reacción de 50 l. Aumentar la cantidad de DNasa si hay más de 10 g de ARN en una reacción.
- Inactivar la DNasa añadiendo 5 l de reactivo de inactivación DNasa suspendido. Incubar 5 min a temperatura ambiente, la mezcla tres veces durante el período de incubación (vórtex suave).
- Centrifugar a 10000 xg durante 1,5 min. Transferir el sobrenadante que contiene las muestras de ARN tratados a tubos nuevos para los pasos posteriores.
- Evaluar la calidad de las muestras de ARN total por fluorometría. Enviar las muestras a un centro especializado con el instrumento adecuado para esta tarea. La instalación llevará a cabo la electroforesis en gel en el chip para determinar los tamaños de las especies de ARN en la muestra, visualizadas por tinción fluorescente inculcado en el chip. Los resultados se devuelven como un electroferograma.
- Determinar la integridad de las muestras de ARN total por la presencia o ausencia de productos de degradación, como se evidencia por la presencia of picos entre los 18S y 5S picos de ARN ribosómico en el electroferograma resultante (Figura 1B).
8. RNA Secuenciación
- Enviar muestras de ARN total con una calidad suficientemente alta (Figura 1A) y cantidad (por lo general> 3 g por biblioteca) a un centro de secuenciación comercial para la construcción de bibliotecas de ARNm enriquecido de gama emparejado y la secuencia de ARNm, siguiendo protocolos estándar.
- Si más de un carril se utiliza para la secuenciación de un solo experimento, dividir bibliotecas individuales en dos carriles para la secuenciación para dar cuenta de la variación técnica entre los carriles durante la secuenciación.
9. lllumina Leer Limpieza
NOTA: La Figura 2 resume la parte de bioinformática de este protocolo. Para obtener una lista completa de todos los programas y los recursos utilizados en la sección de bioinformática de este protocolo, consulte la Tabla 1. EnAdemás, Archivo suplementario 1 contiene ejemplos de línea de comandos para cada uno de los siguientes pasos del protocolo de bioinformática.
- Utilice SSAHA2 29 (Tabla 1) para identificar coincidencias de 95% de identidad o superior a la base de datos NCBI UniVec Core (Tabla 1), A. secuencia albopictus rRNA (GenBank # L22060.1), y adaptadores de secuenciación (ejemplos detallados de línea de comandos proporcionados en Archivo Suplementario 1). Retire pares de lectura con partidos que utilizan Perl o herramienta de scripts similares, por ejemplo, adaptando el guión Perl proporcionado (Archivo Suplementario 2).
- Clean restante lee con el paquete SolexaQA 30 (Tabla 1; Suplementario Archivo 1): recorte de regiones con un phred equivalente puntuación de menos de 20 utilizando la configuración predeterminada de DynamicTrim.pl.
- Retire lee más corto que 25 pb con LengthSort.pl tanto en avance y retroceso lee simultáneamente. Evaluar la calidad de los archivos limpiados FASTQ con FastQC (Tabla 1
10. Normalización digital
- Realice una ronda de normalización digital en el limpiado lee usando la herramienta khmer 31 (Tabla 1; Suplementario Archivo 1), específicamente normalize-by-median.py (usando tamaño k-mer 20, una cobertura de corte de 20, y x = 1e10).
- Alternativamente, si una máquina con alta memoria RAM es disponibles (cientos de GB), utilice guión normalize_by_kmer_coverage.pl de Trinidad (Tabla 1).
11. De Novo Asamblea Transcriptome
- Obtener acceso a un clúster de ordenador o computadora con hasta 256 GB de RAM y 24 CPUs, dependiendo del tamaño del conjunto.
- Utilice Trinidad 32 (Tabla 1; File Suplementaria 1) para montar la lectura digital normalizado establecido en contigs. Para reduciruso de la memoria, utilice --min_kmer_cov 2.
Evaluación Asamblea 12.
- Ejecute assemblathon_stats.pl del proyecto Assemblathon2 33 en la salida contig Trinidad. Este script realiza cálculos básicos relevantes para la evaluación de la calidad de montaje, como el número de andamios, N50, composición de montaje, y más (Tabla 1; Archivo Suplementario 1).
13. Anotación del transcriptoma Montado
- Realizar Blastx (Tabla 1) del conjunto frente a un conjunto de proteínas de referencia; para los mosquitos, Drosophila melanogaster, Anopheles gambiae, Culex pipiens, y Aedes aegypti son las referencias adecuadas. En concreto, formatee el archivo fasta proteína de referencia para la explosión, seguida de blastx (Archivo Suplementario 1).
14. Mapa lee a la Asamblea Usando RSEM 34 (Tabla 1)
- Crear un archivo de 'transcripción de genes de ruta », en la que elprimera columna contiene los identificadores de genes de referencia, y la segunda columna los IDs contig. En un editor de hoja de cálculo, intercambiar las primera y segunda columnas de la salida Blastx, y escribir estas columnas en un archivo .txt. Utilice el programa LineBreak para convertir los saltos de línea en el archivo .txt resultante a formato Unix.
- Crear un conjunto de datos de referencia a partir del archivo fasta transcriptoma mediante el script rsem-preparar-referencia, incluida en el envase RSEM (Archivo Suplementario 1).
- Calcular los valores de expresión por separado para cada biblioteca con el comando rsem a calcular la expresión personal, incluida en el envase RSEM (Archivo Suplementario 1). Como lee, utilizar los archivos emparejados FASTQ resultantes de la etapa de limpieza de lectura (paso 9.2).
- Si ARN a partir de una réplica biológica se dividió en dos carriles para la secuenciación, incluir ambos archivos FASTQ en el cálculo de la expresión para generar un único archivo.
- Convertir los resultados de la expresión de cada biblioteca a una matriz fácilmente procesada por otra programas mediante el script rsem-generar-data-matriz proporcionada, incluida en el envase RSEM (Archivo Suplementario 1).
15. Análisis de la expresión diferencial
- Instale R y bordeadora (Tabla 1).
- Utilice read.delim para cargar los resultados RSEM de paso 14.3 (Archivo Suplementario 1). Si es necesario, completar los recuentos al entero más cercano.
NOTA: La guía bordeadora recomienda limitar el conjunto de datos de genes con alta expresión suficiente para detectar significado. - Para dar formato a los datos para bordeadora, generar un objeto DGEList del archivo de datos cargado (Archivo Suplementario 1). Entonces, normalizar los datos mediante TMM normalización (Archivo Suplementario 1). Estimar las dispersiones comunes y tagwise de los datos (archivos Suplementario 1).
- Identificar los genes expresados diferencialmente con un Benjamini-Hochberg corregido valor de p <0,05 (Archivo Suplementario 1). Trazar la distribución de log-pliegue de cambio frente a la abundancia (Archivo Suplementario 1).
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Representative Results
Fluorometría de dos muestras de ARN representativos mostró dos bandas a aproximadamente 2000 nt (Figura 1A, B). El 28S ribosomal RNA de insectos se compone de dos cadenas de polinucleótidos se mantienen unidos por enlaces de hidrógeno, que son fácilmente interrumpido por calentamiento o agentes que interrumpen los enlaces de hidrógeno 35 breve. Los dos componentes resultantes son aproximadamente el mismo tamaño que el ARN ribosomal 18S. La segunda muestra de ARN mostró altos niveles de degradación (Figura 1B).
Tratamiento fotoperiódico de un grupo representativo de A. mosquitos albopictus resultaron en alta incidencia diapausa en los mosquitos criados de día corto-y baja incidencia diapausa en los mosquitos criados largo día-aunque hubo algunas variaciones entre los distintos recipientes (Tabla 2). Por ejemplo, replicar SD2 muestra inferior (80%) la incidencia diapausa que las repeticiones restantes (87,18% - 97,67%). Esta réplica también tuvo la sampl más pequeño tamaño de correo, por lo que se recomienda reservar un número suficiente de huevos (> 150) para la medición de la diapausa con el fin de obtener un resultado preciso.
Post-secuenciación leer la limpieza en una biblioteca representante de adulto A. hembras albopictus extirparon un número sustancial de lecturas (de 83.853.322 a 52.736.065 lee total para una biblioteca representativa). Normalización digital reduce aún más el número de total de lee a 41.435.934. Un conjunto de Trinidad de estas lecturas generó 76.377 contigs, con un N50 de 1879, la duración media de contig de 1,023.1, y una longitud máxima de 20.892 contig (Figura 3). Expresión diferencial analiza desde un flujo de trabajo similar de los embriones han sido criados en diapausa que inducen a los 11 y 21 días después de la oviposición reveló 3.128 genes expresados diferencialmente entre estos dos períodos de tiempo (Figura 4).
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Figura 1: Fluorometría perfiles de ejemplo de alta calidad (A) y de baja calidad (B) las extracciones de ARN a partir de A. albopictus. El eje x representa los tamaños de los fragmentos de nucleótidos, y el eje y representa las lecturas fluorescentes. Tenga en cuenta la diferencia en la escala del eje y entre los paneles (A) y (B). Las flechas marcan las posiciones de los distintos ARN ribosomal. Las aparentes bandas cercanas a la banda del marcador verde indican degradación.
Figura 2: Resumen del flujo de trabajo de bioinformática de la preparación para leer la expresión diferencial Cada cuadro representa un paso en la sección de bioinformática de este protocolo, acompañado por el número correspondiente de cada paso del protocolo..
Figura 3:. Histograma de longitudes de contig de un novo asamblea transcriptoma Trinidad La duración media contig es 1,023.1. Tenga en cuenta que la distribución de longitudes de contig está fuertemente sesgada hacia contigs más cortos; esto es típico de montaje de novo transcriptoma.
Figura 4: Iniciar 2 -fold cambio frente a la abundancia de TMM-normalizado la expresión génica de las larvas pharate diapausa a los 11 días frente a 21 días después de oviposición Cada punto designa un unigene;. unigenes expresados diferencialmente están en rojo. Unigenes con mayor expresión a los 11 días post-oviposición tienen valores de veces de cambio positivas, dondecomo unigenes con una expresión más alta 21 días después de oviposición tienen valores negativos veces de cambio.
| Programa / Recurso | URL del sitio web (consultado el 13/01/2014) |
| perl | http://www.perl.org/get.html |
| pitón | http://www.python.org/download/ |
| SSAHA2 | http://www.sanger.ac.uk/resources/software/ssaha2/ |
| NCBI UniVec Core | ftp://ftp.ncbi.nih.gov/pub/UniVec/UniVec_Core |
| SolexaQA | http://solexaqa.sourceforge.net/ |
| FastQC | http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ |
| khmer | https://github.com/ged-lab/khmer |
| Trinidad | http://trinityrnaseq.sourceforge.net/ |
| Trinidadguión normalización | http://trinityrnaseq.sourceforge.net/trinity_insilico_normalization.html |
| Assemblathon 2 guiones de evaluación | https://github.com/ucdavis-bioinformatics/assemblathon2-analysis |
| BLAST + (que incluye makeblastdb y BLASTX) | ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/ |
| linebreak | https://code.google.com/p/linebreak/ |
| RSEM | http://deweylab.biostat.wisc.edu/rsem/ |
| Guía del Usuario bordeadora | http://www.bioconductor.org/packages/2.13/bioc/vignettes/edgeR/inst/doc/edgeRUsersGuide.pdf |
| R | http://www.r-project.org/ |
| Bordeadora | http://www.bioconductor.org/packages/2.13/bioc/html/edgeR.html |
Tabla 1: Programas y recursos utilizados para tél Bioinformática procedimientos en este protocolo. vínculos URL para acceder fácilmente a cada uno de los recursos que se necesitan en este protocolo.
| Tratamiento | Replicar | Número de huevos desde el 1 de escotilla | Número de huevos de 2º escotilla | No. embrionados, los huevos no eclosionados | % Diapausa |
| SD | 1 | 10 | 0 | 68 | 87.18 |
| SD | 2 | 3 | 0 | 12 | 80.00 |
| SD | 3 | 1 | 0 | 42 | 97.67 |
| SD | 4 | 5 | 0 | 46 | 90.20 |
| SD | 5 | 6 | 0 | 79 | 92.94 |
| LD | 1 | 79 | 4 | 9 | 9.78 |
| LD | 2 | 28 | 0 | 4 | 12.50 |
| LD | 3 | 92 | 1 | 6 | 6.06 |
| LD | 4 | 30 | 0 | 5 | 14.29 |
| LD | 5 | 43 | 0 | 3 | 6.52 |
Tabla 2:. Cálculos de incidencia diapausa Resultados de cinco repeticiones por fotoperíodo de cálculos de incidencia diapausa. El número de larvas incubadas a partir de dos incubaciones separadas se incluyen, como son el número de huevos embrionados, un-rayada, todos los cuales son necesarios para calcular la incidencia diapausa.
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Discussion
Este protocolo se presentan métodos para descubrir los genes expresados diferencialmente debido a fotoperiódicas diapausa inducida en A. albopictus. El protocolo es importante porque combina de forma única cría de mosquitos y técnicas de bioinformática para hacer todos los aspectos experimentales de un programa de fisiología molecular accesible para los usuarios novatos - en particular para los que se centran en la respuesta diapausa photoperiodic. Los métodos existentes, hasta donde sabemos, no proporcionan el mayor detalle en el protocolo de crianza - que a menudo es necesario identificar los errores de crianza - ni proporcionan una visión sobre el diseño experimental, durante la fase de cría que permitirá el análisis bioinformático exitosa aguas abajo. Los métodos presentados aquí han sido optimizados para A. albopictus, especialmente los métodos de cría, que generalmente toman seis semanas a partir de una generación de laboratorio a otro. Sin embargo, en aplicaciones futuras este método podría ser adaptado con un modestoajustes a otras especies de mosquitos que exhiben diapausa photoperiodic 23. Además, el diseño experimental general y la bioinformática flujo de trabajo son aplicables al estudio de otros polyphenisms.
Varios puntos que no se detallan en el protocolo deben ser considerados cuando la crianza A. larvas albopictus. En primer lugar, A. albopictus se puede encontrar en una amplia variedad de hábitats de contenedores naturales y artificiales, como se describe en los documentos anteriores 36, 37. un montón de neumáticos usados son una fuente común de larvas para el establecimiento de colonias de laboratorio. Poblaciones recogidos por encima de latitud 32N en América del Norte se puede esperar que exhibir una fuerte respuesta diapausa 13. La A. albopictus cepa utilizada en este protocolo se recogió de Manassas, VA, y fue criado en un ambiente de laboratorio por más de ocho generaciones antes de la manipulación experimental. En segundo lugar, la iluminación en los gabinetes de fotoperiodo se debe elegir con cuidado. Bombillas en los gabinetescon funciones de alumbrado incorporadas pueden causar picos de temperatura dentro del gabinete cuando la iluminación se enciende o apaga. Observación anecdótica sugiere que estos picos de temperatura pueden alterar la respuesta diapausa. Para evitar esto, las funciones integradas de iluminación deben ser desactivados y gabinetes deben estar equipados con un 4 vatios bombilla fresca fluorescente. En tercer lugar, las larvas son sensibles a H2O calidad y abundancia de alimentos. Por lo tanto, la lactancia más puede conducir a la acumulación de bacterias y la mortalidad de las larvas. En cuarto lugar, hay métodos alternativos a la sangre de alimentación de adultos hembras de los mosquitos. Membranas de vidrio son un sistema de membrana artificial alternativa 38, 39, aunque el sistema HemoTek se comporta mejor en la experiencia de los autores. Animales vivos (generalmente pollo o roedores) también se pueden usar 38 - en este caso, es esencial para obtener la primera certificación apropiada de su Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC). En quinto lugar, aunque no hay ninguna evidencia publicada claro ésimoen los huevos son fotosensibles 15, observaciones anecdóticas sugieren que los huevos de una exposición tratamiento fotoperíodo SD redujeron ligeramente incidencia diapausa cuando se expone a un fotoperíodo LD dentro de los 10 días de la oviposición. Por lo tanto, almacenar tanto los huevos SD y LD bajo condiciones estándar para producir una respuesta máxima en diapausa los huevos SD y evitar cualquier efecto de confusión de fotoperíodo (SD vs. LD) durante el almacenamiento del huevo.
De alta calidad del ARN es esencial para la generación de datos de RNA-Seq alta calidad. Abundante cuidado se debe tomar durante la extracción de ARN para evitar cualquier contaminación nucleasa. Muestras de RNA de calidad baja, tal como la que se muestra en la Figura 1B, no son apropiadas para la secuenciación. La evaluación de la calidad del ARN antes de enviar las muestras para la secuenciación es imprescindible. Bandas características de las moléculas de ARN pueden ser visibles para diferentes tipos de tejidos de insectos utilizados para la extracción de ARN, tales como las cuatro bandas más pequeñas de 18S que se muestran en el electroferograma de ARN de alta calidaden la Figura 1A. Patrones consistentes de bandas de ARN distintos de las dos bandas a través de 18S muestras bajo tratamientos biológicos distintos indican puede fuertemente que estas bandas no resultan de la degradación, pero representan composición biológica de las moléculas de ARN en los tipos de tejidos específicos elegidos en el diseño experimental.
El flujo de trabajo de bioinformática descrito aquí permite a un usuario con algunas habilidades de línea de comandos y secuencias de comandos para obtener una lista de genes expresados diferencialmente a partir de datos de secuenciación de Illumina generados a partir de las bibliotecas de ARN replicados desde dos contrastantes condiciones experimentales. Aunque este ejemplo se refiere a genes expresados diferencialmente debido a fotoperíodo, este flujo de trabajo se puede aplicar a cualquier diseño experimental con dos o más tratamientos, en cualquier organismo. Hay muchas otras maneras de llegar a una lista de genes expresados diferencialmente; Sin embargo, este protocolo es probable que sea el método más sencillo para el usuario principiante. Más exbioinformáticos experimenté lo desea, puede tomar medidas adicionales para mejorar la contigüidad y la redundancia de su asamblea. Los biólogos con poca o ninguna experiencia bioinformática también puede completar al menos parte de esta tubería dentro de la iPlant 40 Descubrimiento del Medio Ambiente, que es un país libre gráfica de usuario-interfaz entorno de análisis conducido. Es probable que la funcionalidad de iPlant crecerá más en el futuro con el fin de dar cabida a las tuberías llenas de RNA-Seq de novo asambleas transcriptoma. Por último, cabe destacar que la Guía del usuario de excelente analiza a fondo las muchas maneras de utilizar bordeadora 41 (Tabla 1) para el análisis de la expresión diferencial.
En algunos casos, mis-conjuntos pueden generar contigs quiméricos. Hay varios métodos que pueden ayudar a identificar estos mis-asambleas, por ejemplo, Uchime 42. Sin embargo, a partir de la experiencia pasada, el número de quimeras detectadas es muy bajo (<0,1%); Por lo tanto, employinga programa de detección quimera puede no valer la pena el esfuerzo extra.
El procesamiento de alto rendimiento, los datos de secuenciación de próxima generación requiere la capacidad de 1) almacenar grandes cantidades de datos (para un solo proyecto,> 500 Gb); 2) manipular grandes archivos de datos que no se pueden abrir en los procesadores de texto tradicionales o programas de hojas de cálculo; 3) realizar análisis que requieren grandes cantidades de memoria RAM, por ejemplo, para el montaje de novo; y 4) analizar grandes conjuntos de datos, ya sea a través de programas impulsados por una interfaz de línea de comandos (que requiere la capacidad de instalar estos programas, que a menudo no trivial), o por medio de análisis de suites con interfaces gráficas de usuario (por ejemplo, la galaxia de 43 o 40 iPlant ). Los investigadores con cierta habilidad en la línea de comandos de Unix y un lenguaje de script obtendrán el mayor beneficio de acceso a un cluster de computación locales - ya sea propiedad de la Universidad, a través de un colaborador, o comprado para su propio laboratorio. Por ejemplo, el abflujo de trabajo ove se realizó utilizando un Macintosh de propiedad de laboratorio (12 núcleos, 64 GB de memoria RAM, disco duro de 1 TB), y un grupo de computadoras de propiedad de la Universidad para el montaje Trinidad. Si los recursos similares no están disponibles, los investigadores todavía pueden llegar a iPlant para realizar análisis a gran escala, sin costo alguno, y con una inversión relativamente baja en el entrenamiento debido al entorno de interfaz gráfica. Sin embargo, aquellos realización e interpretación de los análisis todavía necesitan entender los supuestos de cada programa utilizado.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Incubator - Model 818 | Thermo-Scientific | 3751 | 120 V |
| Controlled environment room | Thermax Scientific | N/A | Walk-in controlled environment room built to custom specifications by Thermax Scientific Products. A larger alternative to an incubator. http://thermmax.com/ |
| Cool Fluorescent bulb | Philips | 392183 | 4 W |
| Petri Dish 100 mm x 20 mm | Fisher | 08-772-E | |
| Filter Paper 20.5 cm | Fisher | 09-803-6J | |
| 9.5 L Bucket | Plastican | Bway Products | http://www.bwayproducts.com/sites/portal/plastic-products/plastic-open-head-pails/117 |
| Utility Fabric-Mosquito Netting White | Joann | 10173292 | http://www.joann.com/utility-fabric-mosquito-netting-white/10173292.html |
| Orthopedic stockings | Albahealth | 23650-040 | product no. 081420 |
| Organic Raisins | Newman's Own | UPC: 884284040255 | |
| Oviposition cups (brown) | Fisher Scientific | 03-007-52 | The product is actually an amber 125 ml bottle that we saw the top off of. |
| Recycled Paper Towels | Seventh Generation | 30BPT120 | |
| Modular Mates Square Tupperware Set | Tupperware | http://order.tupperware.com/pls/htprod_www/coe$www.add_items | |
| Glass Grinder | Corning Incorporated | 7727-2 | These Tenbroeck tissue grinders break the eggs and release RNA into the TRI Reagent. |
| TRI Reagent | Sigma Aldrich | T9424 | Apply 1 ml TRI Reagent per 50-100 mg of tissue. Caution — this reagent is toxic. |
| TURBO DNA-free | Ambion/Life Technologies | AM1907 | This kit generates greater yield than traditional DNase treatment followed by phenol/chloroform cleanup, and it is simpler to use. |
| RNaseZap | Ambion/Life Technologies | AM9782 | Apply liberally on the bench surfaces and any equipment that might be in contact with the RNA samples. The solution is slightly alkaline/corrosive, can cause irritation and is harmful when swallowed. |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA | Place up to 12 RNA samples on one chip. |
| Hemotek Membrane Feeder | Hemotek | 5W1 | This system provides 5 feeding stations that can be used simultaneously. Includes PS5 Power Unit and Power cord; 5 FUI Feeders + Meal Reservoirs and O-rings; Plastic Plugs, Hemotek collagen feeding membrane; Temperature setting tool; and Plug extracting tool. The company's mailing address is: Hemotek Ltd; Unit 5 Union Court; Alan Ramsbottom Way; Great Harwood; Lancashire, UK; BB6 7FD; tel: +44 1254 889 307. |
| Digital Thermometer and Probe | Hemotek | MT3KFU | MicroT3 thermometer and KFU probe. This is used to set the temperature of each FUI feeding unit. |
| Chicken Whole Blood, non-sterile with Sodium Citrate | Pel-Freez Biologicals | 33130-1 | The 500 ml of blood were frozen and stored in 20 ml aliquots at -80 °C for up to 1 year. Thaw blood at room temperature for at least 1 hr before using. |
References
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