Un Experimental y Protocolo Bioinformática para análisis de ARN-ss de fotoperiódica diapausa en el Mosquito Tigre Asiático, Aedes albopictus

Resumen

Los análisis de RNA-Seq son cada vez más importantes para identificar los fundamentos moleculares de los rasgos adaptativos en organismos no modelo. Aquí, se describe un protocolo para identificar genes expresados diferencialmente entre mosquitos Aedes albopictus en diapausa y no diapausa, desde la cría de mosquitos, hasta la secuenciación de ARN y análisis bioinformáticos de datos de RNA-Seq.

Resumen

La diapausa fotoperiódica es una adaptación importante que permite a los individuos escapar de los duros entornos estacionales a través de una serie de cambios fisiológicos, entre los que destacan la detención del desarrollo y la reducción del metabolismo. El perfil global de expresión génica a través de RNA-Seq puede proporcionar información importante sobre los mecanismos transcripcionales de la diapausa fotoperiódica. El mosquito tigre asiático, Aedes albopictus, es un organismo destacado para el estudio de las bases transcripcionales de la diapausa debido a su facilidad de crianza, diapausa fácilmente inducida y los recursos genómicos disponibles. Este manuscrito presenta un flujo de trabajo experimental general para identificar las diferencias transcripcionales inducidas por diapausa en A. albopictus. Se documentan las técnicas de cría, las condiciones necesarias para inducir el desarrollo de diapausa y no diapausa, los métodos para estimar el porcentaje de diapausa en una población, la extracción de ARN y la evaluación de la integridad de los mosquitos. Un flujo de trabajo para procesar datos de RNA-Seq de los secuenciadores Illumina culmina en una lista de genes expresados diferencialmente. Los resultados representativos demuestran que este protocolo puede ser utilizado para identificar de manera efectiva genes regulados diferencialmente a nivel transcripcional en A. albopictus debido a diferencias fotoperiódicas. Con ajustes modestos, este flujo de trabajo se puede adaptar fácilmente para estudiar las bases transcripcionales de la diapausa u otros rasgos importantes de la historia de vida en otros mosquitos.

Introducción

Los rápidos avances en las tecnologías de secuenciación de próxima generación (NGS) están proporcionando oportunidades emocionantes para sondear los fundamentos moleculares de una amplia gama de adaptaciones ecológicas genéticamente complejas en una amplia diversidad de organismos no modelo^1–3. Este enfoque es extremadamente poderoso porque establece una base para los estudios de genómica funcional y de poblaciones de organismos con una ecología o historia evolutiva especialmente interesante y/o bien descrita, así como de organismos de interés práctico, como plagas agrícolas y vectores de enfermedades. Por lo tanto, las tecnologías NGS....

Protocolo

1. cría de larvas de dos A. albopictus Grupos a la edad adulta

1. Establecer dos gabinetes de fotoperiodo con iluminación programable a 21 ° C para la expresión óptima diapausa ¹⁶ y una humedad relativa del 80% aproximadamente.
   1. Programa de un gabinete para un 16L: 8D luz: oscuridad ciclo (un no-diapausa inducir fotoperíodo LD). Establezca el segundo armario para un 8L: 16D luz: oscuridad ciclo (diapausa inducir) ^13.
   2. 'Luces' programa al mismo tiempo en ambos gabinetes para sincronizar el tiempo circadiano entre fotoperíodos.
2. Calcular la cantidad de huevos necesarios para llevar a cab....

Resultados

Fluorometría de dos muestras de ARN representativos mostró dos bandas a aproximadamente 2000 nt (Figura 1A, B). El 28S ribosomal RNA de insectos se compone de dos cadenas de polinucleótidos se mantienen unidos por enlaces de hidrógeno, que son fácilmente interrumpido por calentamiento o agentes que interrumpen los enlaces de hidrógeno ³⁵ breve. Los dos componentes resultantes son aproximadamente el mismo tamaño que el ARN ribosomal 18S. La segunda muestra de ARN mostró altos niveles de degrad.......

Discusión

Este protocolo se presentan métodos para descubrir los genes expresados ​​diferencialmente debido a fotoperiódicas diapausa inducida en A. albopictus. El protocolo es importante porque combina de forma única cría de mosquitos y técnicas de bioinformática para hacer todos los aspectos experimentales de un programa de fisiología molecular accesible para los usuarios novatos - en particular para los que se centran en la respuesta diapausa photoperiodic. Los métodos existentes, hasta donde sabemos, no proporcionan .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Incubadora - Modelo 818	Thermo-Scientific	3751	120 V
Sala de ambiente controlado	Thermax Scientific	N/A	Sala de ambiente controlado construida según especificaciones personalizadas por Thermax Scientific Products. Una alternativa más grande a una incubadora. http://thermmax.com/
Cool Bombilla fluorescente	Philips	392183	4 W
Placa de Petri 100 mm x 20 mm	Fisher	08-772-E
Papel de filtro 20,5 cm	Fisher	09-803-6J
Cubo de 9,5 L Plastican		Bway Productos	http://www.bwayproducts.com/sites/portal/plastic-products/plastic-open-head-pails/117
Utility Tela-Mosquitera blanca	Joann	10173292	http://www.joann.com/utility-fabric-mosquito-netting-white/10173292.html
Medias ortopédicas	Albahealth	23650-040	N.º de producto 081420
Pasas orgánicas	Newman's Own	UPC: 884284040255
Copas de oviposición (marrón)	Fisher Scientific	03-007-52	El producto es en realidad una botella ámbar de 125 ml de la que vimos la tapa.
Toallas de papel recicladas	séptima generación	30BPT120
Modular Mates Square Tupperware Set	Tupperware		http://order.tupperware.com/pls/htprod_www/coe$www.add_items
Molinillo de vidrio	Corning Incorporated	7727-2	Estos molinillos de papel tisú Tenbroeck rompen los huevos y liberan ARN en el reactivo TRI.
Reactivo TRI	Sigma Aldrich	T9424	Aplicar 1 ml de Reactivo TRI por cada 50-100 mg de tejido. Precaución — Este reactivo es tóxico.
TURBO Libre de ADN	Ambion/Life Technologies	AM1907	Este kit genera un mayor rendimiento que el tratamiento tradicional con DNasa seguido de limpieza con fenol/cloroformo, y es más fácil de usar.
RNaseZap	Ambion/Life Technologies	AM9782	Aplicar generosamente sobre las superficies del banco y cualquier equipo que pueda estar en contacto con las muestras de ARN. La solución es ligeramente alcalina/corrosiva, puede causar irritación y es dañina cuando se ingiere.
2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2939AA	Coloque hasta 12 muestras de ARN en un chip.
Alimentador de membrana Hemotek	Hemotek	5W1	Este sistema proporciona 5 estaciones de alimentación que se pueden utilizar simultáneamente. Incluye unidad de alimentación PS5 y cable de alimentación; 5 alimentadores FUI + depósitos de harina y juntas tóricas; Tapones de plástico, membrana de alimentación de colágeno Hemotek; Herramienta de ajuste de temperatura; y Herramienta de extracción de tapones. La dirección postal de la empresa es: Hemotek Ltd; Unidad 5 Tribunal de la Unión; Alan Ramsbottom Way; Gran Harwood; Lancashire, Reino Unido; BB6 7FD; Tel: +44 1254 889 307.
Termómetro digital y sonda	Hemotek	MT3KFU	Termómetro MicroT3 y sonda KFU. Se utiliza para ajustar la temperatura de cada unidad de alimentación FU
Sangre entera de pollo, no estéril con citrato de sodio	Pel-Freez Biologicals	33130-1	Los 500 ml de sangre se congelaron y almacenaron en alícuotas de 20 ml a -80 ° C hasta por 1 año. Descongele la sangre a temperatura ambiente durante al menos 1 hora antes de usarla.

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