Protocol
1. élevage de larves de deux A. Groupes albopictus vers l'âge adulte
- Placer les deux armoires de photopériode avec éclairage programmable à 21 ° C pour l'expression de la diapause optimale 16 et environ 80% d'humidité relative.
- Programme une armoire pour un 16L: la lumière 8D: cycle d'obscurité (un non-diapause induire LD photopériode). Réglez le second cabinet pour un 8L: 16D lumière: cycle d'obscurité (diapause induire) 13.
- «Lumières» du programme en même temps dans les deux armoires pour synchroniser l'heure circadien entre photopériodes.
- Calculer la quantité d'oeufs nécessaires pour réaliser l'expérience. But pour 300 à 500 œufs par cage. Au moins trois répliquer cages de diapause et trois répliquer cages non-diapause sont nécessaires pour la production d'ARN. Cela donne un total d'environ 1,800-3,000 œufs par expérience.
- Hatch les œufs en submergeant les papiers d'œufs dans environ 500 ml de H 2 O. déminéralisée
- Ajouter <em> ca. 1 ml alimentaire coulis composé de nourriture pour chien au sol et les crevettes de saumure comme décrit précédemment 24. Couvrir le récipient avec la maille, et de garder le maillage en place avec une bande de caoutchouc.
- Placez dans le cabinet LD photopériode pendant environ 24 heures.
- Transfert larves écloses à 10 x 10 x 2 cm boîtes de Petri remplies de ca. 90 ml d'eau désionisée H 2 O.
- Maintenir environ 30 larves par boîte. Transfert larves pour nettoyer tous les plats de 48 à 72 h, par exemple chaque lundi, mercredi et vendredi (MWF) 24.
- RSS environ 1 ml alimentaire coulis composé de nourriture pour chien au sol et les crevettes de saumure dans l'eau déminéralisée chaque MWF comme décrit précédemment 24.
- Mettre en place trois à quatre cages d'adultes pour chaque traitement de photopériode, où chaque cage comporte une réplique biologique.
- De part et d'autre de 9,5 L seaux, découper un trou de 10 par 14 cm, et un autre trou avec 15 cm de diamètre. CoVer la première avec la maille. Couper environ une longueur de pied d'un chausson orthopédique, et coller une extrémité autour de l'intérieur de l'autre trou.
- Couper l'extrémité de pied de la chaussette et le noeud de fermeture - ouvert uniquement lorsque l'accès à l'intérieur de la cage est nécessaire. Pour le couvercle de la cage, couper tous de l'intérieur, ne laissant que la jante, et remplacer le plastique intérieur avec maille 24.
- Notez la photopériode, répliquer nombre, cage date de début, et autres informations pertinentes à l'expérience avec un marqueur permanent sur le côté de la cage.
- Tapisser le fond des cages adultes avec du papier filtre humide. Humidifiez le papier filtre avec suffisamment déminéralisée H 2 O pour augmenter l'humidité locale dans la cage, mais il faut éviter l'eau stagnante, qui peut stimuler la ponte sur le papier filtre 24. Vérifiez le papier de filtre tous les jours pour le séchage, re-humide si nécessaire.
- Pour produire suffisamment d'ovocytes pour une bibliothèque d'ARN, comprendre au moins 100 femelles / 9,5 L cage, avec pas plus de 500 moustiques par cage.
- Recueillir pupes MWF et le placer dans une petite tasse de H 2 O propres à une densité de pas plus de 50 pupes par 25 ml H 2 O. Transférer la tasse de pupes à une cage d'adulte. La place des cages dans l'armoire de la photopériode respective - A. albopictus pupes sont photosensibles 15.
- Assurer quotidienne que H 2 O dans des gobelets est propre et claire, et retirez pupes morts, parce que l'accumulation de pupes mort peut causer une mortalité massive. Retirer H 2 O tasses après toutes pupes émergent.
- Placez raisins organiques sur la maille haut de la cage de fournir sucre pour adultes émergés. Surveiller les raisins secs, et de les changer tous les 3-5 jours pour éviter l'accumulation de moule.
2. Maintien de la adultes pour autoriser accouplement et la production d'oeufs
- Maintenir cages à une humidité élevée (env. 80%) en alignant le fond de la cage avec un papier filtre humide, et donner accès à des raisins secs non moisis, comme décrit ci-dessus (Sections 1,5 et 1,9).
3. sang maternel
- Préparez-vous à des femelles de sang-alimentation entre deux à six jours après l'éclosion afin de se assurer que les femmes ont été exposés à au moins huit jours courts sans ambiguïté avant la ponte commence pour près de 100% des oeufs de diapause 14.
- Préparez le système d'alimentation Hemotek membrane. Branchez les unités d'alimentation dans l'alimentation. Régler la température de chaque unité à 37 ° C en utilisant la vis de réglage. Utilisez un thermomètre électronique et la sonde pour mesurer la température de l'unité d'alimentation pendant l'étalonnage.
- Préparer le réservoir de repas. Tendez un carré de membrane de collagène d'alimentation sur l'ouverture du réservoir de repas et le fixer avec un joint torique. Retirez soigneusement les coins pour enlever les rides; couper la membrane avec des ciseaux.
REMARQUE: membrane de collagène peut ne pas fonctionner bien pour toutes les espèces de moustiques, et il peut être nécessaire d'essayer plusieurs types de trouver la membrane optimale si l'on travaille avec unespèces autres que A. albopictus. Parafilm fonctionne bien avec Culex pipiens.- Si le sang est conservé congelé, décongeler à la température ambiante pendant au moins 1 heure avant de l'utiliser.
- Maintenez le réservoir de sorte que la membrane est orientée vers le bas, et les ports de remplissage non pris en charge sont vers le haut. Utiliser une pipette de transfert ou d'une seringue pour remplir le réservoir avec environ 3 ml de sang total provenant de poulets qui a le citrate de sodium comme un anti-coagulant. Sceller orifices de remplissage avec des bouchons en plastique.
- Fixer le réservoir au dispositif d'alimentation préparé en le vissant sur la tige sur la plaque de transfert de chaleur sur le fond de la mangeoire. Inversez le chargeur et placez-le sur le dessus de la cage, côté de la membrane vers le bas, de sorte que les moustiques peuvent se nourrir à travers les mailles de la cage. Gardez le chargeur sur la cage pendant environ 45 min pour maximiser l'alimentation.
4. Stimuler ponte
- Quatre à cinq jours après la farine de sang, d'équiper chaque cage avec une couleur foncée 50 ml cjusqu'à recouverte de papier non blanchi de germination des graines (de papier d'oeuf) ou texturé serviette en papier non blanchi et remplir à moitié avec de l'eau déminéralisée neuf. Si plus de 250 moustiques sont dans une cage, utilisez deux tasses.
NOTE: Pour de petites cages ou des flacons seule femelle, «infusion de foin" dans des récipients de ponte peut augmenter la ponte en raison de l'odeur de la flore microbienne 25.
5. recueillir et stocker des oeufs
- Commencer la collecte des œufs dans les 4-5 jours d'alimentation de sang parce que la production d'œufs généralement des pics d'environ cinq jours après le repas de sang, puis se apaise la semaine prochaine.
- Variez oeuf fréquence de la collecte sur les nécessités de l'expérience. À des fins générales, recueillir des documents d'oeufs sur un calendrier de MWF. Retirer les papiers d'œufs de chaque cage et le remplacer par du papier neuf. Placez articles récemment enlevés dans des boîtes de Pétri et magasin en SD photopériode armoire pour éviter les effets de confusion de stockage des œufs.
- Permettre aux documents d'œufs de re principale humide pendant 2 jours post-ponte pour permettre la formation séreuse cuticule, ce qui augmente la résistance à la dessiccation des œufs 26.
- Après le prélèvement d'environ 48 h, oeufs secs en plein air. Sécher le papier tel qu'il est mou et légèrement humide au toucher, mais pas si humide que le papier est sombre à partir de H 2 O ou stimule l'éclosion des oeufs.
NOTE: A 6.5 "x 4" papier peut prendre environ 3,5 heures pour sécher. Soyez prudent de ne pas trop sèche documents d'œufs, que cela se traduira dans l'œuf la dessiccation 27. - Réserve oeufs supplémentaires à la fois LD et SD photopériodes pour évaluer l'incidence de la diapause et interprètent l'effet photopériodique (voir Mesure diapause, section 6).
- Pour le stockage à long terme, conserver ses documents d'oeuf à 21 ° C et environ 80% d'humidité dans des boîtes de Pétri. Gardez boîtes de Petri dans un conteneur de stockage Tupperware avec un flacon d'eau pour maintenir l'humidité locale que le développement embryonnaire prend de quatre à cinq jours à 21 ° C.
- Utiliser des embryons réservés supplémentaires (voir Stimuler ponte, section 4) qui sont 7-20 jours vieux pour quantifier la réponse de diapause.
- Enregistrez le nombre d'œufs présents sur chaque papier oeuf.
- Stimuler les œufs à éclore en immergeant complètement papiers d'œufs individuels dans un plat 90 ml Petri avec environ 80 ml de H 2 O. déminéralisée Ajouter environ 0,25 ml alimentaire suspension.
- Après 24 h compter le nombre de hachurée larves de premier stade. Placez la boîte de Petri sur une surface noire de visualiser larves et placer une source de lumière sur un côté du plat. Les larves se éloigner de la source de lumière, ce qui permet un décompte clair des larves individu. Retirer larves individuelle avec une pipette en comptant pour empêcher racontant larves individu.
- Lieu documents d'œufs dans une nouvelle boîte de Pétri et re-sèche. Re-oeufs éclosent après ~ 1 semaine et encore concordent œufs éclos en utilisant la méthode ci-dessus.
- Lieu documents d'œufs avec le reste u n oeufs éclos dans de nouvelles boîtes de Pétri de 90 ml avec une solution de blanchiment d'environ 80 ml 28. Veiller à ce que les documents d'œufs sont complètement immergés dans la solution de blanchiment et laissent sous une nuit de la hotte pour éviter l'odeur d'eau de Javel.
REMARQUE: solution de blanchiment peut être stocké pendant ~ 1 semaine à 4 ° C, mais devrait par ailleurs fait frais. - Inspectez oeufs en utilisant un microscope optique que le blanchiment va effacer le chorion et permettre la visualisation des oeufs embryonnés, non éclos. Si l'oeuf est embryonnés, l'œuf aura une couleur blanc cassé avec des yeux qui apparaissent comme deux petits points noirs en face de l'autre sur la face dorsale. Compter le nombre de non éclos, 13 œufs embryonnés.
- Déterminer l'incidence de la diapause à la formule suivante:% = pas de diapause. œufs embryonnés non éclos / (pas. oeufs éclos + pas. oeufs non éclos embryonnés) x 100 13.
7. Extraction de l'ARN à partir d'oeufs / larves pharate
ontenu "> NOTE: Utiliser Trizol dans une hotte à flux laminaire.- Brush oeufs de moustiques contenant des embryons en développement ou des larves pharate à des moments distincts de développement à partir de papiers d'œufs des broyeurs de verre à l'aide d'une brosse en poils de chameau. Broyer les œufs dans Trizol (1 ml par 50 à 100 mg de tissu) jusqu'à ce que complètement pulvérisé. Utilisez au moins 400 oeufs par bibliothèque pour obtenir l'ARN est suffisante.
- Alternativement, casser les oeufs de congélation dans l'azote liquide et conservés à -80 ° C dans des tubes à centrifuger jusqu'à un mois avant broyage dans Trizol.
- Effectuer l'extraction de l'ARN dans Trizol suivie par précipitation à l'isopropanol selon les instructions du fabricant.
- Traiter le banc avec une solution RNase de décontamination ou d'autres agents pour enlever les nucléases résiduels pour éviter la dégradation de l'ARN.
- Traiter l'ARN extrait à la DNase. Selon les instructions du fabricant, incuber les échantillons d'ARN avec de l'ADNase pendant 30 min à 37 ° C. Utilisez une & #181; l DNase à hauteur de 10 pg d'ARN dans une réaction de 50 ul. Augmenter la quantité de DNase se il ya plus de 10 pg d'ARN dans une réaction.
- Inactiver la DNase en ajoutant 5 pi DNase suspendu réactif d'inactivation. Incuber 5 min à température ambiante, le mélange trois fois au cours de la période d'incubation (de vortex douce).
- Centrifuger à 10 000 g pendant 1,5 min. Transférer le surnageant contenant les échantillons d'ARN traités dans des tubes frais pour les étapes ultérieures.
- Évaluer la qualité des échantillons d'ARN totaux par fluorométrie. Envoyer les échantillons à un centre de spécialité avec un instrument approprié pour cette tâche. L'installation se produira électrophorèse sur gel sur puce pour déterminer les tailles des espèces d'ARN dans l'échantillon, visualisées par colorant fluorescent instillé dans la puce. Les résultats seront retournés comme un électrophérogramme.
- Déterminer l'intégrité des échantillons d'ARN totaux par la présence ou l'absence de produits de dégradation, comme en témoigne la présence of crêtes entre les ribosomiques 18S et 5S pics d'ARN sur l'électrophorégramme obtenu (figure 1b).
8. ARN Séquençage
- Envoyer des échantillons d'ARN totaux avec une qualité suffisante (figure 1A) et la quantité (en général> 3 ug par bibliothèque) vers un centre de séquençage commercial pour la construction de bibliothèques enrichies couplé de fin d'ARNm et des séquences d'ARNm, à la suite des protocoles standard.
- Si plus d'une voie est utilisée pour le séquençage d'une seule expérience, des bibliothèques individuelles divisé en deux voies pour le séquençage de tenir compte des variations technique entre voies au cours du séquençage.
9. lllumina Lire nettoyage
REMARQUE: La figure 2 résume la partie de bioinformatique de ce protocole. Pour une liste complète de tous les programmes et les ressources utilisées dans la section de bioinformatique de ce protocole, se reporter au tableau 1. EnDe plus, Fichier supplémentaire 1 contient des exemples de ligne de commande pour chacune des étapes de la bioinformatique protocole suivantes.
- Utilisation ssaha2 29 (tableau 1) afin d'identifier les matches de 95% d'identité ou plus à la base de données NCBI Univec de base (tableau 1), A. albopictus séquence d'ARN (GenBank # de L22060.1), et les adaptateurs de séquençage (exemples détaillés de ligne de commande fournis dans Fichier supplémentaire 1). Retirer paires lecture avec des allumettes en Perl ou un outil de script similaire, par exemple en adaptant le script Perl fourni (Fichier supplémentaire 2).
- Clean restante lit avec le paquet SolexaQA 30 (tableau 1; supplémentaire Fichier 1): couper régions avec un score phred équivalent de moins de 20 en utilisant les paramètres par défaut de DynamicTrim.pl.
- Retirer lit plus courte de 25 pb avec LengthSort.pl à la fois avant et arrière lit simultanément. Évaluer la qualité des fichiers nettoyés fastq avec FastQC (tableau 1
10. Normalisation numérique
- Effectuer un tour de normalisation numérique sur le lit nettoyé en utilisant l'outil khmer 31 (tableau 1; supplémentaire Fichier 1), spécifiquement normalize-by-median.py (en utilisant la taille k-mer 20, une couverture de coupure de 20, et x = 1E10).
- Alternativement, si une machine à haute RAM est disponible (des centaines de Go), utiliser le script de normalize_by_kmer_coverage.pl de Trinity (tableau 1).
11. De Novo Assemblée transcriptome
- Obtenir l'accès à une grappe d'ordinateurs ou d'un ordinateur avec un maximum de 256 Gb de RAM et CPU 24, en fonction de la taille de l'ensemble.
- Utilisez Trinity 32 (tableau 1; Fichier supplémentaire 1) pour assembler la lecture numérique normalisé mis en contigs. Pour réduireutilisation de la mémoire, utilisez --min_kmer_cov 2.
Évaluation 12. Assemblée
- Exécutez assemblathon_stats.pl du projet Assemblathon2 33 sur la sortie contiguë Trinité. Ce script effectue des calculs de base utiles pour évaluer la qualité d'assemblage, comme le nombre d'échafaudages, N50, la composition de l'ensemble, et plus (tableau 1; 1 fichier supplémentaire).
13. Annotation du transcriptome assemblé
- Effectuer Blastx (tableau 1) de l'ensemble d'un ensemble de protéines de référence; pour les moustiques, Drosophila melanogaster, Anopheles gambiae, Culex pipiens, Aedes aegypti et sont des références appropriées. Plus précisément, formater le fichier fasta de protéine de référence pour explosion, suivie par blastx (Fichier supplémentaire 1).
14. Carte Lit à l'Assemblée Utilisation RSEM 34 (tableau 1)
- Créez un fichier 'à la transcription du gène carte », dans lequel lepremière colonne contient les ID de gènes de référence, et la deuxième colonne les ID contigs. Dans un éditeur de feuille de calcul, échanger les première et deuxième colonnes de la sortie Blastx, et écrire ces colonnes dans un fichier .txt. Utilisez le programme de LineBreak pour convertir les sauts de ligne dans le fichier .txt résultant au format Unix.
- Créer un ensemble de données de référence à partir du fichier fasta transcriptome utilisant le script RSEM-préparer-référence, fourni dans le paquet de RSEM (Fichier supplémentaire 1).
- Calculer les valeurs d'expression séparément pour chaque bibliothèque en utilisant la commande RSEM-calculer l'expression, fourni dans le paquet de RSEM (Fichier supplémentaire 1). Comme lit, utiliser les fichiers appariés fastq résultant de l'étape de lecture de nettoyage (étape 9.2).
- Si l'ARN à partir d'une répétition biologique a été divisé en deux voies pour le séquençage, inclure les deux fichiers fastq dans le calcul d'expression pour générer un fichier unique.
- Convertir les résultats d'expression de chaque bibliothèque à une matrice facilement traitées par d'autres pPROGRAMMES utilisant le script RSEM-générer-data-matrice, fournis dans le package de RSEM (Fichier supplémentaire 1).
15. Analyse de l'expression différentielle
- Installez R et déligneuse (tableau 1).
- Utilisez read.delim pour charger les résultats de l'étape de RSEM 14,3 (Fichier supplémentaire 1). Si nécessaire, arrondir les chiffres à l'entier le plus proche.
NOTE: Le guide recommande de limiter Edger l'ensemble de données à des gènes avec suffisamment forte expression pour détecter importance. - Pour formater les données pour déligneuse, générer un objet DGEList à partir du fichier de données chargées (Fichier supplémentaire 1). Puis, normaliser les données à l'aide TMM normalisation (Fichier supplémentaire 1). Estimer les dispersions communs et tagwise des données (fichier supplémentaire 1).
- Identifier les gènes exprimés de manière différentielle avec un Benjamini-Hochberg corrigé valeur p <0,05 (Fichier supplémentaire 1). Tracer la distribution de fois le changement de log-contre abondance (Fichier supplémentaire 1).
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Representative Results
Fluorimétrie de deux échantillons représentatifs d'ARN a montré deux bandes à environ 2000 nt (figure 1A, B). Le 28S de l'ARN ribosomique insectes est composé de deux chaînes polynucléotidiques maintenues ensemble par des liaisons hydrogène, qui sont facilement perturbés par un bref chauffage ou des agents qui perturbent les liaisons hydrogène 35. Les deux composantes obtenues sont approximativement de la même taille que l'ARN ribosomal 18S. Le second échantillon d'ARN a montré des niveaux élevés de dégradation (figure 1B).
Traitement lumineux d'un groupe représentatif de A. moustiques albopictus ont abouti à forte incidence de la diapause chez les moustiques à court jours-élevés, et la faible incidence de la diapause chez les moustiques long jour-élevés, bien qu'il y ait des variations entre les répétitions (tableau 2). Par exemple, SD2 réplique montre plus faible (80%) l'incidence de la diapause que les répliques restantes (87,18% de - 97,67%). Cette réplique avait aussi le plus petit sampl e la taille, il est donc recommandé de mettre de côté un nombre suffisant d'œufs (> 150) pour la mesure de la diapause pour obtenir un résultat précis.
Post-séquençage lire nettoyage sur une banque représentative de l'adulte A. femelles albopictus enlevés un nombre important de lit (de 83.853.322 à 52.736.065 totale lit pour une bibliothèque représentant). La normalisation numérique encore réduit le nombre total de lit à 41.435.934. Un ensemble de ces lectures Trinity généré 76 377 contigs, avec un N50 de 1879, la durée moyenne de 1,023.1 contig, et une longueur contiguë maximum de 20 892 (Figure 3). Analyse l'expression différentielle d'un flux de travail similaire d'embryons élevés dans des conditions de diapause induisant à 11 et 21 jours après la ponte a révélé 3128 gènes exprimés de manière différentielle entre ces deux périodes (Figure 4).
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Figure 1: FLUOROMETRIE profils de l'exemple de haute qualité (A) et de faible qualité (B) extractions d'ARN de A. albopictus. L'axe des abscisses représente la taille des fragments nucléotidiques, et l'axe des ordonnées représente les valeurs fluorescentes. Notez la différence dans l'échelle de l'axe y entre les panneaux (A) et (B). Les flèches marquent les positions des différents ARN ribosomal. Les bandes apparentes à proximité de la bande de marqueur vert indiquent la dégradation.
Figure 2: Résumé de la bioinformatique flux de travail de la préparation lire expression différentielle Chaque case représente un pas dans la section de bioinformatique de ce protocole, accompagné par le nombre correspondant de chaque étape du protocole..
Figure 3:. Histogramme des longueurs contigs d'une Trinité de novo ensemble du transcriptome La longueur moyenne est contiguë 1,023.1. Notez que la distribution des longueurs contig est fortement axée sur contigs plus courtes; ce est typique de novo ensemble du transcriptome.
Figure 4: Connexion -fois changement par rapport à l'abondance de l'expression génique TMM-normalisée de larves diapause pharate à 11 jours contre 21 jours post-ponte deux Chaque point désigne un unigènes;. unigènes exprimés de manière différentielle sont en rouge. Unigènes avec une expression plus élevée à 11 jours post-ponte ont des valeurs positives de changement de pli, oùque unigènes avec une expression plus élevée 21 jours post-ponte ont des valeurs négatives facteur de variation.
| Programme / ressources | URL de site web (accessible 13/01/2014) |
| perl | http://www.perl.org/get.html |
| python | http://www.python.org/download/ |
| ssaha2 | http://www.sanger.ac.uk/resources/software/ssaha2/ |
| NCBI Univec base | ftp://ftp.ncbi.nih.gov/pub/UniVec/UniVec_Core |
| SolexaQA | http://solexaqa.sourceforge.net/ |
| FastQC | http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ |
| khmer | https://github.com/ged-lab/khmer |
| Trinité | http://trinityrnaseq.sourceforge.net/ |
| Trinitéscript de normalisation | http://trinityrnaseq.sourceforge.net/trinity_insilico_normalization.html |
| Assemblathon deux scripts d'évaluation | https://github.com/ucdavis-bioinformatics/assemblathon2-analysis |
| BLAST + (qui comprend makeblastdb et blastx) | ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/ |
| linebreak | https://code.google.com/p/linebreak/ |
| RSEM | http://deweylab.biostat.wisc.edu/rsem/ |
| Guide de l'utilisateur Edger | http://www.bioconductor.org/packages/2.13/bioc/vignettes/edgeR/inst/doc/edgeRUsersGuide.pdf |
| R | http://www.r-project.org/ |
| Edger | http://www.bioconductor.org/packages/2.13/bioc/html/edgeR.html |
Tableau 1: Programmes et ressources utilisées pour til bioinformatique procédures dans ce protocole. URL sont répertoriés pour accéder facilement à chacune des ressources nécessaires dans ce protocole.
| Traitement | Reproduire | N ° d'œufs du 1 er trappe | N ° d'œufs du 2 trappe | No. embryonnés, œufs non éclos | % Diapause |
| Dakota du Sud | 1 | 10 | 0 | 68 | 87,18 |
| Dakota du Sud | 2 | 3 | 0 | 12 | 80,00 |
| Dakota du Sud | 3 | 1 | 0 | 42 | 97,67 |
| Dakota du Sud | 4 | 5 | 0 | 46 | 90,20 |
| Dakota du Sud | 5 | 6 | 0 | 79 | 92,94 |
| LD | 1 | 79 | 4 | 9 | 9,78 |
| LD | 2 | 28 | 0 | 4 | 12,50 |
| LD | 3 | 92 | 1 | 6 | 6,06 |
| LD | 4 | 30 | 0 | 5 | 14,29 |
| LD | 5 | 43 | 0 | 3 | 6,52 |
Tableau 2:. Calculs de l'incidence de la diapause Résultats cinq répétitions par photopériode de calculs de l'incidence de la diapause. Nombre de larves écloses de deux hachures distincts sont inclus, tout comme le nombre d'œufs embryonnés, non éclos, qui sont tous nécessaires pour calculer l'incidence de diapause.
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Discussion
Ce protocole présente des méthodes pour découvrir des gènes exprimés de manière différentielle en raison de photopériodiquement diapause induite dans A. albopictus. Le protocole est importante en ce qu'elle combine de façon unique moustiques élevage et des techniques bioinformatiques pour faire tous les aspects expérimentaux d'un programme de physiologie moléculaire accessible aux utilisateurs novices - en particulier pour ceux qui se concentrent sur la réponse de diapause photopériodique. Les méthodes existantes, à notre connaissance, ne fournissent pas autant de détails dans le protocole d'élevage - qui est souvent nécessaire pour identifier les erreurs élevage - ne fournissent pas un aperçu sur la conception expérimentale au cours de la phase d'élevage qui permettra analyse bioinformatique succès aval. Les méthodes présentées ici ont été optimisés pour A. albopictus, en particulier les méthodes d'élevage, qui ont généralement six semaines d'une génération de laboratoire à l'autre. Cependant, dans les applications futures de cette méthode pourrait être adaptée avec modesteajustements à d'autres espèces de moustiques qui présentent diapause photopériodique 23. En outre, le protocole expérimental général et de la bioinformatique flux de travail sont applicables à l'étude d'autres polyphenisms.
Plusieurs points non détaillés dans le protocole devraient être considérés lors de l'élevage A. larves albopictus. Tout d'abord, A. albopictus peut être trouvé dans une grande variété d'habitats de conteneurs naturels et artificiels tels que décrits dans les documents précédents 36, 37. lots de pneus usagés sont une source commune de larves pour établir des colonies de laboratoire. Populations recueillies ci-dessus 32N de latitude en Amérique du Nord peuvent se attendre à présenter une réponse de diapause forte 13. Le A. albopictus souche utilisée dans ce protocole ont été recueillies auprès Manassas, VA, et a été élevé dans un environnement de laboratoire pour plus de huit générations avant la manipulation expérimentale. Deuxièmement, l'éclairage dans les armoires de photopériode doit être choisi avec soin. Bulbes dans des armoiresavec des fonctions d'éclairage intégré peut provoquer des pics de température dans l'armoire lorsque l'éclairage se allume ou se éteint. Observation anecdotiques suggèrent ces pointes de température peuvent perturber la réponse de diapause. Pour éviter cela, les fonctions intégrées d'éclairage doivent être désactivées et les armoires doivent être équipées d'un 4 watts ampoule fluorescente froide. Troisièmement, les larves sont sensibles à H 2 O qualité et abondance de nourriture. Par conséquent, sur-alimentation peut entraîner une accumulation bactérienne et la mortalité des larves. Quatrièmement, il existe des méthodes alternatives au sang-alimentation moustiques femelles adultes. Membranes en verre sont une alternative artificielle système de membrane 38, 39, bien que le système de HemoTek effectue mieux dans l'expérience des auteurs. Les animaux vivants (généralement de poulet ou de rongeurs) peuvent également être utilisés 38 - dans ce cas, il est essentiel d'obtenir la première certification appropriée de votre institutionnel de protection des animaux et l'utilisation Comité (IACUC). Cinquièmement, bien qu'il n'y ait aucune preuve publiée clairement èmeà oeufs sont photosensibles 15, observations anecdotiques suggèrent que les oeufs provenant d'une SD traitement photopériode exposition légèrement réduit l'incidence de la diapause lorsqu'ils sont exposés à une photopériode LD dans les 10 jours de la ponte. Ainsi, stocker à la fois SD et LD oeufs dans des conditions de développement durable pour produire une réponse de diapause maximale dans les œufs de SD et d'éviter tout effet de confusion de la photopériode (SD vs LD) pendant le stockage des œufs.
Haute qualité de l'ARN est essentielle pour la génération de données d'ARN-Seq haute qualité. Soins abondante devrait être prise lors de l'extraction de l'ARN pour éviter toute contamination de la nucléase. Low échantillons d'ARN de qualité, tels que celui représenté sur la figure 1B, ne sont pas appropriés pour le séquençage. Évaluer la qualité de l'ARN avant d'envoyer les échantillons pour le séquençage est impératif. Bandes caractéristiques des molécules d'ARN peuvent être consultées par différents types de tissus d'insectes utilisés pour l'extraction de l'ARN, tels que les quatre bandes plus petites que 18S indiquées dans l'ARN de haute qualité électrophérogrammela figure 1A. Tendances constantes de bandes d'ARN autres que les deux bandes à 18S à travers des échantillons de moins de traitements biologiques distinctes indiquent peut fortement que ces bandes ne résultent pas de la dégradation, mais représentent la composition biologique des molécules d'ARN dans les types de tissus spécifiques choisis dans la conception expérimentale.
La bioinformatique flux de travail présenté ici permet à un utilisateur avec des compétences ligne de commande et scripts pour obtenir une liste de gènes exprimés de manière différentielle à partir des données de séquençage Illumina générés à partir de bibliothèques d'ARN répliquées de deux contrastant conditions expérimentales. Bien que cet exemple concerne des gènes exprimés de manière différentielle due à la photopériode, ce flux de travail peut être appliquée à ne importe quelle conception expérimentale avec deux ou plusieurs traitements, en ne importe quel organisme. Il ya beaucoup d'autres façons d'arriver à une liste de gènes exprimés de manière différentielle; Cependant, ce protocole est susceptible d'être l'approche la plus simple pour l'utilisateur novice. Plus exbioinformaticiens expé- peuvent vouloir prendre des mesures supplémentaires pour améliorer la contiguïté et la redondance de leur assemblée. Les biologistes avec peu ou pas d'expérience de la bioinformatique peut également remplir au moins une partie de ce pipeline dans le iPlant 40 de découverte du milieu, qui est un environnement d'analyse conduit graphique d'interface utilisateur libre. Il est probable que la fonctionnalité de iPlant va grandir à l'avenir afin de tenir compte des pipelines d'ARN-Seq pleins de novo assemblées du transcriptome. Enfin, notez que le Guide de l'excellente utilisation traite en profondeur les nombreuses façons d'utiliser Edger 41 (tableau 1) pour l'analyse de l'expression différentielle.
Dans certains cas, mis-ensembles peuvent générer contigs chimériques. Il existe plusieurs méthodes qui peuvent aider à identifier ces faux-ensembles, par exemple, Uchime 42. Toutefois, l'expérience passée, le nombre de chimères détectés est extrêmement faible (<0,1%); par conséquent, employinga programme de détection chimère peut ne pas être vaut l'effort supplémentaire.
Traitement à haut débit, les données de séquençage de nouvelle génération nécessite la capacité à 1) stocker de grandes quantités de données (pour un seul projet,> 500 Go); 2) de manipuler de gros fichiers de données qui ne peuvent pas être ouverts dans les traitements de texte traditionnels ou des tableurs; 3) effectuer des analyses qui nécessitent de grandes quantités de RAM, par exemple, pour l'assemblage de novo; et 4) analyser les grands ensembles de données, soit par des programmes conduits par une interface de ligne de commande (ce qui nécessite la possibilité d'installer ces programmes, ce qui est souvent non-trivial), ou par l'intermédiaire des suites d'analyse avec des interfaces utilisateur graphiques (par exemple Galaxy 43 ou iPlant 40 ). Les chercheurs ayant une certaine connaissance de Unix ligne de commande et un langage de script seront tirer le meilleur parti de l'accès à un cluster de calcul locale - soit l'Université en propriété exclusive, via un collaborateur, ou achetés pour leur propre laboratoire. Par exemple, le abflux ove a été accompli en utilisant un Macintosh laboratoire appartenant (12 cœurs, 64 Go de RAM, disque dur 1 TB), et un groupe informatique de l'Université d'occasion à l'ensemble de la Trinité. Si les ressources similaires ne sont pas disponibles, les chercheurs peuvent toujours se tourner vers iPlant pour effectuer des analyses à grande échelle, sans frais, et avec un investissement relativement plus faible dans la formation en raison de l'environnement de l'interface graphique. Cependant, ceux qui effectuent les analyses et l'interprétation ont encore besoin de comprendre les hypothèses de chaque programme utilisé.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Incubator - Model 818 | Thermo-Scientific | 3751 | 120 V |
| Controlled environment room | Thermax Scientific | N/A | Walk-in controlled environment room built to custom specifications by Thermax Scientific Products. A larger alternative to an incubator. http://thermmax.com/ |
| Cool Fluorescent bulb | Philips | 392183 | 4 W |
| Petri Dish 100 mm x 20 mm | Fisher | 08-772-E | |
| Filter Paper 20.5 cm | Fisher | 09-803-6J | |
| 9.5 L Bucket | Plastican | Bway Products | http://www.bwayproducts.com/sites/portal/plastic-products/plastic-open-head-pails/117 |
| Utility Fabric-Mosquito Netting White | Joann | 10173292 | http://www.joann.com/utility-fabric-mosquito-netting-white/10173292.html |
| Orthopedic stockings | Albahealth | 23650-040 | product no. 081420 |
| Organic Raisins | Newman's Own | UPC: 884284040255 | |
| Oviposition cups (brown) | Fisher Scientific | 03-007-52 | The product is actually an amber 125 ml bottle that we saw the top off of. |
| Recycled Paper Towels | Seventh Generation | 30BPT120 | |
| Modular Mates Square Tupperware Set | Tupperware | http://order.tupperware.com/pls/htprod_www/coe$www.add_items | |
| Glass Grinder | Corning Incorporated | 7727-2 | These Tenbroeck tissue grinders break the eggs and release RNA into the TRI Reagent. |
| TRI Reagent | Sigma Aldrich | T9424 | Apply 1 ml TRI Reagent per 50-100 mg of tissue. Caution — this reagent is toxic. |
| TURBO DNA-free | Ambion/Life Technologies | AM1907 | This kit generates greater yield than traditional DNase treatment followed by phenol/chloroform cleanup, and it is simpler to use. |
| RNaseZap | Ambion/Life Technologies | AM9782 | Apply liberally on the bench surfaces and any equipment that might be in contact with the RNA samples. The solution is slightly alkaline/corrosive, can cause irritation and is harmful when swallowed. |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA | Place up to 12 RNA samples on one chip. |
| Hemotek Membrane Feeder | Hemotek | 5W1 | This system provides 5 feeding stations that can be used simultaneously. Includes PS5 Power Unit and Power cord; 5 FUI Feeders + Meal Reservoirs and O-rings; Plastic Plugs, Hemotek collagen feeding membrane; Temperature setting tool; and Plug extracting tool. The company's mailing address is: Hemotek Ltd; Unit 5 Union Court; Alan Ramsbottom Way; Great Harwood; Lancashire, UK; BB6 7FD; tel: +44 1254 889 307. |
| Digital Thermometer and Probe | Hemotek | MT3KFU | MicroT3 thermometer and KFU probe. This is used to set the temperature of each FUI feeding unit. |
| Chicken Whole Blood, non-sterile with Sodium Citrate | Pel-Freez Biologicals | 33130-1 | The 500 ml of blood were frozen and stored in 20 ml aliquots at -80 °C for up to 1 year. Thaw blood at room temperature for at least 1 hr before using. |
References
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