Protocol
两个A. 1.苗种培育白纹伊蚊组以共创成长
- 设置两个光周期柜带有可编程照明在21℃为最佳滞育表达16和大约80％的相对湿度。
- 计划一个机柜为16L：8D光：暗周期（非滞育诱导LD光周期）。设置第二个柜的8L：16D光：暗周期（滞育诱导）13。
- 程序“灯”在同一时间在两个机柜来同步光周期之间的昼夜时间。
- 计算来执行实验所需的蛋的数量。瞄准每笼300-500鸡蛋。至少有三个复制滞笼和三个复制所需的RNA生成非滞育笼。这总计为长约每个实验1,800-3,000鸡蛋。
- 孵化的鸡蛋鸡蛋浸入到的论文约 500ml的去离子H 2 O.的
- 添加<EM> CA。1毫升食物制备由地面狗食和盐水虾如前所述24。覆盖容器目，并保持网格代替用橡皮筋。
- 放置在LD光照柜约 24小时。
- 转印孵出幼虫至10×10×2cm的培养皿填充有大约 90毫升去离子H 2 O.
- 维持每盘约 30幼虫。幼虫转移到清洁的菜肴每48-72小时，例如每周一，周三和周五（MWF）24。
- 饲料约 1毫升食物浆每个MWF包括地面狗粮和盐水虾去离子水如前面所述24。
- 设立三到四个成年笼子每个光照治疗，其中每个笼包括生物学重复。
- 从9.5 L桶相对两侧，切出一个10×14厘米的洞，并且另一个孔15厘米直径的。有限公司版本1.00先用网。切的矫形放养约一英尺长度，和胶水围绕另一孔的内侧一端。
- 削减库存关闭，结关的足端 - 开放的，只有当进入笼子的内部需要。对于笼盖，切出的所有的内部，只留下边，并与网孔24代替内部塑料。
- 注意光照，复制相关的实验上笼的一侧永久性标记号，笼起始日期等信息。
- 行成人笼用湿滤纸的底部。挫伤滤纸用足够的去离子H 2 O来增加局部湿度在笼中，但要避免积水，这可以刺激产卵在滤纸24上 。每天检查滤纸干燥，再湿必要时。
- 以产生足够的鸡蛋的RNA库，包括至少100位女性/ 9.5 L CAGE，没有每笼500多蚊子。
- 收集蛹MWF并将其放置在一个小杯子干净的H 2澳在不超过50蛹每25毫升H 2 O.密度蛹杯转移到一个成年人的笼子。笼子放置在相应的光照柜- A.白纹伊蚊蛹的感光15。
- 确保日常使得H 2 O的杯子是干净，清晰，并去除死蛹，因为积聚死蛹会导致大量死亡。除去H 2Ø杯毕竟蛹出现。
- 将有机葡萄干上笼提供糖羽化成虫的顶网。监测葡萄干，并改变他们每隔3-5天，以防止霉菌的积累。
2.维护成人为允许交配和产蛋
- 通过用湿滤纸衬笼底部保持笼子在高湿度（约80％），并提供访问非发霉葡萄干，如上所述（Secti附件1.5和1.9）。
3.吸血
- 准备血液供给雌性羽化后二至六天之间，以确保女性已经暴露于至少八个无歧义短天前开始产卵的近100％的滞育卵14。
- 准备Hemotek膜进给系统。堵塞进料装置进入电源。用调整螺钉调整每个单元的温度升高到37℃。使用电子温度计和探头校准期间测量所述馈送单元的温度。
- 准备一顿水库。拉伸的胶原膜馈送一个正方形在膳食储存器的孔，并与O形环固定。小心地将去除皱纹的角落;修剪多余的膜用剪刀。
注：胶原蛋白膜可能不适用于所有蚊种工作顺利，可能需要尝试几种类型，以找到最佳的膜，如果工作有品种较其他A.白纹伊蚊 。封口膜可以很好地淡色库蚊 。- 如果血液被冷冻贮存，在室温下解冻，至少1小时，使用前。
- 持这样的膜朝下的库，不支持的，以及该填充端口被朝上。使用移液管或注射器填充储与大约3毫升鸡全血具有柠檬酸钠作为抗凝血剂。轴封采用塑料塞填充端口。
- 通过拧到它上的馈线的底部传热板的螺栓连接的制备储到馈线。倒置馈线并将其放置在顶笼，膜面朝下，使蚊子可以通过笼的网孔送入。保持馈线上笼约45分钟，以最大限度地喂养。
4.刺激产卵
- 四，五天后血粉，装备每笼有色深色50毫升Ç向上排列着未漂白种子发芽纸（卵纸）或纹理的非漂白纸毛巾，并与去离子水9中途补。如果超过250蚊子是关在笼子里，用两个杯子。
注：对于小型笼或单女小瓶，在产卵箱“干草输液”可能会增加产卵由于微生物菌群25的气味。
5.收集和储存鸡蛋
- 在4-5天的血液喂养开始，因为五天后血液喂养产蛋量一般约达到高峰，然后逐渐消退，未来一周蛋收集。
- 不同的实验用品蛋收集频率。对于一般用途，收集了MWF如期鸡蛋论文。从每个网箱中取出卵子的论文，换上新纸。将在培养皿中，并存储在SD光照内阁最近删除的文件，以避免鸡蛋储存的混杂影响。
- 让鸡蛋论文重新主要湿2天后产卵，以允许浆膜角质层的形成，从而增加了蛋脱水电阻26。
- 大约48小时后收集，干燥蛋露天。干的纸张，这是跛行，微湿的触感，但没有这么潮湿的纸张不是H 2 O暗或刺激种蛋。
注：6.5“×4”文件大约需要3.5小时，晾干。要小心，不要过度干燥蛋的论文，因为这将导致鸡蛋干燥27。 - 储备来自LD和SD光周期的额外的鸡蛋，评估滞育发病率和解释的光周期的影响（见测量滞育，第6条）。
- 对于长期储存，保持蛋纸在21℃和大约80％的湿度在培养皿中。保持培养皿在特百惠的存储容器的水瓶来维持当地的湿度胚胎发育需要四到五天，在21°C。
- 使用额外预留胚胎（见刺激产卵，第4节）是7-20日龄量化滞育的响应。
- 记录本上每个蛋的蛋的纸张的数量。
- 刺激鸡蛋完全淹没个别蛋的论文中90毫升培养皿约80毫升去离子H 2 O.孵化加入约0.25毫升食物浆。
- 24小时后相符斜线第一龄幼虫的数目。放置在黑色表面培养皿形象化幼虫和放置一个光源上盘的一侧。幼虫将移动远离光源，允许个别幼虫的明确讯号。用吸管删除单个的幼虫，而计数，以防止个别讲述幼虫。
- 地方鸡蛋论文在一个新的培养皿中，然后再干燥。再孵化鸡蛋后约1周，再吻合鸡蛋使用上述方法孵化。
- 地方鸡蛋篇，其余ü正孵化的鸡蛋在新90毫升培养皿约80ml漂白液28。确保蛋论文在漂白溶液完全淹没，并在通风橱中过夜离开，以避免漂白剂的气味。
注：漂白溶液可存放约1星期4℃，但应以其他方式进行的新鲜。 - 使用光学显微镜作为漂白将清除绒毛膜和允许胚，未孵出的卵的可视化检查蛋。如果蛋是胚，卵将具有灰白色色与眼睛显示为两个小的黑点彼此相对的背侧。理货未阴影，鸡胚13的数量。
- 确定滞育率用下列公式计算：％滞育=无。胚未孵化的蛋/（无，孵化蛋+没有。胚未孵化的蛋）×100 13。
7. RNA提取鸡蛋/ pharate幼虫
ontent“>注：使用的Trizol在层流罩。- 刷蚊卵含胚胎发育或pharate幼虫在不同的发育时间点从卵纸用驼毛刷玻璃磨床。在研磨Trizol法鸡蛋（每50-100 mg组织1毫升），直到完全粉碎。至少使用400的鸡蛋每个库，以产生足够的RNA。
- 或者，捕捉冷冻蛋在液氮中，并储存在-80℃下在微量离心管长达一个月磨削中的Trizol之前。
- 根据制造商的说明在Trizol试剂进行RNA提取，随后用异丙醇沉淀。
- 治疗用核糖核酸酶净化解决方案或其他代理人的替补，以消除任何残余的核酸，以避免RNA降解。
- 把提取的RNA与DNA酶。根据制造商的说明，孵育RNA样品用DNase 30分钟，在37℃。使用1＃181;在一个50μl的反应升DNA酶长达10的RNA微克。增加DNA酶的量，如果有超过10个的RNA微克在一个反应。
- 通过加入5微升悬浮DNA酶失活试剂灭活脱氧核糖核酸酶。孵育5分钟，在室温下，在孵育期间（平缓涡旋）混合三次。
- 离心以10,000 xg离心1.5分钟。传送含有经处理的RNA样本到新管用于后续步骤中的上层清液。
- 评估总RNA样品用荧光的质量。送样品到适当的仪器完成这个任务，专业设施。该设施将执行片上的凝胶电泳，以确定RNA种类的样品中，通过荧光染料灌输在芯片可视的大小。结果将被返回作为电泳。
- 测定总RNA样品的存在或不存在的降解产物的完整性，由此证明存在Ò关于所得到的电泳图（ 图1B）的18S和5S核糖体RNA的峰F之间的峰。
8. RNA测序
- 送的总RNA样品以足够高的质量（ 图1A）和数量（每个库通常> 3微克），以一个商业测序中心建筑富集配对末端文库的mRNA和mRNA测序，下列标准协议。
- 如果一个以上的车道被用于测序的单个实验中，分割各个库成两个车道进行测序，以占测序期间车道之间的技术差异。
9. lllumina读清洗
注：图2总结了本协议的生物信息学部分。对于本协议的生物信息学段中使用的所有程序和资源的完整列表，请参阅表1。在此外，补充文件1包含的命令行的示例为下列每个生物信息的协议的步骤。
- 使用ssaha2 29（ 表1），以确定95％的同一性或更高的匹配，以在NCBI UniVec Core数据库（ 见表1），A。 白纹伊蚊 rRNA序列（GenBank中＃L22060.1），和测序适配器（以补充文件1提供了详细的命令行的例子）。通过调整提供的Perl脚本（参考文件2）拆下读对，使用Perl类似的脚本工具或火柴，例如。
- 与SolexaQA封装30清洁残留读取（ 表1;补充文件1）：修剪的区域用PHRED得分当量小于20使用DynamicTrim.pl的默认设置。
- 卸下两个读取短于25个碱基，LengthSort.pl正向和反向同时读取。评价清洁FASTQ文件与FastQC（ 表1的质量
10.数字归
- 在清洁过读取用高棉工具31执行一个循环数字正常化（ 表1;补充文件1），具体而言normalize-by-median.py（使用K-聚体大小20，一个覆盖截止20，并且x = 1E10）。
- 另外，如果一台机器具有高RAM可用（数百GB的），使用三位一体的normalize_by_kmer_coverage.pl脚本（ 表1）。
11. 从头转录组大会
- 获得访问计算机或计算机集群具有多达256个GB的RAM和24个CPU，取决于组件的尺寸。
- 使用三一32（ 表1;补充文件1）组装的数字归读设置成重叠群。为了减少内存使用情况，使用--min_kmer_cov 2。
12.大会评估
- 从三位一体重叠群输出Assemblathon2项目33运行assemblathon_stats.pl。这个脚本执行相关的评估装配质量的基本计算，如一些支架，N50，装配组合物，更（ 表1;补充文件1）。
13.注释的组装转录组
- 执行与参考蛋白质组的组件的BLASTX（ 表1）;蚊子， 果蝇，冈比亚按蚊，库蚊和白纹伊蚊都适合引用。具体来说，格式化参考蛋白质FASTA文件爆炸，随后BLASTX（参考文件1）。
14.地图读取大会使用RSEM 34（表1）
- 创建一个谈话到基因图“文件，其中的第一列含有参照基因的ID，并且第二列中的重叠群的ID。在一个电子表格编辑器，交换从BLASTX输出的第一和第二列，而写这些列.txt文件。使用断行程序转换换行符导致.txt文件为Unix格式。
- 创建从转录FASTA文件中使用RSEM-准备参考脚本，在RSEM包（补充文件1）提供的参考数据集。
- 分别计算出的表情值用于使用RSEM-计算表达命令，在RSEM包（参考文件1）提供的每个库。作为读出，则使用从读清洗步骤（步骤9.2）得到的配对FASTQ文件。
- 如果从生物复制的RNA被分裂成两个车道进行测序，包括在表达式计算两个FASTQ文件来产生一个单一的文件。
- 从每个文库中表达的结果转换成由另一个p容易地加工成矩阵使用提供的脚本RSEM生成数据矩阵，在RSEM包（参考文件1）提供rograms。
15.差异表达分析
- 安装R和轧边机（ 表1）。
- 使用read.delim加载步骤14.3（参考文件1）RSEM结果。如果需要的话，圆的计数为最接近的整数。
注：磨边机指南推荐的数据集限制为基因的高表达足以检测的意义。 - 要格式化的磨边机的数据，生成所加载数据文件（补充文件1）DGEList对象。然后，用标准化规范化TMM（参考文件1）中的数据。估计数据（参考文件1）共同和tagwise分散。
- 找出差异表达的基因与的Benjamini-霍赫贝格校正p值<0.05（参考文件1）。积数倍数变化与丰度（参考文件1）的分布。
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Representative Results
两个有代表性的RNA样品荧光显示两个频段约2000新台币（ 图1A，B）。昆虫28S核糖体RNA是由通过氢键，这很容易被简单加热或扰乱氢键35代理人打乱在一起举行了两次多核苷酸链。将所得的两组件是大致相同的尺寸的18S核糖体RNA。第二RNA样品显示出高程度的退化（ 图1B）。
光周期处理一组有代表性A.的伊蚊蚊子导致高滞育发病饲养短天的蚊子，并低滞育发生在饲养长天的蚊子，虽然有重复之间的一些变化（ 见表2）。例如，复制SD2显示低（80％）比其余重复滞育率（87.18％ - 97.67％）。这种重复也有最小SAMPL E尺寸，所以建议预留，以便获得准确的结果蛋（> 150）的滞育测定的足够数量。
后测序读成人A.清洁的一名代表库雌性伊蚊去掉了大量读取（从83853322到52736065共读一代表库）。数字正常化进一步降低总读取数为41435934。这些阿三位一体组件读取产生76377个重叠群，具有1879的N50中，1,023.1平均重叠群长度和20892（ 图3）的最大重叠群的长度。从胚胎在11和21天后产卵揭示3128这两个时间段之间差异表达的基因（ 图4）的滞育诱导条件下饲养的一个类似的工作流程的差异表达分析。
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图1：荧光示例高品质（A）和低质量的曲线（B）中的RNA提取从 A 纹伊蚊的 x轴表示的核苷酸片段的大小，而y轴表示荧光读数。注意在y轴刻度板之间的差（A）和（B）。箭头标记不同的核糖体RNA的位置。附近的绿色标志带明显的波段表明退化。
图2：从阅读准备的生物信息学工作流程的总结，以差异表达每个方框代表在本协议中的部分生物信息学一步，伴随着每个协议步骤的相应数量。
图3：从一三一从头转录组装重叠群长度直方图的平均重叠群长度为1,023.1。注意，重叠群长度的分布是严重偏向短重叠群;这是典型的从头转录组装。
图4：日志2倍变化与丰度滞育pharate幼虫TMM标准化基因的表达在11天与后21天产卵的每个点表示一个单基因;。差异表达的条unigene为红色。个UniGenes具有较高的表达11天后产卵具有积极的倍数变化值，其中作为个单一较高的表达后21天产卵有消极的倍数变化值。
| 程序/资源 | 网站的URL（访问2014年1月13日） |
| perl的 | http://www.perl.org/get.html |
| 蟒蛇 | http://www.python.org/download/ |
| ssaha2 | http://www.sanger.ac.uk/resources/software/ssaha2/ |
| NCBI UniVec核心 | ftp://ftp.ncbi.nih.gov/pub/UniVec/UniVec_Core |
| SolexaQA | http://solexaqa.sourceforge.net/ |
| FastQC | http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ |
| 高棉 | https://github.com/ged-lab/khmer |
| 三位一体 | http://trinityrnaseq.sourceforge.net/ |
| 三位一体标准化脚本 | http://trinityrnaseq.sourceforge.net/trinity_insilico_normalization.html |
| Assemblathon 2评估脚本 | https://github.com/ucdavis-bioinformatics/assemblathon2-analysis |
| BLAST +（包括makeblastdb和BLASTX） | ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/ |
| 断行 | https://code.google.com/p/linebreak/ |
| RSEM | http://deweylab.biostat.wisc.edu/rsem/ |
| 磨边机用户指南 | http://www.bioconductor.org/packages/2.13/bioc/vignettes/edgeR/inst/doc/edgeRUsersGuide.pdf |
| ř | http://www.r-project.org/ |
| 磨边 | http://www.bioconductor.org/packages/2.13/bioc/html/edgeR.html |
表1：程序和资源用于吨他生物信息学方法在此协议。网址列轻松地访问每个需要在这一协议中的资源。
| 治疗 | 复制 | 鸡蛋从1日孵化号 | 鸡蛋从2 次孵化号 | 第胚，未孵化的蛋 | ％滞育 |
| SD | 1 | 10 | 0 | 68 | 87.18 |
| SD | 2 | 3 | 0 | 12 | 80.00 |
| SD | 3 | 1 | 0 | 42 | 97.67 |
| SD | 4 | 五 | 0 | 46 | 90.20 |
| SD | 五 | 6 | 0 | 79 | 92.94 |
| LD | 1 | 79 | 4 | 9 | 9.78 |
| LD | 2 | 28 | 0 | 4 | 12.50 |
| LD | 3 | 92 | 1 | 6 | 6.06 |
| LD | 4 | 三十 | 0 | 五 | 14.29 |
| LD | 五 | 43 | 0 | 3 | 6.52 |
表2：滞育发病率的计算结果，从每滞育发病率的计算光照五次重复。孵出幼虫从两个单独的阴影线号被包括在内，因为是未孵出，含胚的鸡蛋，所有这些都是必要计算滞育发病数。
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Discussion
该协议提出的方法来发现，由于差异表达基因在光周期诱导A.滞白纹伊蚊 。该协议是在于其独特地结合蚊子饲养和生物信息学技术，使访问新手分子生理学方案的所有实验方面显著 - 特别是对那些集中在光周期滞育反应。现有的方法，据我们所知，不提供尽可能多的细节，在饲养协议 - 这往往是要找准饲养的错误 - 他们也不提供在饲养阶段，这将使得下游的成功生物信息学分析的实验设计的洞察力。这里介绍的方法已经被优化A.白纹伊蚊 ，尤其是饲养方式，一般需要6个星期一个实验室一代到下一代。但是，在未来的应用中，这种方法可适于具有适度调整表现出滞育光周期其他23蚊种。此外，一般的实验设计和生物信息学的工作流程也适用于其他polyphenisms的研究。
在协议中没有详细说明几点应A.饲养时要考虑白纹伊蚊幼虫。首先，A.伊蚊可以在各种各样的天然和人工容器的栖息地如在先前的论文中描述36,37。用于轮胎地段幼虫用于建立实验室菌落一个公共源中找到。以上在北美32N纬度收集种群可以预期表现出强烈的滞育反应13。 A.将在这个协议中使用的白纹伊蚊的菌株从弗吉尼亚州马纳萨斯收集，并且被事先以实验操作饲养在实验室设置八个多代。其次，照明在光照柜应谨慎选择。在橱柜灯泡具有内置照明功能可导致机柜内温度峰值时的照明打开或关闭。坊间观察表明，这些温度峰值会破坏滞育的响应。为了防止这种情况，内置的照明功能应该被禁用和橱柜应配备有4瓦冷荧光灯泡。三，幼虫于H 2 O质量和食品丰富敏感。因此，过馈送可能导致细菌聚集和幼虫死亡率。第四，有替代的方法对血液进料成年雌性蚊子。玻璃膜是一种替代人工膜系统38，39，虽然HemoTek系统执行在作者的体验更好。活的动物（一般鸡或啮齿动物），也可以用38 -在这种情况下，必须首先获得相应的认证，从您的机构动物护理和使用委员会（IACUC）。第五，虽然没有明确公布的证据次在鸡蛋感光15，坊间观察表明，从SD光照处理表现出鸡蛋略有减少滞育的发病率在10天之内产卵暴露在光照LD。因此，SD存储条件下，SD和LD鸡蛋生产的SD鸡蛋的最大滞育的响应，避免光照（SD与LD）期间，鸡蛋储存的任何混淆效果。
高RNA质量是产生优质RNA测序数据至关重要。丰富护理应的RNA的提取过程中要注意避免任何核酸酶污染。低质量的RNA的样品，如在图1B中示出，不适合用于测序。送样品进行测序之前评估RNA质量势在必行。 RNA分子的特征带可能是不同类型的昆虫组织的用于RNA提取，如四波段比在高质量的RNA的电泳显示18S较小可见在图1A中。 RNA带比整个样本的两支乐队在18S在不同的生物治疗等相一致的模式可以强烈地表明，这些频段不退化造成的，而是代表了选择的实验设计的具体组织类型的RNA分子的生物构成。
这里列出的生物信息学工作流程允许一些命令行和脚本技巧用户从两种截然不同的实验条件下获得的差异表达基因从复制的RNA库产生的Illumina的测序数据的列表。虽然本实施例涉及的基因，由于光照差异表达，该工作流程可以适用于任何实验设计有两个或更多的治疗，在任何生物体。还有许多其他的方法可以在差异表达的基因的列表到达;然而，该协议可能是对于新手用户的最直接的方法。更为前经验丰富生物信息学家可能需要采取额外的措施来提高其装配的连续性和冗余。生物学家几乎没有生物信息学的经验也可完成至少一部分该管道iPlant 40发现环境中，这是一个免费的图形用户界面驱动的分析环境。它是可能的iPlant的功能将在以适应全RNA测序管线从从头转录组件生长在将来较大。最后，注意良好的用户指南深入讨论了很多方法来使用磨边机41（ 表1）差异表达分析。
在一些情况下，误组件可产生嵌合重叠群。有几种方法可以帮助识别这些误装配，例如，Uchime 42。然而，从过去的经验，发现嵌合体的数量是非常低的（<0.1％）;因此，employinGA嵌合体检测程序可能不值得额外的努力。
处理高吞吐量的新一代测序数据需要的能力：1）存储大量数据（单个项目，> 500 GB）; 2）操作不能在传统的文字处理或电子表格程序中打开大的数据文件; 3）执行需要大量的RAM， 例如 ， 从头组装的分析; 4）分析大数据集，无论是通过命令行界面（需要安装这些程序的能力，这往往是不平凡的），或者通过分析套房，配有图形用户界面（驱动程序如银河43或40 iPlant ）。研究人员在Unix命令行的一些能力和脚本语言将获得最大的利益，从接入到本地计算集群 - 无论是大学拥有的，通过一个合作者，或购买适合自己的实验室。例如，从头奥雅纳的工作流程是使用实验室拥有的Macintosh电脑（12个核心，64 GB内存，1 TB的硬盘驱动器），并为三一组装一个大学拥有的计算机群来完成。如果类似的资源不可用，研究人员仍然可以转向iPlant进行大规模分析在没有成本，并与培训投资相对较低，由于图形界面环境。然而，这些实施和解释的分析仍然需要理解用于每个节目的假设。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Incubator - Model 818 | Thermo-Scientific | 3751 | 120 V |
| Controlled environment room | Thermax Scientific | N/A | Walk-in controlled environment room built to custom specifications by Thermax Scientific Products. A larger alternative to an incubator. http://thermmax.com/ |
| Cool Fluorescent bulb | Philips | 392183 | 4 W |
| Petri Dish 100 mm x 20 mm | Fisher | 08-772-E | |
| Filter Paper 20.5 cm | Fisher | 09-803-6J | |
| 9.5 L Bucket | Plastican | Bway Products | http://www.bwayproducts.com/sites/portal/plastic-products/plastic-open-head-pails/117 |
| Utility Fabric-Mosquito Netting White | Joann | 10173292 | http://www.joann.com/utility-fabric-mosquito-netting-white/10173292.html |
| Orthopedic stockings | Albahealth | 23650-040 | product no. 081420 |
| Organic Raisins | Newman's Own | UPC: 884284040255 | |
| Oviposition cups (brown) | Fisher Scientific | 03-007-52 | The product is actually an amber 125 ml bottle that we saw the top off of. |
| Recycled Paper Towels | Seventh Generation | 30BPT120 | |
| Modular Mates Square Tupperware Set | Tupperware | http://order.tupperware.com/pls/htprod_www/coe$www.add_items | |
| Glass Grinder | Corning Incorporated | 7727-2 | These Tenbroeck tissue grinders break the eggs and release RNA into the TRI Reagent. |
| TRI Reagent | Sigma Aldrich | T9424 | Apply 1 ml TRI Reagent per 50-100 mg of tissue. Caution — this reagent is toxic. |
| TURBO DNA-free | Ambion/Life Technologies | AM1907 | This kit generates greater yield than traditional DNase treatment followed by phenol/chloroform cleanup, and it is simpler to use. |
| RNaseZap | Ambion/Life Technologies | AM9782 | Apply liberally on the bench surfaces and any equipment that might be in contact with the RNA samples. The solution is slightly alkaline/corrosive, can cause irritation and is harmful when swallowed. |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA | Place up to 12 RNA samples on one chip. |
| Hemotek Membrane Feeder | Hemotek | 5W1 | This system provides 5 feeding stations that can be used simultaneously. Includes PS5 Power Unit and Power cord; 5 FUI Feeders + Meal Reservoirs and O-rings; Plastic Plugs, Hemotek collagen feeding membrane; Temperature setting tool; and Plug extracting tool. The company's mailing address is: Hemotek Ltd; Unit 5 Union Court; Alan Ramsbottom Way; Great Harwood; Lancashire, UK; BB6 7FD; tel: +44 1254 889 307. |
| Digital Thermometer and Probe | Hemotek | MT3KFU | MicroT3 thermometer and KFU probe. This is used to set the temperature of each FUI feeding unit. |
| Chicken Whole Blood, non-sterile with Sodium Citrate | Pel-Freez Biologicals | 33130-1 | The 500 ml of blood were frozen and stored in 20 ml aliquots at -80 °C for up to 1 year. Thaw blood at room temperature for at least 1 hr before using. |
References
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