Summary
نحن هنا وصف تقنية المجهر بسيطة ويمكن الوصول إليها على نطاق واسع للحصول على فيديو عالي الجودة الرقمية من ذبابة الفاكهة الكبار والظواهر متحولة اليرقات من منظور جانبي.
Abstract
ذبابة الفاكهة السوداء البطن هو نظام النموذج التجريبي قوية لدراسة وظيفة الجهاز العصبي. طفرات الجينات التي تسبب خلل في الجهاز العصبي غالبا ما تنتج اليرقات قابلة للحياة والكبار التي تحرك الظواهر المعيبة التي يصعب تصف بدقة مع النص أو تمثل تماما مع صورة فوتوغرافية واحدة. أوضاع الحالية النشر العلمي، ومع ذلك، ودعم تقديم وسائط الفيديو الرقمي كمادة تكميلية لمرافقة مخطوطة. نحن هنا وصف تقنية المجهر بسيطة ويمكن الوصول إليها على نطاق واسع للحصول على فيديو عالي الجودة الرقمية لكل من ذبابة الفاكهة الظواهر اليرقات والكبار من منظور جانبي. فيديو للتنقل اليرقات والكبار من الرؤية الجانبية هو مفيد لأنه يسمح للمراقبة وتحليل الفروق الدقيقة والاختلافات في السلوكيات الشاذة قاطرة. لقد استخدمت بنجاح هذه التقنية لتصور وقياس aberranر الزحف السلوكيات في يرقات العمر الثالث، بالإضافة إلى الظواهر والسلوكيات متحولة الكبار بما في ذلك الاستمالة.
Introduction
ذبابة الفاكهة ذبابة الفاكهة السوداء البطن شيوعا هو نظام النموذج التجريبي قوية لدراسة وظيفة الجهاز العصبي 1-3. الحفظ التطوري للبنية ووظيفة الجهاز العصبي مع البشر، فضلا عن سهولة التلاعب الجيني ومجموعة واسعة من الأدوات الوراثية يجعل ذبابة الفاكهة الكائن العرض الأول لنموذج أمراض الاعصاب البشري 4. طفرات الجينات التي تسبب خلل في الجهاز العصبي وغالبا ما يؤدي إلى يرقات متحولة وقابلة للحياة الكبار ذبابة الفاكهة مع ضعف الحركة. وتشمل الظواهر التي لوحظت في الجهاز العصبي المسوخ معيبة معدل الحركة والتنسيق الشاذة، وحركات تشنجية في البالغين، وكذلك العجز في انكماش تحوي من الجسم الجدار العضلي، والشلل الجزئي لليرقات تخفيضها. وقد استغلت هذه الظواهر في تطوير شاشات الوراثية الإنتاجية العالية والمقايسات تنقل اليرقات متحولة 5و 6 و 7-10 الكبار ذبابة الفاكهة التي تهدف إلى قياس انخفاض تنقل وتحديد الجينات الضرورية لوظيفة الجهاز العصبي. في حين أن هذه الأساليب هي مفيدة للغاية لقياس السلوكيات قاطرة اليرقات والكبار، فشلوا في نقل المعلومات النوعية عن كل سلوك منحرف محدد. على سبيل المثال، في حين متحولة الثالثة يرقات العمر قد يحمل المعلمات تنقل المتغيرة في الفحص السلوكي، قد يكون من غير الواضح ما إذا كان هذا هو نتيجة لتغيرات في تقلصات تحوي الإيقاعي خلال دورة الزحف، نقص عام في التنسيق، أو الشلل الجزئي من الجسم الخلفي الجدار العضلي. نحن هنا وصف تقنية المجهر بسيطة ويمكن الوصول إليها على نطاق واسع للحصول على فيديو عالي الجودة الرقمية من ذبابة الفاكهة الكبار والظواهر قاطرة اليرقات من منظور جانبي. الفيديو الرقمي المكتسبة من منظور جانبي يسمح الملاحظة المباشرة وتحليل الفروق الدقيقة في وكوموتيفالبريد السلوكيات من أكثر بالمعلومات الجانبية الرأي التوجه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. نظام ستيريو المجهر
ملاحظة: على الرغم من هذا البروتوكول هو قابل للتكيف بسهولة إلى أي تقريبا نظام ستيريو المجهر بالإضافة إلى كاميرا رقمية لديها القدرة على الحصول على شريط فيديو، وتقدم تفاصيل عن النظام المستخدم في مختبرنا (جدول المواد / المعدات).
- الحصول على الفيديو الرقمي باستخدام مجهر ستيريو ثلاثي العينيات بالإضافة إلى كاميرا رقمية التجارية.
- من أجل زوجين الكاميرا الرقمية التجارية إلى ميناء ثلاثي العينيات المجهر ستيريو، وإزالة ½x C-جبل من ميناء PHOTOTUBE المجهر ستيريو واستبدالها 1X C-جبل.
- جبل مقرنة كاميرا رقمية (43 ملم موضوع) إلى 1X C-جبل.
- جبل حلقتين خطوة إلى أسفل، 58 مم إلى 48 مم، و 48 مم إلى 43 مم، إلى مقرنة الكاميرا لسد اتصال من مقرنة الكاميرا الرقمية لمجموعة عدسة محول للكاميرا الرقمية.
- تركيب كاميرا رقمية لعدة محول العدسة.
- الحصول على الفيديو مع التكبير المجهر وزوم بصري من مجموعة الكاميرات الرقمية لتكبير مجتمعة حوالي 12X (30 لقطة في الثانية، 640 × 480 بكسل). ملاحظة: يجب أن يتم تعويض التكبير المجهر ستيريو وفقا لإعادة تشكيلها حديثا 1X C-جبل من ميناء ثلاثي العينيات.
2. التصوير ذبابة الفاكهة يرقات الطور الثالث
- الشريط علامة دائمة على لوحة سوداء من مرحلة المجهر ستيريو بالإضافة إلى كاميرا رقمية حتى يتسنى للجانب الغطاء علامة تحتل ما يقرب من ⅓ إلى ¼ الحقل الرأسي للرأي لوحظ في رصد الكاميرا LCD. استخدام قمم علامة كمرحلة لأداء التصوير اليرقات لأنها تأتي في مجموعة متنوعة من الألوان التي يمكن استخدامها لرمز اللون والتفريق بين الأنماط الجينية لليرقات التي يجري تصويرها.
- ترسيم مجال الرؤية لاحظ في الشاشة LCD الكاميرا الرقمية على سطح أعلى علامة مع نقطة غرامةعلامة.
- اختر يرقة الطور الثالث إلى الصورة. وكانت معايير اختيار يرقات العمر الثالث طول الجسم، وظهور من مصدر الغذاء خلال مرحلة اليرقات من دورة الحياة، فإن وجود الفتحات التنفسية الأمامية والخلفية، وهيكل السنانير الفك السفلي من الفم الجهاز 11. ضمان اليرقة نظيفة قبل غسله جيدا في الماء.
- إلقاء الضوء على مرحلة أعلى علامة دائمة من فوق مع الضوء من نظام الإضاءة الألياف البصرية. ضبط زاوية ضوء الحادث لتوفير الإضاءة المثلى.
- تركيز المجهر على حافة أعلى علامة دائمة. ستبدأ بالحصول على الفيديو الرقمي.
- وضع اليرقة على جانب الغطاء علامة حوالي 75 درجة بعيدا عن المحور الرأسي، خارج مجال الرؤية، مع الأمامي من اليرقة التوجه نحو مجال الرؤية (الشكل 1). ملاحظة: تنسيب اليرقة على جانب الغطاء علامة يسمح للكاميرا لتسجيل حركة من الالبريد يرقة من منظور جانبي. فهو يساعد على الحفاظ على يرقة رطبة بالماء حتى لا تسقط على جانب الغطاء علامة. يجب توخي العناية، ومع ذلك، لعدم استخدام الكثير من المياه وكميات مفرطة ستلتزم اليرقة حيث يزحف عبر الحقل.
- كزة بلطف وهمز اليرقة مع الفرشاة الصغيرة لإكراه على الزحف عبر مجال الرؤية. التريث اليرقات نادرا ما تتعاون وغالبا ما يجب أن عاد إلى نقطة البداية عدة مرات قبل أن الزحف مباشرة عبر الحقل.
- سجل حوالي 10-15 دقيقة من دون انقطاع لقطات الفيديو الرقمية والمحاصيل، وإزالة جميع اللقطات التي لا داعي لها بعد الاستحواذ مع برامج تحرير الفيديو الرقمي.
3. التصوير الكبار ذبابة الفاكهة
- وضع بالغ واحد ذبابة الفاكهة في التخلص منها 1.5 مل الطيفية البوليسترين كوفيت.
ملاحظة: CO 2 تخدير الكبار ذبابة الفاكهة فورا قبل behavبروتوكول تحليل ioral يمكن بخرق النتائج 12. فمن المستحسن أن الكبار ذبابة الفاكهة أن تعطى فترة 24 ساعة للتعافي من CO 2 تخدير قبل تنفيذ في اختبار السلوكي 13. - المكونات نهاية كفيت مع كرة القطن الصغيرة. ضمان معبأة الكرة القطن ضيق بما فيه الكفاية لاحتلال الفضاء قبعة كبيرة وتحصر الطاير إلى المقصورة انخفاض حجم كفيت.
- وضع كفيت على لوحة بيضاء مرحلة المجهر ستيريو ومحاذاة بشكل صحيح مقصورة انخفاض حجم كفيت مع مجال الرؤية لاحظ في الشاشة LCD الكاميرا الرقمية.
- تضيء كفيت من فوق مع الضوء من نظام الإضاءة الألياف البصرية. ضبط زاوية ضوء الحادث لتوفير الإضاءة المثلى.
- تركيز المجهر وستبدأ بالحصول على الفيديو الرقمي.
- سجل حوالي 30-45 دقيقة من دون انقطاع لقطات الفيديو الرقمية والمحاصيل، وإزالة جميع لا لزوم لهالقطات ما بعد الاستحواذ مع برامج تحرير الفيديو الرقمي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لقد استخدمت بنجاح هذه التقنية لاكتساب وتحديد النمط الظاهري السلوكية اليرقات المرتبطة بفقدان ظيفة الجين stathmin (الشكل 2) 14. الجين يشفر بروتين stathmin التنظيمي أنيبيب أن جدران تويولين dimers من برك من تويولين القابلة للذوبان، ويربط الأنابيب الدقيقة ويشجع على التفكيك 15،16. مطلوب وظيفة Stathmin للحفاظ على سلامة الأنابيب الدقيقة في محاور عصبية من الأعصاب الطرفية 14. تعطل النشاط stathmin في ذبابة الفاكهة النتائج يرقات العمر الثالث في النمط الظاهري الذي شرائح الجسم الوجه الخلفي صعودا بعد كل موجة تحوي من تقلص العضلات خلال دورة الزحف. هذا الشلل الخلفي أو "ذيل الوجه" النمط الظاهري هو السمة المميزة لنقل محور عصبي معيب. نحن كميا انتفاذ وشدة النمط الظاهري الشلل الخلفي في الثالثة يرقات العمر سبعة مختلف <م> stathmin المورثات الطافرة عن طريق قياس زاوية أفقية فوق الذيل أثير خلال دورة الزحف (الجدول 1). اليرقات العزم على تبدي قوية الذيل الوجه إذا تم رفع الذيل أكبر من 40 درجة فوق الأفقي عند الزحف، معتدل ذيل الوجه إذا تم رفع الذيل أقل من 40 درجة فوق الأفقي، وليس الذيل الوجه إذا أظهرت يرقات سلوك الزحف العادي.
الرقم 1. موقف الثالثة يرقة الطور على المسرح غطاء علامة دائمة لاكتساب الفيديو الرقمية من منظور الجانبي باستخدام مجهر ستيريو. الجانبية الرأي نظام ستيريو المجهر الأساسي مع الكاميرا الرقمية التي شنت في ميناء ثلاثي العينيات. ويبين التكبير أقحم اتجاه علامة دائمة مسجلة على المسرح المجهر وموقف اليرقة الطور الثالث على الغطاء علامة لشراء الفيديو الرقمي من السلوك المنحرف من منظور جانبي. في الصورة يتم تحديد أبعاد ثلاثة من الفضاء؛ محور س يمتد على طول علامة دائمة وموازية لمرحلة المجهر، والمحور ص هو عمودي على محور س وموازية لمرحلة المجهر، ومحور Z رأسيا من الغطاء علامة ل عدسة موضوعية وعمودي على المسرح المجهر. يتم وضع يرقة الطور الثالث على جانب الغطاء علامة حوالي 75 درجة بعيدا عن الرأسي ض محور باتجاه المحور الصادي، خارج مجال الرؤية للكاميرا الرقمية، مع الأمامي من اليرقة التي تواجه نحو الميدان نظر. وضع اليرقة على جانب الغطاء علامة يسمح للكاميرا رقمية المجهر ستيريو لتسجيل حركة اليرقة عبر الحقل من منظور جانبي.
ftp_upload / 51981 / 51981fig2highres.jpg "/>
الشكل 2. صور تمثيلية النتائج. صور الممثل من الفيديو الرقمي لليرقة ذبابة الفاكهة (A، B) والكبار (C، D) الظواهر والسلوكيات المكتسبة من منظور جانبي. كل صورة هي الفيديو لا يزال الإطار المستخرجة من المكتسبة ملفات الفيديو الرقمي. (A) Wildtype الثالثة يرقة الطور المعرض وضعية الجسم مسطح عند الزحف على طول الركيزة. (B) الطور الثالث يرقة متماثلة اللواقح لطفرة في المعرض stathmin الجينات الشاذة على الزحف وتعقد السلوك الذيل الوجه، يدل على شلل في عضلات الخلفي. (C) الأجنحة من wildtype ذبابة الفاكهة الكبار شقة ضد الجسم كما يمشي الطاير. (D) الكبار ذبابة الفاكهة، متماثلة اللواقح لطفرة غير معروفة، وعقد أجنحتها في زوايا حوالي 45 درجة فوق المعدل الطبيعي. كلا الشاذة النمط الظاهري اليرقات والكبارق صفها هي أفضل المرصودة واتصالات مع الفيديو الرقمي المكتسبة من المنظور الجانبي الجانبية الرأي. في لوحة A و B مقياس بار = 1 مم. تم تعديل هذا الرقم من دنكان وآخرون، عام 2013.
| شدة الشلل الخلفي النمط الظاهري | ||||
| النمط الجيني | ن | لا رافع فليب | معتدل الذيل فليب (<40 درجة) | قوي الذيل فليب (> 40 °) |
| wildtype | 150 | 100.0٪ (ن = 150) | 0.0٪ (ن = 0) | 0.0٪ (ن = 0) |
| الفول B200 / + | 130 | 100.0٪ (ن = 130) | 0.0٪ (ن = 0) | 0.0٪ (ن = 0) |
| الفول rdtp / + | 140 | 100.0٪ (ن = 140) | 0.0٪ (ن =) | 0.0٪ (ن = 0) |
| DF (2L) Exel6015 / + | 120 | 100.0٪ (ن = 120) | 0.0٪ (ن = 0) | 0.0٪ (ن = 0) |
| الفول B200 | 120 | 23.3٪ (ن = 28) | 23.3٪ (ن = 28) | 53.4٪ (ن = 64) |
| الفول B200 / مدافع (2L) Exel6015 | 101 | 10.9٪ (ن = 11) | 21.8٪ (ن = 22) | 67.3٪ (ن = 68) |
| الفول rdtp | 125 | 16.0٪ (ن = 20) | 32.0٪ (ن = 40) | 52.0٪ (ن = 65) |
| الفول rdtp / مدافع (2L) Exel6015 | 140 | 7.7٪ (ن = 11) | 23.7٪ (ن = 33) | 68.6٪ (ن = 96) |
الجدول 1. انتفاذ وشدةالخلفية الشلل النمط الظاهري لوحظ في stathmin (الفول) متحولة ذبابة الفاكهة الطور الثالث اليرقات. وانتفاذ وشدة النمط الظاهري الشلل الخلفي من stathmin متحولة ذبابة الفاكهة الطور الثالث اليرقات وسجل وكميا من خلال الحصول على الفيديو الرقمي للسلوك من منظور جانبي وقياس زاوية أن ذيل أثير فوق الطائرة الزحف الأفقية خلال دورة الزحف. وسجل اليرقات وجود قوي الذيل الوجه إذا تم رفع الذيل أكبر من 40 درجة فوق المستوى الأفقي ومعتدل ذيل الوجه إذا تم رفع الذيل أقل من 40 درجة فوق المستوى الأفقي. اليرقات واظهار سلوك الزحف العادي وسجل وعدم وجود الذيل الوجه. تم تحليل سلوك الزحف من مائة على الأقل يرقات لكل الوراثي اختبارها. تم تعديل هذا الجدول من دنكان وآخرون، عام 2013.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
قوة ذبابة الفاكهة السوداء 'ق كنظام نموذج لدراسة وظيفة الجهاز العصبي تنبع إلى حد كبير من التقارب من أدوات قوية الجينية المتاحة ومجموعة واسعة من المقايسات سلوكية قوية المتقدمة. هنا نقدم تقنية المجهر بسيطة ويمكن الوصول إليها على نطاق واسع للحصول على فيديو عالي الجودة الرقمية من ذبابة الفاكهة الكبار والظواهر قاطرة اليرقات من منظور جانبي. وقد استخدمنا بنجاح هذا النهج لتوصيف وقياس شدة الشلل الخلفي "ذيل الوجه" الظواهر التي لوحظت في الطور اليرقي الثالث المسوخ عصبية مباشرة من خلال قياس أقصى الزاوية التي الذيل أثير من المحور الأفقي خلال دورة الزحف 14. صالح نهج المعروضة هنا هي أن الفيديو حصل من منظور الجانبي، والسماح للالملاحظة المباشرة وتحليل السلوكيات الشاذة قاطرة، وكثيرا ما لوحظ في عصبية اليرقات والكبار بإجراء المسوخ، من "الجانبية الرأي" التوجه أكثر بالمعلومات. ونتيجة لذلك، والتصور من تقلصات العضلات تحوي يرقات ذبابة الفاكهة في والظواهر الشاذة في مشية الكبار ذبابة الفاكهة ويلاحظ بسهولة أكبر وتحليلها. واحد الحد من هذه التقنية هو أنه ليس النهج الإنتاجية العالية. بالإضافة إلى ذلك، ذبابة الفاكهة اليرقات والكبار سلوكيات معينة لا يمكن تحليلها لفترات قصيرة من الوقت نظرا لمنطقة تتبع المقيدة التي يوفرها مجال الرؤية للمجهر ستيريو. هذا يمكن أن يكون مشكلة خاصة عند الحصول على شريط فيديو من السلوكيات ذبابة الفاكهة الكبار، حيث بلغ حجم الغرفة كفيت هو أكبر بكثير من مجال الرؤية للمجهر ستيريو. لقد تعاملنا مع هذه المشكلة عن طريق استخدام القطن والورق المقوى إدراج لتقليل حجم الغرفة كفيت وتقييد حركة الكبار يطير إلى الفضاء الواردة ضمن مجال الرؤية. في حين أن غالبية دينا ايموقد ركزت الشيخوخة على المسوخ اليرقات عصبية، وقد استخدمنا أيضا تقنية لمراقبة الكبار الظواهر والسلوكيات متحولة، بما في ذلك الاستمالة، مما يشير إلى أن هذه التقنية يمكن بسهولة توسيعها لتشمل تحليل السلوكيات الأخرى مثل ذبابة الفاكهة المغازلة، الجماع، والعدوان. فمن الممكن أن هذا الأسلوب يمكن أن تكون مفيدة لتصوير أفراد الأسرة Drosophilidae الآخرين، فضلا عن الحشرات الأخرى من نفس الحجم. بالإضافة إلى ذلك، فإن تعديل طفيف للتقنية تسمح التصوير من أنواع الحشرات الكبيرة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وقد أعلن الباحثون أن لا وجود المصالح المتنافسة.
Acknowledgments
الكتاب نود أن نعترف الكسندرا أوبي للحصول على المساعدة الفنية والدعم، جيمس بارتون لتوفير السرد الفيديو، ورامونا Flatz وJoellen سويني لتظهر في شريط الفيديو المصاحب. وأيد هذا العمل من قبل صندوق موردوك MJ الخيرية (منحة رقم 2012205 لJED).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trinocular Stereozoom Microscope | Olympus Corporation | SZ6145TR | ½ C-mount was removed and replaced with 1X C-mount |
| 1X C-mount | Leeds Precision Instruments | LSZ-1XCMT2 | |
| Digital Camera Coupler (43 mm thread) | Qioptiq Imaging Solutions | 25-70-10-02 | |
| 58 mm to 48 mm Step Down Ring | B&H Video | GBSDR5848 | |
| 48 mm to 43 mm Step Down Ring | B&H Video | GBSDR4843 | |
| Lensmate Adapter Kit for Canon G10 | LensMateOnline.com | ||
| Canon PowerShot G10 Digital Camera | Canon U.S.A., Inc. | ||
| 1.5 ml Spectroscopic Polysterene Cuvette | Denville Scientific | U8650-4 |
References
- Zhang, B., Freeman, M. R., Waddell, S. Drosophila neurobiology: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2010).
- Frank, C. A., et al. New approaches for studying synaptic development, function, and plasticity using Drosophila as a model system. J Neurosci. 33, 17560-17568 (2013).
- Mudher, A., Newman, T. Drosophila : a toolbox for the study of neurodegenerative disease. , Taylor & Francis Group. (2008).
- Bilen, J., Bonini, N. M. Drosophila as a model for human neurodegenerative disease. Annu Rev Genet. 39, 153-171 (2005).
- Jakubowski, B. R., Longoria, R. A., Shubeita, G. T. A high throughput and sensitive method correlates neuronal disorder genotypes to Drosophila larvae crawling phenotypes. Fly (Austin). 6, 303-308 (2012).
- Caldwell, J. C., Miller, M. M., Wing, S., Soll, D. R., Eberl, D. F. Dynamic analysis of larval locomotion in Drosophila chordotonal organ mutants). Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 16053-16058 (2003).
- Jahn, T. R., et al. Detection of early locomotor abnormalities in a Drosophila model of Alzheimer's disease. J Neurosci Methods. 197, 186-189 (2011).
- Donelson, N. C., et al. High-resolution positional tracking for long-term analysis of Drosophila sleep and locomotion using the "tracker" program. PLoS ONE. 7, e37250 (2012).
- Slawson, J. B., Kim, E. Z., Griffith, L. C. High-resolution video tracking of locomotion in adult Drosophila melanogaster. J Vis Exp. (24), (2009).
- Colomb, J., Reiter, L., Blaszkiewicz, J., Wessnitzer, J., Brembs, B. Open source tracking and analysis of adult Drosophila locomotion in Buridan's paradigm with and without visual targets. PLoS ONE. 7, e42247 (2012).
- Demerec, M. Biology of Drosophila. , Hafner Pub. Co. (1965).
- Barron, A. B. Anaesthetising Drosophila for behavioural studies. J Insect Physiol. 46, 439-442 (2000).
- Greenspan, R. J. Fly pushing : the theory and practice of Drosophila genetics.. , 2nd edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2004).
- Duncan, J. E., Lytle, N. K., Zuniga, A., Goldstein, L. S. The Microtubule Regulatory Protein Stathmin Is Required to Maintain the Integrity of Axonal Microtubules in Drosophila. 8, e683244 (2013).
- Belmont, L. D., Mitchison, T. J. Identification of a protein that interacts with tubulin dimers and increases the catastrophe rate of microtubules. Cell. 84, 623-631 (1996).
- Cassimeris, L.
