Summary
여기서 우리는 측면 관점에서 초파리 성인 및 애벌레 돌연변이 표현형의 고품질 디지털 영상을 획득하는 간단하고 널리 접근 현미경 기술을 설명합니다.
Abstract
초파리 melanogaster은 신경계의 기능을 연구하기위한 강력한 실험 모델 시스템이다. 신경계의 기능 장애의 원인이 유전자 변이는 종종 가능한 유충 적절하게 텍스트로 설명하거나 완전히 하나의 사진 이미지로 표현하기 어려운 운동 결함이 표현형이 성인을 생산하고 있습니다. 과학 출판사의 전류 모드는, 그러나, 원고 동행 보조 재료로서 디지털 영상 매체의 제출을 지원한다. 여기에서 우리는 측면 관점에서 모두 초파리 애벌레와 성인 표현형의 고품질 디지털 영상을 획득하는 간단하고 널리 접근 현미경 기술을 설명합니다. 이 탈선 기관차 행동의 관찰과 미묘한 차이와 변화의 분석을 할 수 있기 때문에 사이드 뷰에서 애벌레와 성인 운동의 비디오는 유리하다. 우리는 성공적으로 시각화하고 aberran 정량화하는 기술을 사용했다t는 정리를 포함하여 성인 돌연변이 표현형과 행동뿐만 아니라, 셋째 령 유충의 행동을 크롤링.
Introduction
일반적인 과일 초파리 플라이는 1-3 신경계의 기능을 연구하는 실험 모델 강력한 시스템이다. 구조 진화 및 인간과 신경계의 기능의 보전,뿐만 아니라 유전자 조작의 용이성 및 유전 도구의 광대 한 배열은 초파리보기 인간 신경 퇴행성 질환 (4)를 모델링하는 초연 유기체를 만든다. 신경계의 기능 장애의 원인이 유전자 변이는 종종 장애인 운동으로 가능한 돌연변이 애벌레와 성인 초파리 초래한다. 신경계 결함이있는 돌연변이 체에서 관찰 된 표현형은 운동, 비정상적인 조정하고, 성인의 경련 운동의 속도뿐만 아니라 신체 벽 근육의 연동 수축 적자, 유충의 부분 마비를 감소 등이 있습니다. 이 표현형은 높은 처리량 유전 화면과 돌연변이 유충 5의 운동 분석의 개발에 이용 된, 운동 손상을 정량화하고 신경계의 기능에 필요한 유전자를 식별하기위한 6 성인 7 ~ 10 초파리. 이러한 접근은 유충 및 성인 기관차 동작을 정량화하는 데 매우 유용하지만, 이들은 각각 특정 비정상적인 동작에 대한 정성적인 정보를 전달하지 못한다. 돌연변이 제 령 유충 행동 분석에서 변경된 운동력 파라미터를 나타낼 수있는 반면이 크롤링주기 동안 리듬 연동 수축의 변화, 조정의 일반적인 결여 또는 후방 신체 부분 마비의 결과 인 경우, 예를 들어, 불분명 할 수있다 벽의 근육. 여기서 우리는 측면 관점에서 초파리 성인 및 애벌레 기관차 표현형의 고품질 디지털 영상을 획득하는 간단하고 널리 접근 현미경 기술을 설명합니다. 측면 관점에서 인수 한 디지털 비디오 locomotiv의 미묘한 차이의 직접 관찰 및 분석을 할 수 있습니다더 많은 정보를 사이드 뷰 방향에서 전자의 행동.
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Protocol
1 스테레오 현미경 시스템
주 :이 프로토콜은 쉽게 영상을 취득하는 기능과, 디지털 카메라에 결합 된 거의 모든 스테레오 현미경 시스템에 적용 할 수 있지만, 정보는 (재료 / 장비의 도표) 연구실에서 사용되는 시스템에 제공된다.
- 상업적 디지털 카메라에 결합 안 현미경 스테레오 현미경을 이용하여 디지털 영상을 획득.
- 커플 스테레오 현미경 안 현미경 포트 상업적 디지털 카메라를 위해, 스테레오 현미경 광전관 포트 ½x C-마운트를 제거하고 1X C-마운트로 대체.
- 1X C-마운트에 디지털 카메라 커플러 (43mm 스레드)를 탑재합니다.
- 카메라 커플러에 실장이 스텝 다운 링 48mm까지 58mm, 43mm 및 48mm로는, 디지털 카메라를위한 렌즈 어댑터 키트에 디지털 카메라 커플러에서 연결 다리.
- 렌즈 어댑터 키트에 디지털 카메라를 탑재합니다.
- 약 12 배의 결합 배율 (초당 30 프레임, 640 × 480 픽셀)에 대한 현미경 배율 디지털 카메라 세트의 광학 줌과 비디오를 획득. 참고 : 스테레오 현미경의 배율은 삼안 포트의 새롭게 재구성 1X C-마운트에 따라 보상해야합니다.
2 이미징 초파리 셋째 유충
- 테이프 마커 캡의 측면이 대략 차지하도록 디지털 카메라에 결합 스테레오 현미경 검정 스테이지 플레이트 영구 마커 ⅓ 카메라의 LCD 모니터에서 관찰 된 뷰의 수직 필드의 ¼한다. 그들이 색상 코드에 사용 이미지화되는 유충의 유전자형을 구별 할 수있는 색상의 구색에 와서 때문에 애벌레 이미징을 수행 할 수있는 단계로 마커 상판을 사용합니다.
- 미세한 포인트 마커의 상부 표면 상에 디지털 카메라의 LCD 모니터에서 관찰 시야를 구별마커.
- 이미지에 대한 제 령 유충을 선택합니다. 셋째 령 유충을 선택하기위한 기준은 몸체 길이, 생활주기의 애벌레 단계, 전방 및 후방 spiracles의 존재 중에 음식 소스로부터 출현하고, 구강 장치 (11)의 하악 후크의 구조였다. 유충은 물 속에서 철저하게 세척하여 청소합니다.
- 광섬유 조명 시스템으로부터의 광 위에서 영구 마커 위쪽 단을 밝히는. 최적의 조명을 제공하는 입사광의 각도를 조정한다.
- 영구 마커 상단의 가장자리에 현미경 초점을 맞 춥니 다. 디지털 영상을 획득 시작합니다.
- 시야를 향 유충 (그림 1)의 전방으로 바로 시야 밖에서 약 75 ° 떨어진 수직 축에서 마커 캡의 측면에 애벌레를 놓습니다. 주 : 마커 캡의 측면에 배치 유충은 번째의 레코드에 카메라 움직임을 허용측면 관점에서 전자 유충. 그것은 그들이 마커 캡의 측면에서 떨어지지 않도록 물과 습기가 애벌레를 유지하는 데 도움이됩니다. 케어는 들판을 가로 질러 크롤 과도한 양의 유충을 준수하므로 물을 너무 많이 사용하지 않는, 그러나 운동을해야합니다.
- 조심스럽게 찌르고보기의 들판을 가로 질러 크롤링을 강요하는 작은 페인트 브러시와 유충을 자극. 애벌레는 거의 협력하지 않고는 직선 들판을 가로 질러 기어 전에 자주 시작점으로 많은 시간을 반환해야 할 환자로합니다.
- 기록 약 10-15 중단 디지털 비디오 영상과 작물의 분 및 디지털 비디오 편집 소프트웨어와 불필요한 영상의 취득 후 제거합니다.
3 이미징 성인 초파리
- 일회용 1.5 ml의 분광 폴리스티렌 큐벳에 하나의 성인 초파리를 놓습니다.
참고 : 성인 초파리의 CO 2 진통제를 즉시 난연성 전에ioral 분석 프로토콜은 결과 (12)을 손상시킬 수 있습니다. 성인 초파리가 행동 검사 (13)에 수행하기 전에 CO 2 진통제를 복구하기 위해 24 시간의 기간을 부여하는 것이이 좋습니다. - 작은면 공을 큐벳의 끝을 연결합니다. 코튼 볼이 넓은 모자 공간을 차지할 정도로 꽉 포장되어 있는지 확인하고, 베트의 감소 된 구획으로 비행을 제한한다.
- 실체 현미경의 스테이지 흰색 접시에 놓고 큐벳을 적절히 디지털 카메라 LCD 모니터에서 관찰 시야와 큐벳의 감소 된 용적 구획 정렬.
- 광섬유 조명 시스템으로부터의 광 위에서 큐벳 밝히는. 최적의 조명을 제공하는 입사광의 각도를 조정한다.
- 현미경 초점 및 디지털 비디오를 획득 시작합니다.
- 기록 약 30-45 중단 디지털 비디오 영상과 작물의 분, 불필요한 제거디지털 비디오 편집 소프트웨어와 영상의 취득 후.
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Representative Results
우리는 성공적으로 획득하고 stathmin 유전자의 기능의 상실 (그림 2) (14)와 관련된 애벌레 행동 표현형을 정량화하기 위해이 기술을 사용하고 있습니다. stathmin 유전자는 수용성 튜 불린의 풀에서 튜 불린 이량 체를 분할 미세 소관 규제 단백질을 암호화하고, 미세 소관 결합과 해체 (15, 16)을 촉진한다. Stathmin 기능은 말초 신경 축색 돌기 (14)의 미세 소관에서의 무결성을 유지해야한다. 후방 본체 세그먼트 크롤링주기 동안 근육 수축의 각 연동 파도 후 상승 반전하는 표현형 초파리 셋째 령 유충 결과에 stathmin 활동의 중단. 이 후방 마비 또는 '꼬리 플립'표현형에 결함이 축삭 수송의 특징이다. 우리는 서로 다른 일곱 제 3 령 유충의 후방 마비 표현형의 투과도 및 심각도를 정량화 <EM> 수평 테일을 위 각을 측정하여 유전자형을 돌연변이하면 stathmin 크롤링주기 (표 1) 동안 상승시켰다. 애벌레 전시 경우 꼬리가 꼬리가 수평 위 이하 40 °를 제기 한 경우, 가벼운 꼬리 플립를 크롤링없고 꼬리 플립 수평 위보다 40 °를 제기 한 경우 유충은 강력한 꼬리 플립을 전시하기로 결정 했나 정상적인 크롤링 동작.
디지털 카메라와 함께 기본 스테레오 현미경 시스템의 그림 스테레오 현미경을 사용하여 측면 관점에서 디지털 비디오의 획득을위한 영구 마커 캡 무대에서 세번째 령 유충의 1 위치. 사이드 뷰는 안 현미경 포트에 장착. 삽입 된 배율 현미경 단계로 녹화 영구 마커의 방향과 위치를 보여줍니다 측면 관점에서 비정상적인 행동의 디지털 비디오의 획득을위한 마커 캡의 세 번째 령 유충. 화상 공간의 3 차원 정의된다; X-축은 영구 마커의 길이를 실행하고 현미경 스테이지에 평행이고, Y 축은 현미경 스테이지에 x 축과 평행에 수직 한 z 축이 마커 캡으로부터 수직 대물 렌즈와 현미경 스테이지에 수직. 셋째 령 유충이 필드 향 유충의 전방으로, 단지 디지털 카메라의 시야 밖에, 약 75 ° 떨어진 Y 축 방향으로 수직으로, Z 축에서 마커 캡의 측에 배치된다 보기. 마커 캡의 측면에 배치 유충은 스테레오 현미경 디지털 카메라 측 관점에서 필드에 걸쳐 유충의 움직임을 기록 할 수있다.
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그림 대표적인 결과의 2 이미지. 초파리 유충 (A, B) 및 성인의 디지털 비디오에서 대표 이미지 (C, D) 표현형과 행동은 측면 관점에서 인수했다. 각 이미지는 비디오가 여전히 획득 디지털 비디오 파일에서 추출 된 프레임이다. (A) 야생형 셋째 령 유충 전시 평평한 몸 자세 기판을 따라 크롤링 할 때. (B) stathmin 유전자 전시 탈선 크롤링의 돌연변이 셋째 령 유충 동형 접합체 후방 근육의 마비를 나타내는 꼬리 플립 동작. (C) 야생형 성인 초파리의 날개는 비행 산책으로. (D) 성인 초파리가 알 수없는 돌연변이에 대한 동형 접합, 그들의 날개를 보유하고있는 몸에 평면 개최 정상 위의 약 45 ° 각도. 비정상적인 애벌레와 성인 표현형 모두기술의 가장 관측 및 측면 뷰 관점에서 획득 디지털 비디오와 통신한다. 스케일 바 = 1mm 패널과 B. 이 수치는 던컨 외에서 수정되었습니다., 2013.
| 후방 마비 표현형의 심각도 | ||||
| 유전자형 | N | 테일 - 플립 없습니다 | 가벼운 테일 플립 (<40 °) | 강력한 꼬리 플립 (> 40 °) |
| 야생형 | 150 | 100.0 % (N = 150) | 0.0 % (N = 0) | 0.0 % (N = 0) |
| 스테인레스 B200 / + | 130 | 100.0 % (N = 130) | 0.0 % (N = 0) | 0.0 % (N = 0) |
| 스테인레스 rdtp / + | 140 | 100.0 % (N = 140) | 0.0 % (N =) | 0.0 % (N = 0) |
| DF (2L) Exel6015 / + | 120 | 100.0 % (N = 120) | 0.0 % (N = 0) | 0.0 % (N = 0) |
| 스테인레스 B200 | 120 | 23.3 % (N = 28) | 23.3 % (N = 28) | 53.4 % (N = 64) |
| 스테인레스 B200 / DF (2L) Exel6015 | (101) | 10.9 % (N = 11) | 21.8 % (N = 22) | 67.3 % (N = 68) |
| 스테인레스의 rdtp | 125 | 16.0 % (N = 20) | 32.0 % (N = 40) | 52.0 % (N = 65) |
| 스테인레스의 rdtp / DF (2L) Exel6015 | 140 | 7.7 % (N = 11) | 23.7 % (N = 33) | 68.6 % (N = 96) |
표 1 투과도와의 심각도(스테인레스) 돌연변이 초파리 셋째 령 유충 stathmin에서 관찰 마비 표현형 후부. 돌연변이 초파리 셋째 령 유충을 stathmin의 후방 마비 표현형의 투과도와 심각성은 득점과 측면 관점에서 행동의 디지털 영상을 획득하고 각도를 측정하여 정량 하였다 꼬리는 크롤링주기 동안 수평 크롤링 평면 위에 제기되었다. 유충은 꼬리 미만 40 ° 수평면 위에 제기 된 경우 꼬리가 수평 평면과 부드러운 꼬리 플립 이상보다 40 ° 제기 된 경우 강력한 꼬리 플립을 가진 것으로 득점했다. 정상적인 크롤링 동작을 나타내는 유충은 꼬리 플립이없는로 득점했다. 적어도 백 애벌레의 크롤링 동작은 각 시험 유전자형을 분석 하였다. 이 테이블은 던컨 외에서 수정되었습니다., 2013.
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Discussion
신경계의 기능을 연구하기위한 모델 시스템으로 초파리 melanogaster의 강도는 크게 유전 가능한 강력한 도구 수렴 및 개발 강력한 행동 분석의 광범위한 유래한다. 여기서 우리는 측면 관점에서 초파리 성인 및 애벌레 기관차 표현형의 고품질 디지털 영상을 획득하는 간단하고 널리 접근 현미경 기술을 제시한다. 우리는 성공적으로 특성화하고 후방 마비의 정도를 정량화하기 위해이 방법을 사용했다 '꼬리 플립'직접 꼬리 크롤링주기 14시 가로 축에서 제기됐다있는 최대 각도를 측정하여 신경 학적 셋째 령 애벌레 돌연변이 체에서 관찰 된 표현형. 여기에 제시된 방법의 장점은 비디오 기관차 비정상적인 행동의 직접 관찰 및 분석을 가능하게 횡 방향 관점에서 획득된다는 것이다, 종종 신경계 및 유충에서 관찰는 Dult 돌연변이, 더 많은 정보를 '사이드 뷰'방향에서. 따라서, 애벌레 초파리 연동 근육의 수축, 성인 초파리의 비정상적인 보행 표현형의 시각화는 더 쉽게 관찰하고 분석한다. 이 기술의 한 가지 제한은 높은 처리량 접근법 없다는 것이다. 또한, 특정 초파리 유충 및 성인 행동에만 의한 입체 현미경의 시야가 제한 수득 추적 영역으로 짧은 시간 기간에 대해 분석 할 수있다. 큐벳 챔버의 부피는 실체 현미경의 시야보다 훨씬 큰 한, 성인 초파리 행동의 영상을 획득 할 때 특히 문제가 될 수있다. 우리는 큐벳 챔버 체적을 최소화하고 어른의 움직임이 시야 내에 포함 된 공간에 도착하는 제한면과 판지 인서트를 사용함으로써이 문제를 해결했다. 잠시 IM 우리의 대부분노화가 신경 학적 애벌레 돌연변이에 초점을 맞추고있다, 우리는 또한 기술이 용이하게 구애, 교미, 공격성과 같은 다른 초파리의 행동 분석을 포함하도록 확장 될 수 있음을 시사 정리를 포함하여 성인 돌연변이 표현형과 행동을 관찰하는 기술을 사용했다. 그것은이 기술은 다른 Drosophilidae 가족 구성원뿐만 아니라, 유사한 크기의 다른 곤충을 영상화하는 데 유용 할 수있다. 또한, 기술의 사소한 변경은 큰 곤충 종의 영상을 허용합니다.
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Disclosures
저자는 경쟁 이해 관계가 존재하지 않는 것을 선언했다.
Acknowledgments
저자는 영상 내레이션을 제공하는 기술 지원 및 지원, 제임스 바튼에 대한 알렉산드라 오피을 인정하고자하고, 첨부 된 영상에 나타나는에 대한 라모나 Flatz 및 Joellen 스위니. 이 작품은 MJ 머독 자선 신탁 (JED에 부여 번호 2012205)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trinocular Stereozoom Microscope | Olympus Corporation | SZ6145TR | ½ C-mount was removed and replaced with 1X C-mount |
| 1X C-mount | Leeds Precision Instruments | LSZ-1XCMT2 | |
| Digital Camera Coupler (43 mm thread) | Qioptiq Imaging Solutions | 25-70-10-02 | |
| 58 mm to 48 mm Step Down Ring | B&H Video | GBSDR5848 | |
| 48 mm to 43 mm Step Down Ring | B&H Video | GBSDR4843 | |
| Lensmate Adapter Kit for Canon G10 | LensMateOnline.com | ||
| Canon PowerShot G10 Digital Camera | Canon U.S.A., Inc. | ||
| 1.5 ml Spectroscopic Polysterene Cuvette | Denville Scientific | U8650-4 |
References
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