Summary
Her beskriver vi en enkel og bredt tilgængelig mikroskopi teknik til at erhverve digital video af Drosophila voksen og larvernes mutant fænotyper af høj kvalitet fra en lateral perspektiv.
Abstract
Drosophila melanogaster er en kraftig eksperimentel model for undersøgelse af funktionen af nervesystemet. Genmutationer, der forårsager dysfunktion af nervesystemet ofte producere levedygtige larver og voksne, der har bevægelseskomponenter defekte fænotyper der er vanskelige at tilstrækkeligt beskrive med tekst eller fuldstændigt repræsentere en enkelt fotografisk billede. Nuværende former for videnskabelig publicering, støtter imidlertid indsendelse af digital video medier som supplerende materiale til at ledsage et manuskript. Her beskriver vi en enkel og bredt tilgængelig mikroskopi teknik til at erhverve digital video af både Drosophila larvestadiet og voksne fænotyper af høj kvalitet fra en lateral perspektiv. Video af larve og voksen bevægelse fra en side-view er fordelagtig, fordi det giver mulighed for observation og analyse af subtile forskelle og variationer i afvigende lokomotiv adfærd. Vi har med succes anvendt teknik til at visualisere og kvantificere aberrant crawling adfærd i tredje stadie larver, foruden voksne mutant fænotyper og adfærd, herunder grooming.
Introduction
Den fælles bananflue Drosophila melanogaster er en kraftig eksperimentel model for undersøgelse af funktionen af nervesystemet 1-3. Evolutionær bevaring af struktur og funktion af nervesystemet med mennesker, samt lette genmanipulation og en bred vifte af genetiske værktøjer gør Drosophila premieren organisme at modellere menneskelig neurodegenerative sygdomme 4. Genmutationer, der forårsager dysfunktion af nervesystemet ofte resultere i levedygtig mutant larver og voksne Drosophila med nedsat bevægelse. Fænotyper observeret i nervesystem mutanter omfatter nedsat bevægelse, afvigende koordinering og spastiske bevægelser i voksne, såvel som underskud i peristaltisk sammentrækning af kroppen væg muskulatur, og delvis lammelse af larver. Disse fænotyper er blevet udnyttet i udviklingen af højt gennemløb genetiske skærme og bevægelseskomponenter assays af mutant larver 56 og voksen 7-10 Drosophila formål at kvantificere bevægelse nyrefunktion og identificere gener, der er nødvendige for funktionen af nervesystemet. Mens disse metoder er særdeles nyttige til at kvantificere larvestadiet og voksne lokomotiv adfærd, de undlader at formidle kvalitative oplysninger om hver enkelt afvigende adfærd. For eksempel, mens mutant tredje stadie larver kan udvise ændrede bevægelseskomponenter parametre i en adfærdsmæssig analyse, kan det være uklart, om dette er resultatet af ændringer i rytmiske peristaltiske sammentrækninger i løbet af kravlende cyklus, generel mangel på koordinering, eller delvis lammelse af den bageste krop væg muskulatur. Her beskriver vi en enkel og bredt tilgængelig mikroskopi teknik til at erhverve digital video af Drosophila voksen og larvestadiet lokomotiv fænotyper af høj kvalitet fra en lateral perspektiv. Digital video erhvervet fra en lateral perspektiv tillader direkte observation og analyse af subtile sondringer i Locomotive adfærd fra en mere informativ side-view orientering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Den stereomikroskop System
Bemærk: Selvom denne protokol er let at tilpasse til stort set alle stereoanlæg mikroskop system, der er koblet til et digitalt kamera med mulighed for at erhverve video givet detaljer på systemet bruges i vores laboratorium (Table of Materials / udstyr).
- Anskaf digital video ved hjælp af en trinokulære stereo mikroskop koblet til en kommerciel digitalkamera.
- For at koble den kommercielle digitale kamera til trinokulære havn stereo mikroskop, fjern ½x C-mount af fototubusen port stereo mikroskop og erstatte det med en 1X C-mount.
- Monter et digitalt kamera kobling (43 mm gevind) til 1X C-mount.
- Mount to trin-down ringe, 58 mm til 48 mm og 48 mm til 43 mm, til kameraet kobling til at bygge bro over forbindelsen fra digitalkameraet kobling til en linse adapter kit til det digitale kamera.
- Monter digitale kamera til linsen adaptersæt.
- Anskaf video med mikroskop forstørrelse og optisk zoom på det digitale kamera sæt til en samlet forstørrelse på cirka 12X (30 frames per sekund, 640 x 480 pixels). Bemærk: Forstørrelsen af stereo mikroskop skal kompenseres i overensstemmelse med den nyligt omkonfigureres 1X C-mount af trinokulære havn.
2. Imaging Drosophila tredje stadie larver
- Tape en permanent markør til den sorte fase plade af et stereo mikroskop koblet til et digitalt kamera, så den side af markøren hætten optager omtrent ⅓ til ¼ af den vertikale synsfelt observeret i kameraets LCD-skærm. Brug markør toppe som scenen for at udføre larvernes billeddannelse, fordi de kommer i et udvalg af farver, der kan bruges til at farvekode og differentiere genotyper af larver, der afbildes.
- Afgrænse synsfeltet observeret i det digitale kamera LCD-skærm på overfladen af markøren top med en fin spidsmarkør.
- Vælg et tredje stadie larve til billedet. Kriterierne for udvælgelse af tredje stadie larver var kropslængde, fremkomsten fra fødekilde i larvestadiet fase af livscyklussen, tilstedeværelsen af anteriore og posteriore Spirakler, og strukturen af de mandibulære kroge i munden apparatet 11. Sørg for larven er ren ved at vaske det grundigt i vand.
- Oplys permanent markør øverste trin fra oven med lys fra en fiberoptisk belysning system. Justere vinklen på det indfaldende lys til at yde optimal belysning.
- Fokus mikroskopet på kanten af den permanente markør toppen. Begynd at erhverve digital video.
- Placer larve på den side af markøren hætten cirka 75 ° væk fra den lodrette akse, lige uden for synsfeltet, med den forreste af larve vender mod synsfeltet (figur 1). Bemærk: Placering af larve på den side af mærketråden hætten kan kameraet optage bevægelse the larve fra en lateral perspektiv. Det hjælper til at holde larven fugtig med vand, så de ikke falder ud over siden af markøren hætte. Der skal udvises forsigtighed, dog ikke at bruge for meget vand, da store mængder vil overholde larve som kravler på tværs af feltet.
- Forsigtigt stikke og prod larve med en lille pensel til at tvinge den til at kravle hen over synsfeltet. Vær tålmodig, da larverne samarbejder sjældent og ofte nødt til at blive returneret til udgangspunktet mange gange før de kravler lige over marken.
- Optag ca 10-15 min uafbrudt digital video-optagelser og beskære og fjerne alle unødvendige optagelser efter overtagelsen med digital video redigeringssoftware.
3. Imaging Voksen Drosophila
- Placer et enkelt voksen Drosophila i en engangs 1,5 ml spektroskopiske polystyren kuvette.
Bemærk: CO 2 bedøvelse af voksne Drosophila umiddelbart før et BehavIoral analyse protokol kan kompromittere resultater 12. Det anbefales, at voksne Drosophila gives en 24-timers periode til at komme sig CO 2 bedøvelse, før du udfører i en adfærdsmæssig test 13. - Sæt enden af kuvetten med en lille vat. Sørg for, vat er pakket stramt nok til at besætte den store kasket plads og begrænser fluen til den reducerede mængde rum af kuvetten.
- Anbring kuvetten på den hvide fase plade af et stereomikroskop og ordentligt tilpasse den reducerede mængde rum af kuvetten med synsfeltet observeret i det digitale kamera LCD-skærmen.
- Belyse kuvetten ovenfra med lys fra et fiberoptisk belysning system. Justere vinklen på det indfaldende lys til at yde optimal belysning.
- Fokus mikroskopet og begynde at erhverve digital video.
- Optag ca 30-45 min uafbrudt digital video-optagelser og beskære og fjerne alle unødvendigeoptagelser efter overtagelsen med digital video redigeringssoftware.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har med succes brugt denne teknik til at erhverve og kvantificere larvestadiet adfærdsmæssige fænotype forbundet med tab af funktion af stathmin genet (figur 2) 14. Den stathmin genet koder for et mikrotubuli regulatorisk protein, der inddeler tubulindimere fra puljer af opløselig tubulin, og binder mikrotubuli og fremmer deres demontering 15,16. Stathmin funktion er nødvendig for at opretholde integriteten af mikrotubuli i axoner i perifere nerver 14. Forstyrrelse af stathmin aktivitet i Drosophila tredje stadiums larver resulterer i en fænotype, hvor de bageste kropssegmenter flip opad efter hver peristaltisk bølge af muskelsammentrækning under gennemgang cyklus. Denne bageste lammelse eller "hale-flip« fænotype er kendetegnende for defekt axonal transport. Vi kvantificerede penetrans og sværhedsgraden af den bageste lammelse fænotype i tredje stadie larver af syv forskellige <em> stathmin mutant genotyper ved at måle vinkel over vandret halen blev rejst under kravlende cyklus (tabel 1). Larverne blev bestemt til at udvise en solid hale-flip, hvis halen blev rejst mere end 40 ° over vandret når kravle, en mild hale-flip, hvis halen blev rejst mindre end 40 ° over vandret og ingen hale-flip, hvis larver udstillet en normal gennemgang adfærd.
Figur 1. Placering af tredje stadie larve på en permanent markør kasket scenen for erhvervelse af digital video fra en lateral perspektiv ved hjælp af et stereo mikroskop. Side-visning af en grundlæggende stereo mikroskop med digital kamera monteret på trinokulære havn. Det indsatte forstørrelse viser retningen af en permanent markør tapede til mikroskopbordet og placeringen af det tredje stadie larve på markør cap til erhvervelse af digital video af afvigende adfærd fra en lateral perspektiv. På billedet er defineret af de tre dimensioner af rummet; x-aksen løber længden af permanent markør og er parallel med mikroskopbordet, y-aksen er vinkelret på x-aksen og parallelt med mikroskopbordet og z-aksen er lodret fra det mærke hætten til objektiv og vinkelret på objektbordet. En tredje stadiums larver er placeret på den side af markør hætten cirka 75 ° væk fra den lodrette z-akse i retning af y-aksen, lige uden for synsfeltet for det digitale kamera, med den forreste af larve vender mod feltet opfattelse. Placering af larve på den side af markøren hætten tillader det digitale kamera i stereomikroskop for at optage bevægelsen af larve på tværs af feltet fra en lateral perspektiv.
ftp_upload / 51981 / 51981fig2highres.jpg "/>
Figur 2. Billeder af repræsentative resultater. Repræsentative billeder fra digital video af Drosophila larve (A, B) og voksne (C, D) fænotyper og adfærd erhvervet fra en lateral perspektiv. Hvert billede er en video stillbillede udvundet fra tilkøbte digitale videofiler. (A) Vildtype tredje stadie larve udviser en flad kropsstilling, når kravler langs et substrat. (B) tredje stadie larve homozygot for en mutation i stathmin gen udviser en afvigende gennemgang hale-flip adfærd, hvilket indikerer en lammelse af den bageste muskulatur. (C) vinger vildtype voksen Drosophila holdes fladt mod kroppen som fluen gåture. (D) Voksen Drosophila, homozygote for en ukendt mutation, holde deres vinger på vinkler cirka 45 ° over det normale. Både afvigende larve og voksen fænotypes beskrevne er bedst observerede og kommunikeret med digital video erhvervet fra en lateral side-view perspektiv. I panel A og B skalalinjen = 1 mm. Dette tal er blevet ændret fra Duncan et al., 2013.
| Sværhedsgraden af den bageste Lammelse Fænotype | ||||
| Genotype | n | Ingen hale-Flip | Mild Tail-Flip (<40 °) | Robust Tail-Flip (> 40 °) |
| vildtype | 150 | 100,0% (N = 150) | 0,0% (N = 0) | 0,0% (N = 0) |
| stai B200 / + | 130 | 100,0% (N = 130) | 0,0% (N = 0) | 0,0% (N = 0) |
| stai rdtp / + | 140 | 100,0% (N = 140) | 0,0% (N =) | 0,0% (N = 0) |
| Df (2L) Exel6015 / + | 120 | 100,0% (N = 120) | 0,0% (N = 0) | 0,0% (N = 0) |
| stai B200 | 120 | 23,3% (N = 28) | 23,3% (N = 28) | 53,4% (N = 64) |
| stai B200 / DF (2L) Exel6015 | 101 | 10,9% (N = 11) | 21,8% (N = 22) | 67,3% (N = 68) |
| stai rdtp | 125 | 16,0% (N = 20) | 32,0% (N = 40) | 52,0% (N = 65) |
| stai rdtp / DF (2L) Exel6015 | 140 | 7,7% (N = 11) | 23,7% (N = 33) | 68,6% (N = 96) |
Tabel 1. penetrans og sværhedsgraden afposterior paralyse fænotype observeret i stathmin (stai mutant) Drosophila tredje stadiums larver. penetrans og sværhedsgraden af den bageste lammelse fænotype stathmin mutant Drosophila tredje stadie larver blev scoret og kvantificeres ved at erhverve digital video adfærd fra en lateral perspektiv og måle vinklen at halen blev rejst over det horisontale gennemgang fly under crawling cyklus. Larverne blev bedømt som havende en robust hale-flip hvis halen blev hævet over 40 ° over det vandrette plan og en mild hale-flip, hvis hale er blevet rejst mindre end 40 ° over det vandrette plan. Larver udviser en normal gennemgang adfærd blev scoret som ikke har nogen hale-flip. Den kravlende adfærd mindst et hundrede larver blev analyseret for hver testet genotype. Denne tabel er blevet ændret fra Duncan et al., 2013.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Drosophila melanogaster 's styrke som et modelsystem til at studere nervesystem funktion hovedsagelig stammer fra konvergensen af de magtfulde genetiske værktøjer til rådighed, og den brede vifte af robuste adfærdsmæssige analyser udvikles. Her præsenterer vi en enkel og bredt tilgængelig mikroskopi teknik til at erhverve digital video af Drosophila voksen og larvestadiet lokomotiv fænotyper af høj kvalitet fra en lateral perspektiv. Vi har med succes anvendt denne metode til at karakterisere og kvantificere graden af bageste lammelse 'hale-flip «fænotyper observeret i neurologiske tredje stadie larvestadium mutanter ved direkte at måle den maksimale vinkel, at halen blev hævet fra den vandrette akse i kravlende cyklus 14. Fordelen ved den metode, der præsenteres her, er, at videoen er erhvervet fra en lateral perspektiv, der muliggør direkte observation og analyse af afvigende lokomotiv adfærd, der ofte observeres i neurologisk larve og enDult mutanter, fra en mere informativ "side-view 'orientering. Derfor visualisering af peristaltiske muskelsammentrækninger i larvernes Drosophila og afvigende gangart fænotyper i voksen Drosophila lettere kan observeres og analyseres. En begrænsning ved denne teknik er, at det ikke er en high-throughput tilgang. Derudover kan specifikke Drosophila larvestadiet og voksne adfærd kun analyseres for korte varigheder af tid på grund af den restriktive sporing område ydes af synsfeltet af stereomikroskop. Dette kan være særligt problematisk, når de erhverver video af voksne Drosophila adfærd, da mængden af kuvetten kammeret er betydeligt større end synsfeltet af stereomikroskop. Vi har løst dette problem ved hjælp af bomuld og papindsatser at minimere kammer volumen kuvetten og begrænse bevægelsen af den voksne flyve til et rum, der er indeholdt inden for synsfeltet. Mens størstedelen af vores imaldring har fokuseret på neurologiske larvernes mutanter, har vi også brugt teknikken til at observere voksne mutant fænotyper og adfærd, herunder grooming, hvilket tyder på, at teknikken kan let udvides til at omfatte analyse af andre Drosophila adfærd, såsom frieri, samleje, og aggression. Det er muligt at denne teknik kan være nyttige til billeddannelse af andre Drosophilidae familiemedlemmer, såvel som andre insekter af samme størrelse. Desuden ville mindre modifikation af teknikken tillade billeddannelse af større insektarter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker at anerkende Alexandra Opie til teknisk bistand og støtte, James Barton for at levere video-fortælling, og Ramona Flatz og Joellen Sweeney til optræder i den medfølgende video. Dette arbejde blev støttet af MJ Murdock Charitable Trust (Grant nr 2012205 til JED).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trinocular Stereozoom Microscope | Olympus Corporation | SZ6145TR | ½ C-mount was removed and replaced with 1X C-mount |
| 1X C-mount | Leeds Precision Instruments | LSZ-1XCMT2 | |
| Digital Camera Coupler (43 mm thread) | Qioptiq Imaging Solutions | 25-70-10-02 | |
| 58 mm to 48 mm Step Down Ring | B&H Video | GBSDR5848 | |
| 48 mm to 43 mm Step Down Ring | B&H Video | GBSDR4843 | |
| Lensmate Adapter Kit for Canon G10 | LensMateOnline.com | ||
| Canon PowerShot G10 Digital Camera | Canon U.S.A., Inc. | ||
| 1.5 ml Spectroscopic Polysterene Cuvette | Denville Scientific | U8650-4 |
References
- Zhang, B., Freeman, M. R., Waddell, S. Drosophila neurobiology: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2010).
- Frank, C. A., et al. New approaches for studying synaptic development, function, and plasticity using Drosophila as a model system. J Neurosci. 33, 17560-17568 (2013).
- Mudher, A., Newman, T. Drosophila : a toolbox for the study of neurodegenerative disease. , Taylor & Francis Group. (2008).
- Bilen, J., Bonini, N. M. Drosophila as a model for human neurodegenerative disease. Annu Rev Genet. 39, 153-171 (2005).
- Jakubowski, B. R., Longoria, R. A., Shubeita, G. T. A high throughput and sensitive method correlates neuronal disorder genotypes to Drosophila larvae crawling phenotypes. Fly (Austin). 6, 303-308 (2012).
- Caldwell, J. C., Miller, M. M., Wing, S., Soll, D. R., Eberl, D. F. Dynamic analysis of larval locomotion in Drosophila chordotonal organ mutants). Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 16053-16058 (2003).
- Jahn, T. R., et al. Detection of early locomotor abnormalities in a Drosophila model of Alzheimer's disease. J Neurosci Methods. 197, 186-189 (2011).
- Donelson, N. C., et al. High-resolution positional tracking for long-term analysis of Drosophila sleep and locomotion using the "tracker" program. PLoS ONE. 7, e37250 (2012).
- Slawson, J. B., Kim, E. Z., Griffith, L. C. High-resolution video tracking of locomotion in adult Drosophila melanogaster. J Vis Exp. (24), (2009).
- Colomb, J., Reiter, L., Blaszkiewicz, J., Wessnitzer, J., Brembs, B. Open source tracking and analysis of adult Drosophila locomotion in Buridan's paradigm with and without visual targets. PLoS ONE. 7, e42247 (2012).
- Demerec, M. Biology of Drosophila. , Hafner Pub. Co. (1965).
- Barron, A. B. Anaesthetising Drosophila for behavioural studies. J Insect Physiol. 46, 439-442 (2000).
- Greenspan, R. J. Fly pushing : the theory and practice of Drosophila genetics.. , 2nd edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2004).
- Duncan, J. E., Lytle, N. K., Zuniga, A., Goldstein, L. S. The Microtubule Regulatory Protein Stathmin Is Required to Maintain the Integrity of Axonal Microtubules in Drosophila. 8, e683244 (2013).
- Belmont, L. D., Mitchison, T. J. Identification of a protein that interacts with tubulin dimers and increases the catastrophe rate of microtubules. Cell. 84, 623-631 (1996).
- Cassimeris, L.
