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Immunology and Infection

为快速细菌鉴定和药敏试验的准备血培养微丸

doi: 10.3791/51985 Published: October 15, 2014

Summary

从血培养阳性的快速细菌沉淀制备可以用作用于诸如鉴定通过MALDI-TOF,革兰氏染色,药敏试验和基于PCR的试验样品。结果能够迅速地传达给临床医生来改善患者的血液感染的痛苦的结果。

Abstract

血流感染和败血症的发病率和死亡率的主要原因。患者从菌血症患的成功结果依赖于快速鉴定病原体的指导最佳抗生素治疗。从血培养阳性的革兰氏染色的分析,可以迅速进行,并已显著影响抗生素的治疗方案。然而,准确地识别病原体的,仍然需要建立最优针对性的治疗。我们在座的从血培养阳性可作为样本几个基本的下游应用,如鉴定MALDI-TOF MS,药敏试验(AST)采用纸片扩散法或自动化助攻系统简单,快速的细菌沉淀的准备并且通过自动的基于PCR的诊断测试。直接作用于血培养细菌沉淀应用于这些不同的标识和AST系统的性能是非常SImilar的性能通常是从生长在琼脂平板上的菌落分离得到。相较于传统的方法,迅速收购细菌沉淀的显著减少了时间报告均标识和AST。因此,下面的血培养阳性,鉴定通过MALDI-TOF可以在少于1小时,而AST的结果通过自动AST系统或纸片扩散测定法在8至18小时,分别进行报告。类似地,快速的基于PCR的测定法的结果可被传达给临床医生不到2小时以下内容的菌血症的报告。总之,这些结果表明,血培养细菌沉淀的快速制备具有该识别和AST的周转时间,从而对患者的血液感染的患成功结果的显著影响。

Introduction

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血液感染和败血症住院的病人发病和死亡的一个主要原因。因此,死亡率为血液感染有关的约14%被观察到的住院病人的37%,并可能增加至35%,在重症监护病房的患者1-3。快速鉴定病原体的是枢转,以指导最佳的抗微生物治疗,并增加抗微生物疗法4,5的成功结果。革兰氏染色,从血培养阳性的快速分析已经对抗生素治疗6,7但准确识别病原体的法律适应化显著影响需要提供最适合的抗生素治疗的患者。举例来说,不同的抗生素治疗方案有以下菌血症与肠球菌和链球菌,很难通过革兰氏染色,以区分实施。同样的,在鉴定物种利埃尔需要检测革兰氏阴性肠杆菌编码的染色体AmpC酶基因,其赋予增加的耐β-内酰胺8。

用血培养阳性,常规的诊断方法是传代的传染性病原体的不同琼脂平板上,这就需要采用不同方法,包括生化检查,在不同的选择性培养基上生长和全自动微生物鉴定系统几个小时的额外孵化前鉴定。时间的常规诊断方法的结果是约1至3天。

基质辅助激光解吸/飞行时间的电离质谱(MALDI-TOF)技术快速鉴定微生物的出现提供了一种新的工具,以快速识别从阳性血直接从生长在琼脂平板上的菌落微生物也培养物( 1)9-12。日E使用MALDI-TOF的从血培养鉴定传染性病原体的时候结果已经显著减小到几分钟,而不是通过传统的方法所需要的时间和天数。如由Croxatto 13所讨论的,MALDI-TOF鉴定的效率依赖于不同的参数,包括微生物的纯度和数量。这两个标准都容易从生长在琼脂平板上的菌落分离得到的,但需要对细菌浓缩和纯化从复杂样品如血液培养,其中含有多种细胞和蛋白质成分可与MALDI-TOF鉴定干扰预分析处理。

从血培养各种微生物'的分离方法中的一些研究,其中包括皂角苷或其它温和的清洁剂的方法进行细菌提取9,14,血清分离方法10已被使用,裂解离心方法122)15一个简单的血液培养菌体的准备。这血培养微丸制剂也为其他直接下游应用,如革兰染色阳性的样本,自动化PCR为基础的诊断测试,如POCT-PCR的快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (MRSA)和药敏试验用自动化系统的AST和/或通过在琼脂平板上扩散测定( 图3)。

在这项工作中,我们描述了血培养菌体的制备方法的不同步骤由Prod'hom 等人所说明15( 图4)。我们也将取消划线为3,可以在血培养粒料进行的主要应用的协议:用自动化系统16,用于肠杆菌和葡萄球菌和自动化PCR-鉴定通过MALDI-TOF 15,标识(ID)和抗生素敏感性试验(AST)基于诊断测试为MRSA 17的检测。

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Protocol

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该协议已开发和验证实施作为常规工具之前,下面我们机构的研发流程和道德准则。

1,制备血培养菌体通过氯化铵红细胞裂解过程

  1. 制备血培养阳性随后离心。
    1. 消毒血培养上限。添加70%乙醇的瓶盖和焚烧。
      注意:不要执行在层流罩这一步。
    2. 将瓶子在层流罩。收集5毫升血培养有20G的注射器。
    3. 添加5毫升血培养中装有45毫升无菌水(H 2 O)50毫升离心管中,混匀。
  2. 制备血培养菌体裂解通过离心。
    1. 离心样品在1000×g离心在室温10分钟。
    2. 雷莫已经上清液(主要含H 2 O和血细胞)用实验室真空泵。
    3. 重悬在1ml的自制氯化铵裂解溶液(0.15M的氯化铵 ,1mM的KHCO 3)沉淀。分解的丸粒通过刮削并通过涡旋管和离心的样品在140×g离心在室温10分钟。
    4. 丢弃它主要含有红细胞碎片的上清液。
      1. 如果颗粒仍然出血,重悬沉淀在2ml无菌蒸馏H 2 O中,进一步溶解残存的红血细胞和清洗沉淀。离心样品在140×g离心在室温10分钟,并弃去上清液。
    5. 悬浮颗粒在200微升H 2 O
  3. 血培养物上的各种选择性和非选择性琼脂培养基上继代培养。
    1. 收取1毫升血培养有20G的注射器。
    2. 接种1滴血文化诠释o在血琼脂,巧克力琼脂,McConkey琼脂和Schaedler琼脂四个象限。
    3. 在37℃下的血琼脂和巧克力琼脂平板上,在5%CO 2气氛中,McConkey琼脂在常压和Schaedler琼脂平板在厌氧条件。
    4. 按照对不同媒体细菌生长。
    5. 检查是否有细菌纯度。

2,鉴定通过MALDI-TOF质谱

  1. 直接标识从血液沉淀。
    1. 传输1微升的血液沉淀在MALDI靶盘,让它干在42℃加热平台。
    2. 覆盖与1微升70%甲酸样品,让它干在42℃加热平台。
    3. 覆盖与1μl的MALDI基质的样品(饱和α-氰基-4 - 羟基肉桂酸在50%乙腈 - 2.5%三氟乙酸中的溶液),并让它干燥在42℃下加热平台。
    4. 继续执行MALDI-TOF质谱分析所描述的制造商MALDI-TOF MS系统。
    5. 如果鉴定成绩是在种的水平(例如,得分<2)无效,执行血液颗粒样品的蛋白提取。
  2. 蛋白质提取的血培养沉淀后鉴定。
    1. 混合20微升用1ml 70%乙醇,离心的沉淀物以13,000 xg离心在RT 2分钟。
    2. 弃去上清液,加入25微升70%甲酸水溶液和25μl的100%乙腈以沉淀。涡大力悬浮颗粒。用吸头打破下来涡旋之前强硬的悬浮颗粒。
    3. 离心机以13,000 xg离心在RT 2分钟。传输1微升上清液(包含提取的蛋白质)在MALDI靶板上,让它干在42℃加热平台。请按2.1.2所述。

3,细菌IDENTIFication和药敏试验用全自动微生物系统

  1. 制备细菌悬浮液进行细菌鉴定和AST与全自动微生物系统。
    1. 准备装有3毫升无菌0.45%NaCl溶液与全自动微生物系统兼容的塑料管。
    2. 加血培养粒料的足够体积的0.45%的NaCl溶液中,得到的细菌悬浮液对应于0.6的麦法兰浊度至0.8。测量用密度计机浊度。
      请注意:在血培养细菌沉淀的体积为50至200μl的变化以达到0.6的麦法兰浊度至0.8。
  2. 如制造商所述接种的自动化革兰氏阳性(GP)或革兰氏阴性(GN)卡,用于识别和自动AST卡的革兰氏阳性球菌和革兰氏阴性细菌的抗菌敏感性试验。
    注:辨识n中具有全科医生或GN卡,如果MALDI-TOF质谱鉴定得分值> 2不适用。通过传代培养的菌悬液于血琼脂(GP和GN)和麦康凯琼脂(GN)板检查菌悬液的纯度。

4,药敏试验采用纸片扩散分析

纸片扩散法是通过在药敏试验(EUCAST,3.0版,2013年4月,www.eucast.org)欧洲委员会称。

  1. 细菌悬液的制备进行纸片扩散法药敏试验。
    1. 制备含有3毫升的无菌0.9%氯化钠溶液的玻璃试管中。
    2. 加血培养粒料的足够体积的0.9%的NaCl溶液中,得到的细菌悬浮液相当于0.5麦克法兰浊度。测量用密度计机浊度。
      请注意:在血培养物的体积细菌沉淀从50到200μl的变化以达到0.6的麦法兰浊度至0.8。
    3. 漩涡的菌悬液。
  2. 细菌悬浮液上的Mueller-Hinton琼脂(MH)或的Mueller-Hinton琼脂,苛养菌琼脂(MHF)的接种(MH补充有5%去纤维蛋白马血和20毫克/升的β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)。
    1. 蘸无菌棉签在细菌悬浮液,并轻轻转动棉签在玻璃管的内壁上除去过量的液体。
    2. 通过擦拭在三个方向上,或通过使用自动板旋转器均匀分布的菌液到氢/ MHF琼脂板的整个表面上。
  3. 在接种后的琼脂平板的抗微生物磁盘中的应用。
    1. 在干燥接种琼脂手动板的表面上或通过使用敏感性盘的分配器应用密切的磁盘。
    2. 孵育板在适当的坦佩叉涂抹,并作为药敏试验EUCAST纸片扩散法所描述的氛围(3.0版,2013年4月,www.eucast.org)。

5,自动基于PCR的诊断测试为MRSA的检测

  1. 使用微量,转移50微升血液中的文化沉淀成提供在20秒自动PCR为基础的诊断测试套件和旋涡的MRSA样本的试剂瓶。
  2. 用1毫升微量,分配所述样本到盒的样品端口。将墨盒插入自动PCR反应体系和所描述​​的制造商开始试验。

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Representative Results

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在由Prod'hom 15进行的研究中,从78例患者由122阳性血培养的氯化铵裂解离心分离得到的细菌粒料通过MALDI-TOF MS进行分析。出了122血培养阳性,95(77.9%)被正确识别的物种水平和一(0.8%),在属的水平。其余26(21.3%)血培养颗粒没有给出可靠的鉴​​定通过MALDI-TOF。其中,21人革兰氏阳性细菌,包括13链球菌和5凝固酶阴性葡萄球菌。重要的是,10出13不明链球菌是肺炎链球菌 ,往往拥有难以裂解胶囊是从S的品种难以分辨缓症组利用MALDI-TOF MS。五革兰氏阴性菌没有通过MALDI-TOF确定的,其中有4种难裂解包封的细菌种类包括二肺炎克雷伯氏菌和两个Haemop肺门流感。因此,在血液培养小球78.7%,这表示相比于从生长在琼脂平板上11的细菌菌落的常规鉴定获得的标识的84.1%的高效率性能得到正确识别通过MALDI-TOF。

在全自动微生物系统用于细菌的标识(ID)和AST的性能进行了测试对血培养阳性的278细菌沉淀在簇和革兰氏阴性菌的革兰氏阳性球菌。这些结果进行了比较,从生长在下面的血培养阳性的适当媒体16继代培养琼脂平板上的菌落与全自动微生物系统卡获得 ​​常规的结果。使用微生物鉴定系统ID卡直接识别时,可以使用鉴别细菌沉淀,通过MALDI-TOF MS的失败。相较于最终的鉴定MALDI-TOF MS,正确的识别与微生物鉴定系统的ID卡中观察到99%的肠杆菌科细菌,葡萄球菌的74%,非发酵革兰氏阴性菌的71%和其他革兰氏阳性球菌的33%。 à误认观察病例总数的11%,而细菌沉淀的8%的人没有任何标识。共有220细菌沉淀,包括87 肠杆菌和133葡萄球菌的助攻与全自动微生物系统的助攻GN26和AST 580卡16进行了分析。根据美国食品和药物管理局(FDA)批准用于解释协议的结果给出的定义,它定义了一个虚假的敏感是一个非常大的错误(VME)和虚假性为主要错误(ME)的结果进行了分析。从血培养粒料直接接种相比,接种从生长在琼脂平板上的菌落得到的AST显示出0.1%的VME和0.3%ME的肠杆菌科细菌 ,和0.7%的VME和0.1%ME为葡萄球菌。 AST由此表现直接与血培养颗粒接种卡均符合美国FDA公认的性能标准协议。

基于PCR的核酸扩增技术的MRSA测试靶向温泉的性能,mecA基因SCC的基因被直接施加于鉴定通过MALDI-TOF MS 17 金黄色葡萄球菌血培养细菌沉淀。基于106例,甲氧西林耐药的检测显示出99%的敏感性和特异性100%。有趣的是,中位时间报告从血培养阳性的核酸扩增技术的结果是等于201分钟(范围100-430),而位时间从MALDI-TOF鉴定报告了类似的结果等于97分钟(范围25〜 250)。

图1
图1: 前和后的MALDI-TOF的时代,相对于传统的诊断方法,其中包括一个O / N亚文化的样本,MALDI-TOF质谱鉴定可以以下样本运送到诊断实验室在几分钟内完成。 请点击这里查看本图的放大版本。

图2
图2:工作流的血培养处理从取样到MALDI-TOF质谱鉴定。当血培养阳性,细菌颗粒的制备是通过氯化铵裂解离心。这种细菌沉淀,然后用直接鉴定通过MALDI-TOF MS分析。 MALDI-TOF MS鉴定可在30至60分钟FO得到 llowing血培养阳性。 请点击这里查看该图的放大版本。

图3
图3的许多下游应用,包括革兰氏染色,MALDI-TOF MS鉴定,AST使用自动化系统和/或磁盘扩散测定法和快速的基于PCR的检测,如点护理测试项目完成报告(POCT-PCR)对MRSA的检测能直接在血液培养菌体进行。直接测试从细菌血培养粒料显著降低周转时间来报告ID和AST的结果是关键的,以改善患者的血液感染的痛苦的结果。 5fig3highres.jpg“目标=”_ blank将“>请点击这里查看该图的放大版本。

图4
图4中的氯化铵裂解离心协议允许从阳性血液培养液中制备的富集和纯化的细菌沉淀物。阳性血液的大肠杆菌培养物革兰氏染色,凝固酶阴性葡萄球菌头癣停乳链球菌前的准备之后执行血培养细菌沉淀。葡萄球菌的簇和链球菌在链中的经典形态更容易在天然血液培养液中观察到比血液培养细菌沉淀。比例尺= 25微米。=“_ blank将”>请点击这里查看该图的放大版本。

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Discussion

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相对于传统的血培养阳性的诊断方法,在快速采集细菌沉淀物通过使用氯化铵裂解离心方法减少时间由16至24小时的时间来报告AST由24至48小时( 图1和报告标识3)。

迅速出台相应的抗生素治疗是关键,以提高患者的血液感染患上的结果。因此,早期识别中1小时,随后在约8至16小时,得到了迅速的AST的传染性病原体的代表在脓毒症患者的临床管理有重大影响。革兰氏染色的快速报告已经对抗生素治疗,因此,在病人的发病率和死亡率6,7的减少有很大的影响有关。血培养细菌沉淀的革兰氏染色做可以增加灵敏度时,BL的革兰氏染色洪水培养液是阴性或弱阳性( 图4)。然而,在本机的血液培养液进行革兰氏染色,建议观察典型的形态,如葡萄球菌在群集或链球菌的链。在对202例血流感染的完成的最新的前瞻性研究中,从血培养粒料MALDI-TOF MS鉴定表明在抗生素治疗的影响的情况下为35.1%,而革兰氏染色过的情况下,8为20%只有一个额外的影响。有趣的是,观察到的临床管理的革兰氏染色和MALDI-TOF MS鉴定报告之间的影响的最大差异时具有增加的抗生素抗性相关的细菌如产AmpC 肠杆菌进行了通过MALDI-TOF MS来识别。同样,Martiny 等人已经表明,MALDI-TOF MS快速鉴定可紧抗生素治疗的适 ​​应情况为13.4%,而回顾性螺柱Y上Stoneking 进行建议采用快速鉴定引起菌血症的微生物可以帮助调节经验性治疗的病例的77%或者通过给予未包括的初始治疗方案或通过减少抗生素18,19频谱额外抗生素。此外,使用一种快速的基于PCR的测定法,如核酸扩增技术的MRSA以下S。葡萄球菌鉴定通过MALDI-TOF MS从血培养粒料允许提供最合适的抗生素治疗,在不到4小时的患者来自酿酒患金黄色葡萄球菌菌血症17。当排除患者有青霉素过敏,使用的核酸扩增技术的MRSA允许显著减少抗MRSA的抗生素滥用,如糖,从26.​​1%到8.1%。总之,这些数据表明,革兰氏染色法,MALDI-TOF MS的识别和快速的基于PCR的a的快速连续的报告从血培养粒料SSAY被显著提高抗生素治疗,因此临床管理以及患者从血液感染患的结果。

MALDI-TOF MS允许78.7%的正确识别的血培养的颗粒,这是一个非常不错的表现相比,84.1%的识别由传统的MALDI-TOF MS获得的速度就生长在琼脂平板上的菌落纯执行。更多的血液感染的50%是由细菌物种,例如肠杆菌科细菌金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌和肠球菌引起的。这些细菌被有效地鉴定通过MALDI-TOF MS检测,其可能产生积极影响的直接血液培养细菌沉淀进行MALDI-TOF MS鉴定了良好的性能。关于血培养粒料进行低性能对某些细菌物种的通过MALDI-TOF MS的识别主要是由于类似的因素比观察到的从生长在琼脂平板上的菌落纯的常规标识。例如,一些微生物物种如链球菌属于缓症组和凝固酶阴性葡萄球菌是密切相关的,并识别精度低,通过MALDI-TOF MS。此外,革兰氏阳性细菌的细菌细胞壁的特定组合物或致密的胶囊中的细菌种类,例如肺炎克雷伯氏菌观察到的存在显著降低裂解效率,从而对MALDI-TOF MS的识别性能。最后,MALDI-TOF MS的用于厌氧细菌的鉴定低性能主要是由于这些细菌在MALDI-TOF数据库的一个不完整的和差表示。

从血培养粒料MALDI-TOF MS的识别相比,从纯菌落常规鉴定的小​​性能降低,可能是由于残余的血蛋白Components或裂解,离心分离后得到的细菌的量不足。同样,直接与相比,这些接种分离的菌落可以通过残血培养成分,如蛋白质,血细胞及血液培养基化合物引起的,可能与细菌生长的干扰血液培养粒料接种的全自动微生物系统卡观察到的差异全自动微生物系统卡,可能对双方的身份证明和助攻à显著影响。此外,需要通过全自动微生物系统获得AST的结果采用纸片扩散试验也直接表现在血培养细菌沉淀,以验证某些已知的抗生素相比传统的方法来呈现显著差异的结果进行检查。然而,直接接种了血培养颗粒的全自动微生物系统卡呈现为肠杆菌科细菌和staphy一个优秀的ID和助攻的表现lococci。

因此,通过血培养阳性的氯化铵裂解离心分离得到的细菌沉淀已通过验证,直接执行一些下游应用允许必要的结果,如标识和AST在显著减少达比传统方法迅速报告。此外,附加的应用程序,例如超广谱β-内酰胺酶(ESBLs的)的测试已经被证实对血培养阳性的相似裂解离心方法论20表明它们也可以与在此工作中描述的协议中得到的细菌沉淀施加。

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Disclosures

作者宣称,他们没有竞争的经济利益。

Acknowledgments

我们感谢洛桑大学医院中心的细菌学实验室的技术人员的帮助,​​以实现在实验室的技术。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20 G needle Terumo, Leuven, Belgium NN-2038R
50 ml Falcon tube BD, Franklin Lakes, NJ, USA 352070 50 ml centrifuge tubes
Ammonium chlorure Merck, Darmstadt, Germany 101145
Potassium hydrogen carbonate Fluka, St. Louis, MO, USA  60340
Formic acid Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA  F0507 Flammable, corrosive
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid Fluka, St. Louis, MO, USA  70990 Acute toxicity
Acetonitrile Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA  271004 Flammable, acute toxicity
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA  T6508 Corrosive, acute toxicity
Vitek 2 60 instrument Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 27202 automated microbial system instrument
Vitek 2 Gram-positive (GP) card Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 21342 automated GP  identification card
Vitek 2 AST-P580 card Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 22233 automated microbial AST system
Vitek 2 Gram-negative (GN) card Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 21341 automated GN  identification card
Vitek 2 AST-N242 card Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 413391 automated microbial AST system
Xpert MRSA Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA  GXMRSA-100N-10 nucleic acid amplification technology MRSA
GeneXpert IV instrument Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA GXIV-4-D nucleic acid amplification technology instrument
Microflex LT MALDI-TOF MS instrument Bruker Daltonics, Bremen, Germany BDAL microflex LT/SH
MSP 96 target steel BC Bruker Daltonics, Bremen, Germany 280799 MALDI target plate
Densitometer Densicheck instrument Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 27208
MALDI Sepsityper kit 50 Bruker Daltonics, Bremen, Germany 8270170
Mac Conkey agar Biolife, Milano, Italy 4016702
Mueller-Hinton agar Oxoid, Hampshire, England CM0337 Mueller-Hinton agar (MH) 
MHF agar Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 43901 Mueller-Hinton agar-fastidious organisms agar (MHF)
BD columbia III agar BD, Franklin Lakes, NJ, USA 254071 blood agar
BD chocolate agar BD, Franklin Lakes, NJ, USA 254089 chocolate agar
BD schaedler agar BD, Franklin Lakes, NJ, USA 254084 Schaedler agar

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References

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Croxatto, A., Prod'hom, G., Durussel, C., Greub, G. Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing. J. Vis. Exp. (92), e51985, doi:10.3791/51985 (2014).More

Croxatto, A., Prod'hom, G., Durussel, C., Greub, G. Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing. J. Vis. Exp. (92), e51985, doi:10.3791/51985 (2014).

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