En hurtig bakteriel præparat pellet fra en positiv blod kultur kan anvendes som en prøve til applikationer, såsom identifikation af MALDI-TOF, Gram farvning, antibiotisk følsomhedstest og PCR-baserede test. Resultaterne kan hurtigt meddeles klinikere at forbedre resultatet af patienter med blodforgiftning.
Blodbanen infektioner og sepsis er en væsentlig årsag til sygelighed og dødelighed. Det vellykkede resultat af patienter med bakteriæmi afhænger af en hurtig identifikation af smitstoffet at vejlede en optimal behandling med antibiotika. Hurtigt kan udføres analyse af Gram pletter fra positiv blod kultur og allerede påvirke den antibiotiske regime betydeligt. Men den nøjagtige identifikation af det infektiøse agens stadig forpligtet til at etablere den optimale målrettet behandling. Vi præsenterer her en enkel og hurtig bakteriel forberedelse pellet fra en positiv blod kultur, der kan anvendes som en prøve til flere vigtige downstream-applikationer, såsom identifikation af MALDI-TOF MS, antibiotika resistensbestemmelse (AST) af disk diffusion assay eller automatiserede AST systemer og ved automatiseret PCR-baseret diagnostisk test. Udførelsen af disse forskellige identifikationsnumre og AST, der anvendes direkte på blodkultur bakterielle piller er meget siMilar udførelsen normalt udvindes af isolerede kolonier dyrket på agarplader. Sammenlignet med konventionelle metoder, den hurtige overtagelse af en bakteriel pille reducerer den tid til at rapportere både identifikation og AST betydeligt. Således kan følgende blod kultur positivitet, identifikation af MALDI-TOF indberettes inden for mindre end 1 time hvorimod resultaterne af AST fra automatiske AST systemer eller disk diffusion analyser inden for 8 til 18 timer, hhv. Ligeledes kan resultaterne af en hurtig PCR-baseret analyse meddeles de klinikere mindre end 2 timer efter rapporten fra en bakteriæmi. Tilsammen viser disse resultater, at en hurtig udarbejdelse af en blod kultur bakteriepellet har en betydelig indvirkning på identifikation og AST ekspeditionstid og dermed på det vellykkede resultat af patienter, der lider infektioner i blodbanen.
Blodbanen infektioner og sepsis hos indlagte patienter er en væsentlig årsag til sygelighed og dødelighed. Således er observeret dødelighed relateret til infektioner i blodet på omkring 14% til 37% af indlagte patient og kan stige til 35% i intensivafdelinger patienter 1-3. Hurtig identifikation af smitstoffet er afgørende at vejlede optimal antimikrobiel behandling og øge det vellykkede resultat af antimikrobiel terapi 4,5. Den hurtige analyse af Gram pletter fra positiv blod kultur har allerede en betydelig indvirkning på tilpasningen af antimikrobiel behandling 6,7 men præcis identifikation af smitstoffet er forpligtet til at yde den bedst tilpassede antibiotisk behandling til patienterne. For eksempel forskellige antibiotika behandlingsregimer skal gennemføres efter bakteriæmi med enterokokker og streptokokker, der er vanskelige at skelne fra Gram farvning. Ligeledes identifikation på de arter Level er påkrævet for at detektere gramnegative enterobakterier koder for et kromosomalt AMPC gen, som giver en forøget resistens over for β-lactamer 8.
Med en positiv blod kultur, den konventionelle diagnostiske metode er at videredyrke smitstoffet på forskellige agarplader, der kræver flere timers ekstra inkubation forudgående identifikation med forskellige tilgange, herunder biokemiske tests, vækst på forskellige selektive medier og automatiserede mikrobielle identifikationssystemer. Tiden til resultaterne af en konventionel diagnostisk fremgangsmåde er på omkring 1 til 3 dage.
Fremkomsten af matrix-assisteret laser desorption / ionisering tid-of-flight massespektrometri (MALDI-TOF)-teknologi til hurtig identifikation af mikroorganismer har givet et nyt redskab til hurtigt at identificere mikroorganismer fra kolonier dyrket på agarplader, men også direkte fra positiv blod kulturer (figur 1) 9-12. The brug af MALDI-TOF at identificere et smitstof fra blodkulturer har reduceret tid til resultaterne til et par minutter i stedet for de timer og dage, der kræves ved traditionelle metoder. Som diskuteret af Croxatto et al. 13 effektiviteten af MALDI-TOF-identifikation bygger på forskellige parametre, herunder mikroorganismen renhed og mængde. Disse to kriterier er nemt fås fra diskrete kolonier dyrket på agarplader, men krævede en præ-analytisk behandling for bakteriel berigelse og oprensning fra komplekse prøver såsom blod kultur, som indeholder flere cellulære og protein komponenter, der kan interferere med MALDI-TOF identifikation.
Forskellige mikroorganismer isolation metoder fra blod kultur er blevet brugt i en række undersøgelser, herunder saponin eller andre milde rengøringsmidler metode til bakteriel ekstraktion 9,14, serum separator metode 10 Lysis centrifugering metoder 12 </sop> og kommercielt løsninger som den sepsityper kit. Vores bakteriologi diagnostisk laboratorium har udviklet en simpel blod-kultur bakteriepellet forberedelse baseret på ammoniumchlorid erythrocyt-lyse, som gør det muligt hurtigt at identificere bakterier og gær ved MALDI-TOF og automatiserede identifikationssystemer (figur 2) 15. Dette blod-kultur pille præparat også give en prøve til andre direkte downstream-applikationer såsom Gram-farvning, automatiserede PCR-baserede diagnostiske tests såsom POCT-PCR til hurtig påvisning af methicillin-resistente Staphyloccocus aureus (MRSA), og antibiotikaresistens undersøgelserne med automatiserede AST og / eller ved disk diffusion assays på agarplader (Figur 3).
I dette arbejde har vi beskrive de forskellige trin til fremstilling af blod-kultur bakteriepellet som forklaret af Prod'hom et al. 15 (figur 4). Vi vil også deskriftlærde protokollerne for tre af de vigtigste programmer, der kan udføres på blod kultur pille: Identifikation ved MALDI-TOF 15, identifikation (ID), og antibiotisk følsomhedstestning (AST) med de automatiserede systemer 16 for enterobakterier og stafylokokker og automatiseret PCR- baseret diagnostisk test til påvisning af MRSA 17.
Sammenlignet med konventionelle positiv blod kultur diagnostiske metoder, den hurtige overtagelse af en bakteriel pille ved hjælp af ammoniumchlorid lyse centrifugering tilgang reducere den tid til at rapportere identifikation af 16 til 24 timer, og tiden til at rapportere AST ved 24 til 48 timer (figur 1 og 3).
Hurtig indførelse af passende antibiotikabehandling er afgørende at forbedre resultatet af patienter, der lider af infektioner i blodbanen. Således tidlig identi…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker teknikerne i bakteriologi laboratorium på University Hospital Center Lausanne for deres hjælp til at gennemføre de teknikker i laboratoriet.
20 needle gauge | Terumo, Leuven, Belgium | NN-2038R | |
50 ml Falcon tube | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 352070 | 50 ml centrifuge tubes |
Ammonium chlorure | Merck, Darmstadt, Germany | 101145 | |
Potassium hydrogen carbonate | Fluka, St. Louis, MO, USA | 60340 | |
Formic acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | F0507 | Flammable, corrosive |
a-Cyano-4-hydroxycinnamic acid | Fluka, St. Louis, MO, USA | 70990 | Acute toxicity |
Acetonitrile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 271004 | Flammable, acute toxicity |
Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T6508 | Corrosive, acute toxicity |
Vitek 2 60 instrument | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 27202 | automated microbial system instrument |
Vitek 2 Gram-positive (GP) card | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 21342 | automated GP identification card |
Vitek 2 AST-P580 card | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 22233 | automated microbial AST system |
Vitek 2 Gram-negative (GN) card | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 21341 | automated GN identification card |
Vitek 2 AST-N242 card | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 413391 | automated microbial AST system |
Xpert MRSA | Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA | GXMRSA-100N-10 | nucleic acid amplification technology MRSA |
GeneXpert IV instrument | Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA | GXIV-4-D | nucleic acid amplification technology instrument |
Microflex LT MALDI-TOF MS instrument | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | BDAL microflex LT/SH | |
MSP 96 target steel BC | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | 280799 | MALDI target plate |
Densitometer Densicheck instrument | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 27208 | |
MALDI Sepsityper kit 50 | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | 8270170 | |
Mac Conkey agar | Biolife, Milano, Italy | 4016702 | |
Mueller-Hinton agar | Oxoid, Hampshire, England | CM0337 | Mueller-Hinton agar (MH) |
MHF agar | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 43901 | Mueller-Hinton agar-fastidious organisms agar (MHF) |
BD columbia III agar | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 254071 | blood agar |
BD chocolate agar | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 254089 | chocolate agar |
BD schaedler agar | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 254084 | Schaedler agar |