Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

Fremstilling af en blodkultur Pellet til hurtig bakteriel identifikation og antibiotikaresistens undersøgelserne

doi: 10.3791/51985 Published: October 15, 2014

Summary

En hurtig bakteriel præparat pellet fra en positiv blod kultur kan anvendes som en prøve til applikationer, såsom identifikation af MALDI-TOF, Gram farvning, antibiotisk følsomhedstest og PCR-baserede test. Resultaterne kan hurtigt meddeles klinikere at forbedre resultatet af patienter med blodforgiftning.

Abstract

Blodbanen infektioner og sepsis er en væsentlig årsag til sygelighed og dødelighed. Det vellykkede resultat af patienter med bakteriæmi afhænger af en hurtig identifikation af smitstoffet at vejlede en optimal behandling med antibiotika. Hurtigt kan udføres analyse af Gram pletter fra positiv blod kultur og allerede påvirke den antibiotiske regime betydeligt. Men den nøjagtige identifikation af det infektiøse agens stadig forpligtet til at etablere den optimale målrettet behandling. Vi præsenterer her en enkel og hurtig bakteriel forberedelse pellet fra en positiv blod kultur, der kan anvendes som en prøve til flere vigtige downstream-applikationer, såsom identifikation af MALDI-TOF MS, antibiotika resistensbestemmelse (AST) af disk diffusion assay eller automatiserede AST systemer og ved automatiseret PCR-baseret diagnostisk test. Udførelsen af ​​disse forskellige identifikationsnumre og AST, der anvendes direkte på blodkultur bakterielle piller er meget siMilar udførelsen normalt udvindes af isolerede kolonier dyrket på agarplader. Sammenlignet med konventionelle metoder, den hurtige overtagelse af en bakteriel pille reducerer den tid til at rapportere både identifikation og AST betydeligt. Således kan følgende blod kultur positivitet, identifikation af MALDI-TOF indberettes inden for mindre end 1 time hvorimod resultaterne af AST fra automatiske AST systemer eller disk diffusion analyser inden for 8 til 18 timer, hhv. Ligeledes kan resultaterne af en hurtig PCR-baseret analyse meddeles de klinikere mindre end 2 timer efter rapporten fra en bakteriæmi. Tilsammen viser disse resultater, at en hurtig udarbejdelse af en blod kultur bakteriepellet har en betydelig indvirkning på identifikation og AST ekspeditionstid og dermed på det vellykkede resultat af patienter, der lider infektioner i blodbanen.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Blodbanen infektioner og sepsis hos indlagte patienter er en væsentlig årsag til sygelighed og dødelighed. Således er observeret dødelighed relateret til infektioner i blodet på omkring 14% til 37% af indlagte patient og kan stige til 35% i intensivafdelinger patienter 1-3. Hurtig identifikation af smitstoffet er afgørende at vejlede optimal antimikrobiel behandling og øge det vellykkede resultat af antimikrobiel terapi 4,5. Den hurtige analyse af Gram pletter fra positiv blod kultur har allerede en betydelig indvirkning på tilpasningen af antimikrobiel behandling 6,7 men præcis identifikation af smitstoffet er forpligtet til at yde den bedst tilpassede antibiotisk behandling til patienterne. For eksempel forskellige antibiotika behandlingsregimer skal gennemføres efter bakteriæmi med enterokokker og streptokokker, der er vanskelige at skelne fra Gram farvning. Ligeledes identifikation på de arter Level er påkrævet for at detektere gramnegative enterobakterier koder for et kromosomalt AMPC gen, som giver en forøget resistens over for β-lactamer 8.

Med en positiv blod kultur, den konventionelle diagnostiske metode er at videredyrke smitstoffet på forskellige agarplader, der kræver flere timers ekstra inkubation forudgående identifikation med forskellige tilgange, herunder biokemiske tests, vækst på forskellige selektive medier og automatiserede mikrobielle identifikationssystemer. Tiden til resultaterne af en konventionel diagnostisk fremgangsmåde er på omkring 1 til 3 dage.

Fremkomsten af ​​matrix-assisteret laser desorption / ionisering tid-of-flight massespektrometri (MALDI-TOF)-teknologi til hurtig identifikation af mikroorganismer har givet et nyt redskab til hurtigt at identificere mikroorganismer fra kolonier dyrket på agarplader, men også direkte fra positiv blod kulturer (figur 1) 9-12. The brug af MALDI-TOF at identificere et smitstof fra blodkulturer har reduceret tid til resultaterne til et par minutter i stedet for de timer og dage, der kræves ved traditionelle metoder. Som diskuteret af Croxatto et al. 13 effektiviteten af MALDI-TOF-identifikation bygger på forskellige parametre, herunder mikroorganismen renhed og mængde. Disse to kriterier er nemt fås fra diskrete kolonier dyrket på agarplader, men krævede en præ-analytisk behandling for bakteriel berigelse og oprensning fra komplekse prøver såsom blod kultur, som indeholder flere cellulære og protein komponenter, der kan interferere med MALDI-TOF identifikation.

Forskellige mikroorganismer isolation metoder fra blod kultur er blevet brugt i en række undersøgelser, herunder saponin eller andre milde rengøringsmidler metode til bakteriel ekstraktion 9,14, serum separator metode 10 Lysis centrifugering metoder 12 (figur 2) 15. Dette blod-kultur pille præparat også give en prøve til andre direkte downstream-applikationer såsom Gram-farvning, automatiserede PCR-baserede diagnostiske tests såsom POCT-PCR til hurtig påvisning af methicillin-resistente Staphyloccocus aureus (MRSA), og antibiotikaresistens undersøgelserne med automatiserede AST og / eller ved disk diffusion assays på agarplader (Figur 3).

I dette arbejde har vi beskrive de forskellige trin til fremstilling af blod-kultur bakteriepellet som forklaret af Prod'hom et al. 15 (figur 4). Vi vil også deskriftlærde protokollerne for tre af de vigtigste programmer, der kan udføres på blod kultur pille: Identifikation ved MALDI-TOF 15, identifikation (ID), og antibiotisk følsomhedstestning (AST) med de automatiserede systemer 16 for enterobakterier og stafylokokker og automatiseret PCR- baseret diagnostisk test til påvisning af MRSA 17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Denne protokol er blevet udviklet og valideret efter forskning og udviklingsprocesser og etiske regler på vores institution før de bliver implementeret som en rutinemæssig værktøj.

1. Fremstilling af en blodkultur bakteriepellet af Ammoniumklorid Erythrocyte-lyserende Procedure

  1. Fremstilling af en positiv blod kultur for efterfølgende centrifugering.
    1. Steriliser blodkultur hætte. Tilføj 70% ethanol på hætten af ​​flasken og brænde det.
      BEMÆRK: Du må ikke udføre dette trin under en laminar flow hætte.
    2. Flyt flasken til en laminar flow hætte. Saml 5 ml blod kultur med en 20 G sprøjte.
    3. Tilsæt 5 ml blod kultur i et 50 ml centrifugerør indeholdende 45 ml sterilt vand (H2O) og blandes prøven.
  2. Fremstilling af en blodkultur bakteriepellet ved lyse centrifugering.
    1. Centrifugeres prøven ved 1.000 xg i 10 minutter ved stuetemperatur.
    2. Remove supernatanten (som indeholder primært H 2 O og blodceller) med et laboratorium vakuumpumpe.
    3. Pellet resuspenderes i 1 ml hjemmelavet ammoniumchlorid lyseringsopløsning (0,15 M NH4Cl, 1 mM KHCO 3). Nedbryd pellet ved skrabning og ved hvirvelbehandling røret og centrifugeres ved 140 xg i 10 minutter ved stuetemperatur.
    4. Supernatanten der hovedsagelig består af røde blodlegemer vragrester.
      1. Hvis pellet forblev blødende, resuspender pelleten i 2 ml steril og destilleret H 2 0 yderligere lysere tilbageværende røde blodlegemer, og at vaske bundfaldet. Centrifugeres prøven ved 140 xg i 10 minutter ved stuetemperatur og kassér supernatanten.
    5. Resuspender pellet i 200 ul H2O
  3. Subkultur af blod kultur på forskellige selektive og ikke-selektiv agar medier.
    1. Saml en ml blod kultur med en 20 G sprøjte.
    2. Podes 1 dråbe blod kultur into fire kvadranter på blodagar, chokoladeagar, McConkey-agar og Schaedler agar.
    3. Der inkuberes ved 37 ° C, blodagar og chokolade-agarplader i en 5% CO2-atmosfære, den McConkey-agar i en normal atmosfære og Schaedler agarplade i anaerobe forhold.
    4. Følg bakterievækst på de forskellige medier.
    5. Check for bakteriel renhed.

2. Identifikation af MALDI-TOF MS

  1. Direkte identifikation fra blodet pellet.
    1. Overfør 1 ml af blodet pellet på en MALDI måltavle, og lad det tørre på en 42 ° C varme platform.
    2. Overlay prøven med 1 ul 70% myresyre og lad det tørre på en 42 ° C varme platform.
    3. Overlay prøven med 1 ml af MALDI-matrix (mættet opløsning af α-cyano-4-hydroxykanelsyre i 50% acetonitril-2,5% trifluoreddikesyre) og lad det tørre på en 42 ° C varme platform.
    4. Fortsæt til MALDI-TOF MS analyse med MALDI-TOF-MS-system som beskrevet af producenterne.
    5. Hvis identifikationen score er ugyldig på artsniveau (for eksempel med en score <2), udføre et protein ekstraktion af blod pellet prøven.
  2. Identifikation efter proteinekstraktion fra blodet kultur pelleten.
    1. Bland 20 ul pelleten med 1 ml 70% ethanol og centrifugeres ved 13.000 xg i 2 min ved stuetemperatur.
    2. Supernatanten fjernes, og tilsættes 25 ul 70% myresyre og 25 ul 100% acetonitril til pelleten. Vortex kraftigt for at resuspendere pillerne. Resuspender hårde pellets ved at bryde dem ned med pipettespidser før vortexbehandling.
    3. Centrifugeres ved 13.000 x g i 2 minutter ved stuetemperatur. Overfør 1 ml af supernatanten (som indeholder ekstraherede proteiner) på en MALDI måltavle, og lad det tørre på en 42 ° C varme platform. Fortsæt som beskrevet i 2.1.2.

3. Bakteriel Identifgement og antibiotikaresistens undersøgelserne med en automatiseret Mikrobiel System

  1. Fremstilling af en bakterieopløsning for bakteriel identifikation og AST med en automatiseret mikrobielle system.
    1. Forbered et plastrør indeholdende 3 ml sterilt 0,45% NaCl-opløsning forenelig med automatiserede mikrobielle system.
    2. Tilføj et tilstrækkeligt volumen af ​​blod kultur pelleten i 0,45% NaCl-opløsning til opnåelse af en bakteriesuspension, der svarer til en McFarland turbiditet fra 0,6 til 0.8. Mål turbiditet ved hjælp af et densitometer maskine.
      BEMÆRK: Volumenet af blod kultur bakteriepelleten varierer fra 50 til 200 pi at opnå en McFarland turbiditet fra 0,6 til 0.8.
  2. Podes de automatiserede grampositive (GP) eller Gram-negativ (GN) kort til identifikation og de automatiserede AST kort til resistensbestemmelse af grampositive coccer og Gram-negative bakterier som beskrevet af producenten.
    BEMÆRK: Identification med GP eller GN kort ikke er anvendt, hvis MALDI-TOF MS identifikation pointværdi er> 2. Kontroller renheden af ​​den bakterielle suspension ved subkultivering bakteriesuspensionen på blod agar (GP og GN) og MacConkey agar (GN) plader.

4. antibiotikaresistens undersøgelserne af Disk Diffusion Assay

Disken diffusion assay er beskrevet af Den Europæiske Komité for resistensbestemmelse (EUCAST, Version 3.0, April 2013 www.eucast.org).

  1. Udarbejdelse af en bakteriesuspension at udføre resistensbestemmelse af disk diffusion assay.
    1. Forbered et glasrør indeholdende 3 ml sterilt 0,9% NaCl-opløsning.
    2. Tilføj et tilstrækkeligt volumen af ​​blod kultur pelleten i 0,9% NaCl-opløsning til opnåelse af en bakteriesuspension, der svarer til en McFarland turbiditet på 0,5. Mål turbiditet ved hjælp af et densitometer maskine.
      BEMÆRK: Volumenet af blod kulturbakteriepellet varierer fra 50 til 200 pi at opnå en McFarland turbiditet fra 0,6 til 0.8.
    3. Vortex bakteriesuspensionen.
  2. Podning af bakteriesuspension på Mueller-Hinton-agar (MH) eller Mueller-Hinton-agar-kræsne organismer agar (MHF) (MH suppleret med 5% defibrineret hesteblod og 20 mg / l β-nicotinamid-adenin-dinucleotid).
    1. Dyp en steril vatpind i bakteriesuspensionen og forsigtigt fjerne overskydende væske ved at dreje vatpinden på indervæggen af ​​glasrøret.
    2. Spred bakteriesuspensionen jævnt på hele overfladen af ​​MH / MHF agarplade ved pensling i tre retninger eller ved hjælp af en automatiseret plade rotator.
  3. Anvendelse af antimikrobielle diske på podede agarplader.
    1. Anvend nøje diske på overfladen af ​​de tørrede inokulerede agarplader manuelt eller ved hjælp af en modtagelighed disk dispenser.
    2. Inkubér pladen på et passende temperatur og atmosfære som beskrevet i resistensbestemmelse EUCAST disk diffusion metode (Version 3.0, April 2013 www.eucast.org).

5. Automatiseret PCR-baseret diagnostisk test til påvisning af MRSA

  1. Med en mikropipette overføre 50 ul af blodkultur pillen i prøven reagensflasken forsynet med MRSA automatiserede PCR-baseret test-kit og vortex diagnostisk løbet 20 sek.
  2. Ved hjælp af en 1 ml mikropipette, dispensere prøven i prøven porten af ​​patronen. Sæt patronen i den automatiserede PCR-system og start assay som beskrevet af fabrikanten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

I udføres af Prod'hom et al. 15 undersøgelse blev bakterielle opnåede pellets af ammoniumchlorid lysis centrifugering af 122 positivt blod kultur fra 78 patienter analyseret ved MALDI-TOF-MS. Ud af 122 positiv blod kultur, blev 95 (77,9%) korrekt identificeret på artsniveau og én (0,8%) ved slægten niveau. De resterende 26 (21,3%) blod kultur piller gav ingen pålidelig identifikation af MALDI-TOF. Blandt dem var 21 gram-positive bakterier, herunder 13 streptokokker og 5 koagulase-negative stafylokokker. Vigtigere, 10 ud af de 13 uidentificerede streptokokker var Streptococcus pneumoniae, som ofte besidder en svært-Lyse kapsel og er næppe skelnes fra arter af S. mitis gruppe ved hjælp af MALDI-TOF MS. Fem gram-negative bakterier er ikke identificeret ved MALDI-TOF, blandt hvilke fire vanskelige at lysere indkapslet bakteriearter, herunder to Klebsiella pneumoniae og to Haemophilus influenzae. Således blev korrekt identifikation af MALDI-TOF opnået i 78,7% af kultur pellets blod, hvilket er en effektiv ydeevne i forhold til 84,1% af identifikation opnået fra traditionel identifikation af bakteriekolonier dyrket på agarplader 11.

Udførelsen af ​​automatiserede mikrobielle system til bakteriel identifikation (ID) og AST blev testet på 278 bakterielle pellets af positiv blod kultur for grampositive kokker i klynge og Gram-negative bakterier. Disse resultater blev sammenlignet med konventionelle resultater opnået med de automatiserede mikrobielle systemets kort fra kolonier dyrket på agarplader efter subkultur af positiv blod kultur på passende medier 16. Direkte identifikation ved hjælp af mikrobielle identifikationssystem ID-kort kan bruges, når identifikation af bakteriepelleten ved MALDI-TOF MS har svigtet. I forhold til en endelig identifikation af MALDI-TOF MS, en korrekt identifikation medmikrobielle identifikationssystem id-kort blev observeret i 99% af Enterobacteriaceae, 74% af stafylokokker, 71% af ikke-fermentative Gram-negative bakterier og 33% af andre Gram-positive kokker. En fejlagtig identifikation blev observeret i 11% af de samlede sager mens 8% af bakterielle piller gav ingen identifikation. I alt 220 bakterielle piller herunder 87 enterobakterier og 133 stafylokokker blev analyseret for AST med automatiseret mikrobielle system, AST GN26 og AST 580 kort 16. Resultaterne blev analyseret i henhold til definitionerne af den amerikanske Food and Drug Administration (FDA) for fortolkende aftale resultater, som definerede en falsk modtagelig som en meget alvorlig fejl (VME) og en falsk modstandsdygtig som en væsentlig fejl (ME). AST opnået fra direkte podning af blod kultur pellet forhold til podning fra kolonier dyrket på agarplader viste 0,1% VME og 0,3% ME for enterobakterier, og 0,7% VME og 0,1% ME stafylokokker. Således udførelsen af ​​ASTkort podet direkte med kultur piller blod er i overensstemmelse med de kriterier, der er godkendt af FDA ydeevne.

Udførelsen af PCR-baseret nukleinsyreamplifikationsteknologi MRSA test målretning spa blev mecA og SCC generne anvendes direkte på Staphylococcus aureus blod kultur bakterielle pellets identificeret ved MALDI-TOF MS 17. Baseret på 106 tilfælde, påvisning af methicillinresistens udviste en 99% følsomhed og en 100% specificitet. Interessant, at den gennemsnitlige tid indberette nukleinsyreamplifikationsteknologi resultater fra blod kultur positivitet var lig med 201 min (varierende fra 100 til 430), mens den mediane tid fra MALDI-TOF identifikation til at rapportere lignende resultater var lig med 97 min (varierende 25- 250).

Figur 1
Figur 1. før og efter en MALDI-TOF æra. Sammenlignet med konventionelle diagnostiske metoder, som omfatter en O / N subkultur af prøven, kan MALDI-TOF MS identifikation skal udføres inden for få minutter følgende prøver levering til diagnostisk laboratorium. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Arbejdsgang af blod kultur behandling fra prøveudtagning til MALDI-TOF MS identifikation. Når blodkulturer er positive, er en bakteriel pille udarbejdet af ammoniumchlorid lyse centrifugering. Denne bakteriepellet anvendes derefter til direkte identifikation af MALDI-TOF MS. MALDI-TOF MS identifikation kan opnås inden for 30 til 60 minutter fo llowing blod kultur positivitet. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Mange downstream applikationer, herunder Gram-farvning, MALDI-TOF MS identifikation, AST hjælp af automatiserede systemer og / eller disk diffusion assays og hurtig PCR-baseret test, såsom point of care test PCRs (POCT-PCR) til påvisning af MRSA kan udføres direkte på blod kultur bakteriepelleten. direkte test fra de bakterielle blod kultur pellets mindske turn-around tid til at rapportere ID og AST resultater, som er afgørende for at forbedre resultatet af patienter med infektioner i blodbanen. 5fig3highres.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4. ammoniumchlorid lysis centrifugering protokol tillader fremstillingen af en beriget og oprenset bakteriel pellet fra positive blod kulturnæringssupper. Gramfarvning positiv blod kultur af Escherichia coli, koagulase-negative Staphylococcus capitis og Streptococcus dysgalactiae udført før og efter fremstillingen af blod kultur bakteriepelleten. De klassiske morfologier af stafylokokker i klynger og streptokokker kæder lettere observeres i det native blod dyrkningsvæsken end i blodet kultur bakteriepelleten. Scale bar = 25 um.= "_blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Sammenlignet med konventionelle positiv blod kultur diagnostiske metoder, den hurtige overtagelse af en bakteriel pille ved hjælp af ammoniumchlorid lyse centrifugering tilgang reducere den tid til at rapportere identifikation af 16 til 24 timer, og tiden til at rapportere AST ved 24 til 48 timer (figur 1 og 3).

Hurtig indførelse af passende antibiotikabehandling er afgørende at forbedre resultatet af patienter, der lider af infektioner i blodbanen. Således tidlig identifikation af smitstoffer inden for 1 time efterfulgt af et hurtigt AST opnået i omkring 8 til 16 timer udgør en stor betydning i den kliniske behandling af septiske patienter. Den hurtige indberetning af Gram-farvning er allerede forbundet med en stor indvirkning på antimikrobiel behandling og således med et fald i patientens sygelighed og dødelighed 6,7. Gram-farvning af blodet kultur bakteriepelleten kan udføres for at øge følsomheden når Gram farvning af blood dyrkningsvæsken er negativ eller svagt positiv (figur 4). Gram-farvning udføres på den indfødte blodkultur bouillon anbefales dog, at observere typiske morfologier såsom stafylokokker i klynger eller streptokokker i lænker. I en nylig prospektivt studie udført på 202 tilfælde af infektion i blodet, MALDI-TOF MS identifikation fra kultur piller blod viste en effekt i antibiotisk behandling i 35,1% af tilfældene, mens Gram-farvning havde kun en ekstra effekt i 20% af tilfældene 8. Interessant nok blev den maksimale forskel i effekt mellem Gram-farvning og MALDI-TOF MS identifikation rapportering om den kliniske behandling observeret, når bakterier forbundet med øget antibiotikaresistens såsom AmpC-producerende Enterobacteriaceae blev identificeret ved MALDI-TOF MS. Tilsvarende Martiny et al. Har vist, at MALDI-TOF MS hurtig identifikation kan fastgøre tilpasning af antibiotikabehandling i 13,4% af tilfældene, mens en retrospektiv study udført af Stoneking et al. foreslået, at en hurtig identifikation af mikroorganismer, der forårsager bakteriæmi kan hjælpe justere empirisk behandling i 77% af tilfældene, enten ved at administrere en supplerende antibiotisk ikke omfattet af den oprindelige regime eller ved at reducere spektrum af antibiotika 18,19 . Endvidere er anvendelsen af en hurtig PCR-baseret assay, såsom nukleinsyreamplifikationsteknologi MRSA efter S. aureus identifikation ved MALDI-TOF MS fra blod kultur pellets lov til at give den mest passende antibiotikabehandling i mindre end 4 timer til patienter, der lider fra S. aureus bakteriæmi 17. Når der bortses fra patienter med penicillinallergi, anvendelsen af ​​nukleinsyreamplifikationsteknologi MRSA have en betydelig reduktion af anti-MRSA antibiotika misbrug såsom glycopeptider fra 26,1% til 8,1%. Sammen antyder disse data, at hurtig sekventiel rapportering af Gram-farvning, MALDI-TOF MS identifikation og hurtig PCR-baseret enssay fra blod kultur pellets betydelig forbedring af antibiotikabehandling og dermed den kliniske ledelse samt resultatet af patienter, der lider infektioner i blodbanen.

MALDI-TOF MS have en 78,7% korrekt identifikation af kultur pellets blod, hvilket er en meget god ydeevne i forhold til en sats på 84,1% identifikation opnået ved konventionel MALDI-TOF MS udføres på rene kolonier dyrket på agarplader. Mere end 50% af blodbanen infektioner forårsaget af bakterielle arter, såsom Enterobacteriaceae, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa og enterokokker. Disse bakterier effektivt identificeret ved MALDI-TOF MS, der sandsynligvis en positiv indflydelse på gode resultater af MALDI-TOF MS identifikation udføres direkte på blod kultur bakterielle pellets. Den lave ydelse til identifikation af visse bakteriearter ved MALDI-TOF MS udført på kultur piller blod skyldes primært lignende faktorerend observeret for konventionelle identifikation fra rene kolonier dyrket på agarplader. For eksempel flere mikrobielle arter såsom streptokokker tilhører mitis gruppen og koagulase-negative stafylokokker er tæt forbundne og identificeret med lav nøjagtighed ved MALDI-TOF MS. Desuden er en særlig sammensætning af den bakterielle cellevæg af Gram-positive bakterier eller tilstedeværelsen af en tæt kapsel observeret i bakterielle arter, såsom Klebsiella pneumoniae signifikant fald lysis effektivitet og dermed udførelsen af MALDI-TOF MS identifikation. Endelig betyder den lave ydelse af MALDI-TOF-MS til identifikation af anaerobe bakterier er hovedsageligt på grund af en ufuldstændig og dårlig repræsentation af disse bakterier i MALDI-TOF-databasen.

Den lille formindsket præstationsevne MALDI-TOF MS identifikation fra blod kultur piller sammenlignet med konventionel identifikation fra rene kolonier kan skyldes overskydende blod protein Components eller til en utilstrækkelig mængde af bakterier opnået efter lyse-centrifugering. Tilsvarende forskelle observeret med de automatiserede mikrobielle systemkort inokuleret direkte med blod kultur-pellets i forhold til dem, podet med isolerede kolonier kan være forårsaget af kultur komponenter resterende blod, såsom proteiner, blodlegemer og blod mellemstore forbindelser, som kan interferere med bakteriel vækst i automatiseret mikrobiel systemets kort, og kan have en betydelig indvirkning på både identifikation og AST. Desuden AST resultater opnået ved automatiserede mikrobielle systemer skal kontrolleres ved disken diffusion assays også udføres direkte på blod kultur bakterielle pellets at validere resultaterne af visse antibiotika er kendt for at præsentere væsentlige afvigelser i forhold til konventionelle metoder. Men direkte podning af de automatiske mikrobielle systemets kort med blod kultur piller præsenterer en glimrende id og AST ydeevne for både enterobakterier og Staphylococci.

Således har bakteriepelleten opnået ved ammoniumchlorid lyse centrifugering af positive bloddyrkninger blevet valideret til direkte udføre flere downstream-applikationer, der muliggør en hurtig rapportering af væsentlige resultater såsom id og AST i et væsentligt reduceret TAT forhold til konventionelle metoder. Desuden har yderligere applikationer såsom udvidede spektrum β-lactamaser (ESBL) afprøvning blevet valideret på lignende lyse centrifugering af positiv blod kultur metodologier 20 tyder på, at de også kan anvendes på bakteriepelleten opnået med protokollen beskrevet i dette arbejde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Vi takker teknikerne i bakteriologi laboratorium på University Hospital Center Lausanne for deres hjælp til at gennemføre de teknikker i laboratoriet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20 G needle Terumo, Leuven, Belgium NN-2038R
50 ml Falcon tube BD, Franklin Lakes, NJ, USA 352070 50 ml centrifuge tubes
Ammonium chlorure Merck, Darmstadt, Germany 101145
Potassium hydrogen carbonate Fluka, St. Louis, MO, USA  60340
Formic acid Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA  F0507 Flammable, corrosive
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid Fluka, St. Louis, MO, USA  70990 Acute toxicity
Acetonitrile Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA  271004 Flammable, acute toxicity
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA  T6508 Corrosive, acute toxicity
Vitek 2 60 instrument Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 27202 automated microbial system instrument
Vitek 2 Gram-positive (GP) card Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 21342 automated GP  identification card
Vitek 2 AST-P580 card Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 22233 automated microbial AST system
Vitek 2 Gram-negative (GN) card Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 21341 automated GN  identification card
Vitek 2 AST-N242 card Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 413391 automated microbial AST system
Xpert MRSA Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA  GXMRSA-100N-10 nucleic acid amplification technology MRSA
GeneXpert IV instrument Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA GXIV-4-D nucleic acid amplification technology instrument
Microflex LT MALDI-TOF MS instrument Bruker Daltonics, Bremen, Germany BDAL microflex LT/SH
MSP 96 target steel BC Bruker Daltonics, Bremen, Germany 280799 MALDI target plate
Densitometer Densicheck instrument Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 27208
MALDI Sepsityper kit 50 Bruker Daltonics, Bremen, Germany 8270170
Mac Conkey agar Biolife, Milano, Italy 4016702
Mueller-Hinton agar Oxoid, Hampshire, England CM0337 Mueller-Hinton agar (MH) 
MHF agar Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 43901 Mueller-Hinton agar-fastidious organisms agar (MHF)
BD columbia III agar BD, Franklin Lakes, NJ, USA 254071 blood agar
BD chocolate agar BD, Franklin Lakes, NJ, USA 254089 chocolate agar
BD schaedler agar BD, Franklin Lakes, NJ, USA 254084 Schaedler agar

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alberti, C., et al. Epidemiology of sepsis and infection in ICU patients from an international multicentre cohort study. Intensive care medicine. 28, 108-121 (2002).
  2. Angus, D. C., et al. Epidemiology of severe sepsis in the United States: analysis of incidence, outcome, and associated costs of care. Critical care medicine. 29, 1303-1310 (2001).
  3. Vincent, J. L., et al. Sepsis in European intensive care units results of the SOAP study. Critical care medicine. 34, 344-353 (2006).
  4. Micek, S. T., et al. Empiric combination antibiotic therapy is associated with improved outcome against sepsis due to Gram-negative bacteria a retrospective analysis. Antimicrob Agents Chemother. 54, 1742-1748 (2010).
  5. Seifert, H. The clinical importance of microbiological findings in the diagnosis and management of bloodstream infections. Clin Infect Dis. 48, S238-S245 (2009).
  6. Barenfanger, J., et al. Decreased mortality associated with prompt Gram staining of blood cultures. American journal of clinical pathology. 130, 870-876 (2008).
  7. Munson, E. L., Diekema, D. J., Beekmann, S. E., Chapin, K. C., Doern, G. V. Detection and treatment of bloodstream infection: laboratory reporting and antimicrobial management. J Clin Microbiol. 41, 495-497 (2003).
  8. Clerc, O., et al. Impact of matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry on the clinical management of patients with Gram-negative bacteremia a prospective observational study. Clin Infect Dis. 56, 1101-1107 (2013).
  9. Meex, C., et al. Direct identification of bacteria from BacT/ALERT anaerobic positive blood cultures by MALDI-TOF MS MALDI Sepsityper kit versus an in-house saponin method for bacterial extraction. Journal of medical microbiology. 61, 1511-1516 (2012).
  10. Moussaoui, W., et al. Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry identifies 90% of bacteria directly from blood culture vials. Clin Microbiol Infect. 16, 1631-1638 (2010).
  11. Seng, P., et al. Ongoing revolution in bacteriology routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin Infect Dis. 49, 543-551 (2009).
  12. Stevenson, L. G., Drake, S. K., Murray, P. R. Rapid identification of bacteria in positive blood culture broths by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry. J Clin Microbiol. 48, 444-447 (2010).
  13. Croxatto, A., Prod&34hom, G., Greub, G. Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology. FEMS Microbiol Rev. 36, 380-407 (2012).
  14. Chen, J. H., et al. Direct bacterial identification in positive blood cultures by use of two commercial matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry systems. J Clin Microbiol. 51, 1733-1739 (2013).
  15. Prod&34hom, G., Bizzini, A., Durussel, C., Bille, J., Greub, G. Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry for direct bacterial identification from positive blood culture pellets. J Clin Microbiol. 48, 1481-1483 (2010).
  16. Prod&34hom, G., Durussel, C., Greub, G. A simple blood-culture bacterial pellet preparation for faster accurate direct bacterial identification and antibiotic susceptibility testing with the VITEK 2 system. Journal of medical microbiology. 62, 773-777 (2013).
  17. Clerc, O., et al. Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry and PCR-based rapid diagnosis of Staphylococcus aureus bacteraemia. Clin Microbiol Infect. (2013).
  18. Martiny, D., et al. Impact of rapid microbial identification directly from positive blood cultures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry on patient management. Clin Microbiol Infect. 19, E568-E581 (2013).
  19. Stoneking, L. R., et al. Would earlier microbe identification alter antibiotic therapy in bacteremic emergency department patients. The Journal of emergency medicine. 44, 1-8 (2013).
  20. Nordmann, P., Dortet, L., Poirel, L. Rapid detection of extended-spectrum-beta-lactamase-producing Enterobacteriaceae. J Clin Microbiol. 50, 3016-3022 (2012).
Fremstilling af en blodkultur Pellet til hurtig bakteriel identifikation og antibiotikaresistens undersøgelserne
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Croxatto, A., Prod'hom, G., Durussel, C., Greub, G. Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing. J. Vis. Exp. (92), e51985, doi:10.3791/51985 (2014).More

Croxatto, A., Prod'hom, G., Durussel, C., Greub, G. Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing. J. Vis. Exp. (92), e51985, doi:10.3791/51985 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter