Summary
为单一平面照明显微镜的模块（SPIM）中描述了很容易适应的倒宽视场显微镜和3维细胞培养物进行了优化。样品位于一个矩形的毛细管，并通过微流体系统的荧光染料，药物制剂或药物可以以小批量应用。
Abstract
这是很容易适应于一个倒置的宽视场显微镜和三维细胞培养物的优化，对于光片或单个平面照明显微镜（SPIM）中描述的模块， 例如，多细胞肿瘤球体（MCTS）。在SPIM激发模块的形状和偏转，使得样品被光片照射垂直于显微镜的检测路径的光。该系统的特点是利用一个矩形毛细管的用于保持（和在一个先进的版本也被用于旋转微毛细管的方法）的样品中，由照明光片的同步调整并用于荧光检测以及物镜通过微流体系统的应用的荧光染料，在少量的药物制剂或药物的适应性。给出的协议与该系统的工作，和一些技术细节的报告。代表性的结果包含的向上（1）的测量在添加氧化剂的需要抑制细胞生长的药物（阿霉素）和其部分转化为降解产物，（2）氧化还原测量通过使用遗传编码谷胱甘肽传感器，以及（3）启动和细胞坏死的经抑制的标签线粒体呼吸链。本SPIM模块与现有系统相比，差别和优点进行了讨论。
Introduction
除了 公认的方法（共焦或多光子激光扫描显微术1-4，结构照明显微镜5,6）光片或单个平面照明显微镜（SPIM）已被证明是三维成像7,8的一种有价值的方法， 9。特别令人感兴趣的是其应用到三维细胞培养物， 例如，多细胞肿瘤球体（MCTS），它们越来越多地用于药物发现研究10,11。再者，SPIM是当即使在长期暴露或重复测量低光剂量必须保持样品的可行性，因为用于样品仅此平面被曝光的每个平面的测定的优先方法。这是相对于其他显微技术，其中对于检测各焦平面的整个样品被照射，使记录的许多平面时的光量总和起来，并可能损坏样品12。 光片显微镜或SPIM是根据与观察路径的样品在垂直方向上或者通过使用圆柱形透镜的或者通过扫描激动人心的激光束（用于见参考文献8评论）的照明。这通常需要特殊的样品室13,14或矩阵， 例如，琼脂糖7,15，在特殊的高性价比的显微镜来实现。作为替代那些系统中可比简单的照明装置，SPIM已经开发并适于常规的倒置显微镜16（参见图1）。它由激光束扩大到直径为8毫米，集中由一个圆柱形镜头（焦距：50毫米，数值孔径：0.08），以6-10微米厚的片状光通过景深约100微米。样品位于600至900微米内径的矩形毛细管放置在显微镜物镜的len的前S代表荧光检测。这些主要功能是目前完成，通过使用先进的微毛细管的方法，用于保持和转动用于荧光检测（相同光路中的样本，照射光片的同步调整（在轴向）和物镜的优化位移的长度，所需要的机械进给的校正），和一微流体系统的适配为应用荧光染料，药物制剂或药物，从而减少所需的数量和费用。
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Protocol
1，细胞球体生长，育成
- 实验1：细胞球体培养与化疗药物
- 通过添加0.45克琼脂糖至30ml培养基中（足够用于6孔板）制备琼脂糖1.5％的培养基。
- 加热该混合物从步骤1.1.1至至少80℃，同时从时间搅拌时间。
- 补加入50μl从步骤1.1.2加热混合物到96孔板的每个孔中，并让在1-2小时之固化。储存关闭和覆盖在冰箱中于5℃下直到使用的板。
- 种子约150 MCF-7乳腺癌细胞中所制备的96孔板，在Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）和火腿的F-12培养基中补充有10％胎牛血清（FCS）和1％青霉素/链霉素的每个孔。
- 在5％CO 2和37在培养箱中生长球状5-7天达到直径约为200-300微米76℃。
- 孵育的细胞球粒用蒽环类抗生素多柔比星盐酸盐为6小时，其浓度在5％CO 2和37℃下2微米和8微米（在培养基中）在培养箱之间的范围内。
- 洗细胞球状体与培养基或Earle氏平衡盐溶液（EBSS）于显微镜之前。
- 实验2：在球体表达氧化还原传感器的氧化过程
- 种子约96孔板中在DMEM 400 U251-MG-L106成胶质细胞瘤细胞中永久地转染了谷胱甘肽敏感的绿色荧光的氧化还原传感器Grx1-roGFP2在琼脂糖凝胶包被的孔（在步骤中描述的步骤1.1.1-1.1.3）培养基补充有10％FCS，1％青霉素/链霉素和潮霉素B（150微克/毫升）。
- 在5％CO 2和37℃下生长的球体5-7天达到直径约为200-300微米的培养箱。
- 添加10＃181;将在12小时用升的过氧化氢溶液（purum PA，≥30％），以990微升双蒸水来创建100mM的储备液。
- 在实验前才从步骤稀释原液1.2.3到50μm的EBSS。
- 测量与过氧化氢50μm的EBSS为氧化还原传感器的氧化过程中孵育通过微流体系统的细胞球状体。
- 实验3：启动和球体内部细胞坏死的标签
- 96孔板的DMEM培养基中补充有种子约400个细胞（ 如 U251-MG-L106-Grx1-roGFP2胶质母细胞瘤细 胞），在琼脂糖凝胶包被的孔（在步骤中描述的步骤1.1.1-1.1.3） 10％FCS，1％青霉素/链霉素和潮霉素B（150毫克/毫升）。
- 在5％CO 2和37℃下生长的球体5-7天达到直径约为200-300微米的培养箱。
- 孵育细胞球体与在1μM的在培养基中的浓度的线粒体电子传递抑制剂鱼藤酮3小时以诱导细胞坏死。另外，以1微升的1毫升培养基中的浓度共同孵育带有绿色的细胞毒性染料3小时以标记坏死细胞。
- 用培养基或EBSS之前镜检洗细胞球体。
2，光表调整
注意：为了达到最好的结果是，必须确保该光板的光束腰是在物镜的聚焦平面上。束腰的位置可以仅通过观察光片在垂直位置相对于毛细管对齐（参见步骤2.5 - 2.8）。
- 用倒置显微镜和安装SPIM激励模块，在参考文献中描述。 16，在定位表的底板（ 见图1A）。
- 装备显微镜用10X / 0.3或20X / 0.5的显微镜物镜和一个适当的长通滤波器（ 例如，λ≥515纳米），在显微镜的检测路径。
- 安装积分照相机的显微镜的检测端口。
- 使用激光或激光二极管的并联的准直光束用的优选470nm处的激发波长和其应用到SPIM模块。
- 通过90度时，其中光片传送到用于光片的光束腰的轴向调整垂直位置旋转的圆柱形透镜。
- 将包含在样品架荧光染料液体的毛细管。
- 附加的样本保持器与毛细管到显微镜的定位表和对准毛细管，使得它的中心和光板的光腰是在焦点的位置。
- 通过柱面透镜本身的轴向位置的变化调整束腰。回头的广告后，镜头校正配料。
3，细胞球体的应用和显微镜饲料同步
- 单独或在长方形的硼硅玻璃毛细管16内组将细胞球粒用的600微米×600微米的内横截面和120微米的壁厚。两种技术的细胞球状体的应用已经被证明是成功的。
- 以空毛细管直立用拇指和中指，然后封好上口与你的食指。使下部开口附近的细胞球状体在其周围的液体（EBSS或培养基）。从上部开口松开食指。液体，在它的细胞球体将被毛细力立刻浸泡。调整填充的毛细管内的旋转椭圆体通过重力在毛细管的各直立位置的位置。
- 备选地，通过移液应用细胞球体到毛细管。小心塔吨移液器的尖端的开口，一方面，对于球体的尺寸足够大，并且在另一方面，小于或等于在尺寸上与毛细管的内径。
- 将毛细管与球体它在显微镜特殊的样品架。
- 附加的样本保持器与毛细管到显微镜的定位表和对齐细胞球状体，使得它的中心和聚焦的位置。
- 集光片和显微镜物镜，在检测路径中，通过调整反射镜的位置和柱面透镜的聚焦平面之间的匹配（参见图1B中的调整螺钉）。
- 调节测微螺钉（参见图1B）根据折射指数和物镜的数值孔径，以补偿鱼缸效果。
注：样品和周围吨媒体不同的折射指数他物镜引到物镜的移位和焦平面的移动之间的差异。由于光片被物镜转台移动时，光片（对应于所述物镜的位移）和焦平面的换档的换档之间的不匹配是通过一杆臂补偿（参见图1B）。测微螺钉用来调整上部和下部销之间的距离来调整光片的根据物镜的数值孔径和折射率的转变。
单平面照明的图1（A）的照片的单一平面照明模块安装于倒置显微镜的定位表的底板，（B）的设置模块和显微镜进料同步补偿焦平面和照明平面之间的升降失配（鱼缸效应）。 ΔZ○表示物镜和Δ狕的变速F表示焦平面的偏移和光片。嵌体显示毛细血管含有球状体的横截面。左：矩形毛细管600微米（墙120微米）的内径。右：用于旋转设置。的内圆毛细管（内径为400μm，外径为550微米）的外侧的矩形毛细管内转动。两个毛细管之间的空间填充有浸没流体。
4，测量的动态液体环境
注：先前的协议之前，测量其中的细胞球状体已预先温育，然后保持在适当位置中的毛细管通过简单的重力用于静态孵育。没有必要进行进一步fixati上。然而，对于在流动介质，其中的动态孵化，因此，在动态环境时，优选测量吸收动力学的测量，就可以做到这一点的子协议。步骤4.5-4.9是关键避免气泡到达样品。
- 填充FCS的毛细管30分钟，以支持细胞球状体的存货细胞粘附到内玻璃表面上。
- 让剩余的FCS涂层在贫毛细管干燥至少12小时。
- 按照步骤3.2中所述引入细胞球体的FCS涂层毛细管。
- 留在培养箱中的毛细管，在5％CO 2和37℃下进行另外的2-4小时，以使球体的细胞粘连。
- 设置了微流体系统的汇流部（参见图2）。使用蠕动泵以填充管的汇流（内径：0.89毫米），含有荧光染料，药物或试剂的培养基中。
- 连接到打印机克拉微流体系统来的气泡捕捉器的汇流部（参见图2）。
- 第一夹紧毛细管无气泡的汇流导管，然后将毛细管的另一端夹在排液管。
- 调的水浴中以所希望的值（ 例如，37℃）的液体的温度。
- 调节蠕动泵以期望的泵速度（ 例如，流速：9微升/分钟;泵速度在毛细管：25毫米/分钟）。
- 收集泵送液体无论是在收件人（开环设置），反馈给源（闭环设置），或者直接将其送到蠕动泵（紧闭环设置）的管道。
图2微流控设置（开环和紧闭环）;镶嵌：照明用的SPH使用连接到一个倒置显微镜光片以荧光显微镜微毛细管内eroid。
5，数据采集与分析
- 设置激光功率和积分时间的图像采集。
- 照顾，在步骤5.1中定义的参数不超过光的剂量值约为50-100焦耳/ cm 2的天然细胞或10-20焦耳/ cm 2的细胞培养用荧光染料或转染的荧光蛋白编码质粒来避免光毒性（详见参考文献12）。
- 设置增量为Z堆叠到Δ狕= 5-10微米是优选的3维数据分析作为光片厚度为约10微米。
- 由细胞球体内变化的焦平面的执行单个图像或Z-堆栈的测量。
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Representative Results
实验1：细胞球体培养与化疗药物
预先培养的MCF-7细胞球体（8μM多柔比星，6小时）的Z堆叠的扫描示于图3，它给出了关于细胞摄取和多柔比星17的分布和其降解产物18,19的详细信息。内的旋转椭圆体的红色荧光阿霉素的外细胞层主要定位于细胞核，而在内侧旋转椭球体的区域由降解产物发射绿色荧光变为主导的细胞膜19。
图3的荧光从MCF-7乳腺癌细胞SPH的不同层（Δ狕= 10微米）的图像eroid孵育与多柔比星（8微米，6小时）记录，可通过单一的平面照明显微镜;采用Z-投影三维重建（激发：λ= 470nm处;荧光检测：λ≥515 nm的;显微镜物镜：10X / 0.30计划Neofluar）。
在原生的MCF-7人乳腺癌细胞的球状体的化疗药物阿霉素的摄取是描绘在图4中由SPIM选择的单细胞层。时连续应用为2μm的培养基阿霉素的流动系统的红色和绿色荧光内和其降解产物的增加（图像和光谱描绘）。
图4时间蜂窝的2μM阿霉素摄取的过程在通过微流体系统的培养基中。在从与附加的荧光发射光谱（激发边缘的距离为80μm记录，由单一平面照明显微镜中的MCF-7乳腺癌细胞的球体构成的单层的荧光图像：λ= 470纳米;荧光检测：λ≥515nm的;显微镜物镜：10X / 0.3计划Neofluar）。
实验2：在球体表达氧化还原传感器的氧化过程
细胞内氧化还原状态的SPIM测量可以提供对活性氧类物质， 例如，在肿瘤中的一些信息。为此U251MG-L106成胶质细胞瘤细胞的球体永久转染敏感的绿色荧光的氧化还原传感器Grx1-roGFP2使用的谷胱甘肽。谷胱甘肽的氧化诱导暴露于50μM的过氧化氢 （H 2 O 2）以盐的SOLUT离子（EBSS），通过微流体系统和主要发生在该球体的外细胞层。
所报告的H 2 O 2的结果中的降低的荧光强度激发在470nm处的先前20的吸收量，对应于氧化还原传感器的还原形式。在孵化H的开头2 O 2强烈影响的外细胞层（厚度：50微米）的旋转椭圆体，然后更深地穿入内区域（直径：150微米）的旋转椭圆体以增加孵育时间导致较慢的降解的荧光强度。这种减少的时间过程被描述在图5中，显示了快速药物应用结合快速检测由SPIM系统20的可能性。
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荧光下降如图5时程为50微米H 2 O 2à培养U251MG-L106胶质母细胞瘤细 胞球体永久转用谷胱甘肽敏感的绿色荧光的氧化还原传感器Grx1-roGFP2。细胞内氧化还原状态的动力学为外层和细胞球状体的内部区域被记录，由单一平面照明显微镜（下流动的细胞球状体的单个层）的荧光图像的平均亮度值来获得。
实验3：启动和球体内部细胞坏死的标签
要启动细胞坏死U251-MG-L106-Grx1-roGFP2胶质母细胞瘤细胞的球状物与1微米鱼藤酮3小时。神经毒性剂鱼藤酮是线粒体电子传递链的抑制剂，并导致细胞膜完整性的丧失。要visua丽泽坏死的作用，该球体被共同培养与绿色荧光的细胞毒性标记染料（1微升的1ml培养基中，3小时），其渗透到受损细胞和结合于在细胞核中的DNA（ 见图6A，C）。作为参考，在整个球体的明视场照明图像示于图6B。
图6（A）的荧光从不同层（Δ狕= 5微米）图像的U251-MG-L106-Grx1-roGFP2成胶质细胞瘤细 胞球状体共同培养与鱼藤酮（1μM，3小时）和绿色染料的细胞毒性（1微升1毫升培养基中，3小时）记录，可通过单一的平面照明显微镜（比例尺为100μm），（B）明亮的音响整个球体，和（C）的视场照明重构3维荧光图像（激发：λ= 470纳米;荧光检测：λ≥515纳米;显微镜物镜：20X / 0.5计划Neofluar）。
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Discussion
本手稿描述光片或单一平面照明显微镜（SPIM）装置，其3维电池系统进行了优化， 例如，多细胞肿瘤球体（MCTS）。三个示例性的应用包括：（1）吸收细胞生长抑制药物和其部分转化为降解产物（其对化疗疗效贡献仍有待评估）中，氧化还原状态的（2）通过采用遗传编码谷胱甘肽传感器在测量另外一种氧化剂，和（3）启动和细胞坏死时抑制线粒体呼吸链的标记。
本SPIM模块中与现有系统（ 例如，所报告的参考文献7，8，9，14，15）的比较的主要优点是，它可以容易地适应于任何反向的宽视场显微镜，并且样品都位于小型测量室（微毛细管），其中只需要少量的Ôf荧光灯染料，药物制剂或药物，以应用于各种实验，因此最小化了成本， 例如，用于药物测试。这适用为好，如果一个微流体系统中，所报告的这篇稿子，被使用。然而，应当提到的是，尽管对于开环设置低流速是有利的成本效益的药物筛选，速率高达1440微升/分钟（相应于速度高达4000毫米/分钟）显示下是可能本实验条件下不从毛细管的球粒的剥离。对于紧张的闭环设置200-300微升的最小总液体量是必需的，独立于泵的速度。
它可以聚焦到衍射极限的光点，例如 ，一个激光器或激光二极管，任何光源可用于照明。各种光源的应用，但是，需要消色差校正，或者通过附加的望远镜应付放置在各个光源20前方或通过设计的消色差的照明系统的系统。再一个问题的结果，从显着的散射，这可能是不均匀的过采样，从而造成条纹状或阴影伪影。在摆动模式21或特定的软件算法22的照明角度的变化，但是，可以减少这些伪影。
本照明系统由远心扩束和聚焦了50毫米为n的柱面透镜的焦距和数值孔径A = 0.08。按照公式D =λ/ A N为夫琅和费衍射这导致厚度为约6微米的光片（取决于激发波长λ），其大致对应于一个电池层的厚度和的似乎是理想观察各个层。如果需要更高的轴向决议一的期望的，数值孔径可以增大通过插入中等或高数值孔径的额外的显微镜物镜的入照明光用的光片被聚焦到其开口面。这导致了另一个光片的试样，然而，被旋转90°（柱面透镜的旋转了90°可补偿该旋转）的平面。由于长距离显微镜透镜具有数值孔径高达约0.60，光片的厚度可以减小到1μm甚至更小，从而接近在共聚焦激光扫描显微镜获得的轴向分辨率。同时景深正比于A N -2，从约100μm减小到小于2μm。
甲焦点偏移的校正被用于补偿所谓鱼缸效果由于折射率不匹配。的显微镜物镜乐的转变沿着光轴纳秒不同于所述样品内的焦点移位。取决于空气和样品周围的物体的高度的介质之间的折射率之比似乎由大约1.35倍弯折，并导致升降失配的焦平面和所述照明平面之间的相同因子在SPIM用于记录Ž -stacks（仅供参考见图1B）。
多细胞肿瘤球体（MCTS）是相当对称的样品，其可以从任何方向照射。然而，对于更小的对称样品或小生物的各方面的照明可以是合乎需要的。因此，我们最近开发了一种设置23，其中所述样品存在于微毛细管圆筒形状的（内直径为400μm，外直径为550微米），可在矩形毛细管内旋转（内径600微米，壁厚为120微米），如在第描绘ê镶嵌图1B的。由于两个毛细管光片基于显微镜的几乎完美的光耦合可以与试样的无任何限制的旋转相结合。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这个项目是由土地巴登 - 符腾堡州，以及欧洲联盟，的Europäischer全宗资助献给死去大区ENTWICKLUNG。作者感谢赖维蒂希（ILM乌尔姆）提供的U251-MG-L106-Grx1-roGFP2细胞系和克劳迪娅·欣策的熟练的技术援助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microtiter plate | Orange Scientific | 4430100 | For cell spheroid growing |
| Agarose | Carl Roth GmbH | 3810.1 | For cell spheroid growing |
| MCF-7 cell line | CLS Cell Lines Service GmbH | 300273 | Cell line |
| U251-MG-L106 cell line | Cell line | ||
| DMEM | Biochrom AG (Merck Millipore) | FG0435 | Culture medium |
| DMEM/Ham's F-12 | Biochrom AG (Merck Millipore) | FG4815 | Culture medium |
| FCS | Biochrom AG (Merck Millipore) | S0615 | Cell culture supplement |
| Penicillin/streptomycin | Biochrom AG (Merck Millipore) | A 2213 | Antibiotics |
| Hygromycin B | PAA Laboratories | P02-015 | Antibiotic |
| EBSS | Sigma-Aldrich Inc. | E3024 | Cell culture supplement |
| Doxorubicin | Sigma-Aldrich Inc. | D1515 | Fluorescent dye (CAUTION: acute toxicity) |
| Green cytotoxicity dye | Promega GmbH | G8742 | CellTox - fluorescent cytotoxicity dye |
| Rotenone | Sigma-Aldrich Inc. | R8875 | Cellular inhibitor (CAUTION: acute toxicity) |
| Hydrogen peroxide (H2O2) | Sigma-Aldrich Inc. | 95302 | Reagent for oxidation (CAUTION: acute toxicity) |
| Capillary | VitroCom | 8260-050 | Sample preparation |
| Microscope | Carl Zeiss Jena | Axiovert 200M | |
| AxioCam MRc CCD-camera | Carl Zeiss MicroImaging GmbH | 426508-9901-000 | CCD-camera |
| AxioVision data aquisition software | Carl Zeiss MicroImaging GmbH | version 4.8.2. | |
| Laser diode | Pico Quant GmbH | LDH-P-C-470 | Used with driver PDL800-B |
| Peristaltic pump | Ismatec Labortechnik | MS-1 Reglo | Re-calibrated to reduce the minimum pump speed by 1/10 |
| Silicone tubes | IDEX Health & Science GmbH | TYGON R3607 |
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