Summary
En modul för enda plan belysning mikroskopi (SPIM) beskrivs som lätt anpassas till en inverterad brett fält mikroskop och optimerad för 3-dimensionella cellkulturer. Provet är beläget inom en rektangulär kapillär, och via ett mikrofluidsystem fluorescerande färgämnen kan farmaceutiska medel eller läkemedel tillämpas i små mängder.
Abstract
En modul för lättare plåt eller enda plan belysning mikroskopi (SPIM) beskrivs som lätt anpassas till en inverterad brett fält mikroskop och optimerad för 3-dimensionella cellkulturer, till exempel, flercelliga tumör sfäroider (MCTS). De SPIM excitation modul former och avlänkar ljuset så att provet belyses av en ljus ark vinkelrät mot detekteringsbana av mikroskopet. Systemet kännetecknas av användning av en rektangulär kapillär för att hålla (och i en avancerad version också genom en mikro-kapillär tillvägagångssätt för roterande) proven, genom synkron inställning av det belysande ljuset arket och objektivlinsen som används för fluorescensdetektering samt genom anpassning av ett mikrofluidsystem för applicering av fluorescerande färgämnen, farmaceutiska medel eller läkemedel i små kvantiteter. Ett protokoll för att arbeta med detta system ges, och en del tekniska detaljer redovisas. Representativa resultat inkluderar (1) mätningar av uppta ett cytostatikum (doxorubicin) och dess partiella omvandling till en nedbrytningsprodukt, (2) redox mätning med användning av en genetiskt kodad glutation sensor vid tillsats av ett oxidationsmedel, och (3) initiering och märkning av cellnekros vid hämning av den mitokondriella andningskedjan. Skillnader och fördelar med föreliggande SPIM modul i jämförelse med befintliga system diskuteras.
Introduction
Förutom väl etablerade metoder (konfokala eller flera foton laserskanning mikroskopi 1-4, strukturerad belysning mikroskopi 5,6) ljus ark eller enda plan belysning mikroskopi (SPIM) har visat sig vara en värdefull metod för 3D-avbildning 7,8, 9. Av särskilt intresse är dess tillämpning på 3-dimensionella cellkulturer, t.ex. flercelliga tumör sfäroider (MCTS), som används i allt större utsträckning för läkemedelsforskning 10,11. Dessutom är SPIM förmåns metod när även vid långvarig exponering eller upprepade mätningar svagt ljus doser krävs för att upprätthålla provets lönsamhet, eftersom för mätning av varje plan för provet bara detta plan utsätts för ljus. Detta står i motsats till andra mikroskopitekniker där för detektering av varje fokalplan hela provet upplyst, så att vid inspelning av ett flertal plan Ljusdos fattar och kan skada provet 12. Ljus ark mikroskopi eller SPIM baseras på belysning av provet i vinkelrät riktning till observationsbana antingen genom användning av en cylindrisk lins eller genom att skanna den spännande laserstrålen (för en översikt se ref. 8). Detta kräver ofta speciella provkammare 13,14 eller matriser, t ex agaros 7,15, genomförs i särskilda högkostnadsländer mikroskop. Som ett alternativ till dessa system en jämförelsevis enkel belysningsanordning för SPIM har utvecklats och anpassats till en konventionell inverterat mikroskop 16 (se figur 1). Den består av en laserstråle expanderas till en diameter på 8 mm och fokuseras av en cylindrisk lins (brännvidd: 50 mm, numerisk bländare: 0,08) till en ljus ark av 6-10 um tjocklek över ett skärpedjup på ca 100 nm . Prover är belägna i en rektangulär kapillär av 600-900 um innerdiameter placeras framför mikroskopobjektivet lens för fluorescensdetektering. Dessa huvuddrag för närvarande avslutad och optimeras genom användning av avancerade mikro-kapillära metoder för att hålla och för att rotera proven, den synkrona justeringen på den lysande ljusbladet (i axiell riktning) och objektiv som används för fluorescensdetektion (identisk optisk väg längder av förskjutning kräver en korrigering av den mekaniska foder), och anpassningen av ett mikroflödessystem för tillämpning av fluorescerande färgämnen, farmaceutiska medel eller läkemedel, vilket minimerar de nödvändiga kvantiteter och kostnader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cell Sfäroid växer och Inkubation
- Experiment 1: Cell sfäroider inkuberas med ett kemoterapeutiskt läkemedel
- Förbered agaros 1,5% i odlingsmedium genom att tillsätta 0,45 g agaros till 30 ml odlingsmedium (tillräckligt för 6 plattor).
- Värm blandningen från steg 1.1.1 till minst 80 ° C under omrörning det från tid till annan.
- Fyll 50 ul av den uppvärmda blandningen från steg 1.1.2 i varje brunn i en 96-brunnars platta och låta det stelna inom 1-2 timmar. Förvara plattorna stängda och täckta i kylskåp vid 5 ° C fram till användning.
- Seed omkring 150 MCF-7-bröstcancerceller i varje brunn av den beredda 96-brunnar i Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) med Hams F-12 odlingsmedium kompletterat med 10% fetalt kalvserum (FCS) och 1% penicillin / streptomycin .
- Väx sfäroider för 5-7 dagar upp till en diameter av ca 200 till 300 ^ m i en inkubator vid 5% CO2 och 3776; C.
- Inkubera cell sfäroiderna med antracyklinantibiotikum doxorubicinhydroklorid för 6 timmar vid en koncentration som sträcker sig mellan 2 | iM och 8 ^ M (i odlingsmedium) i en inkubator vid 5% CO2 och 37 ° C.
- Tvätta cell sfäroiderna med odlingsmedium eller Earles Balanced Salt Solution (EBSS) före mikroskopi.
- Experiment 2: Oxidation processen i sfäroider som uttrycker ett redox-sensor
- Seed omkring 400 U251-MG-L106 glioblastomceller permanent transfekterade med glutation känslig grönfluorescerande redox sensor Grx1-roGFP2 i agarosgel belagda brunnarna (förfarandet beskrivet i steg 1.1.1-1.1.3) av en 96-brunnsplatta i DMEM odlingsmedium kompletterat med 10% FCS, 1% penicillin / streptomycin och hygromycin B (150 | ig / ml).
- Väx sfäroider för 5-7 dagar upp till en diameter av ca 200 till 300 ^ m i en inkubator vid 5% CO2 och 37 ° C.
- Lägg 10 & #181; l väteperoxidlösning (purum pa, ≥ 30%) till 990 l bi-destillerat vatten för att skapa en 100 mM stamlösning ska användas inom 12 timmar.
- Späd stamlösningen från steg 1.2.3 till 50 | iM i EBSS just före experimentet.
- Inkubera cell spheroids via mikroflödessystem under mätning med väteperoxid 50 iM i EBSS för oxidation av redox-sensorn.
- Experiment 3: Inledande och märkning av cellnekros inom spheroids
- Seed ca 400 celler (t.ex. U251-MG-L106-Grx1-roGFP2 glioblastomceller) i agarosgel-belagda brunnar (förfarandet beskrivet i steg 1.1.1-1.1.3) av en 96-brunnars platta i DMEM odlingsmedium kompletterat med 10% FCS, 1% penicillin / streptomycin och hygromycin B (150 mg / ml).
- Väx sfäroider för 5-7 dagar upp till en diameter av ca 200 till 300 ^ m i en inkubator vid 5% CO2 och 37 ° C.
- Inkubera cellensfäroider med den mitokondriella elektrontransporthämmare rotenon för 3 h vid en koncentration av 1 uM i odlingsmedium för att inducera cellulär nekros. Dessutom sam-inkuberas med en grön cytotoxicitet färgämne för 3 h vid en koncentration av 1 | il i ett ml odlingsmedium för att märka nekrotiska celler.
- Tvätta cell sfäroiderna med odlingsmedium eller EBSS före mikroskopi.
2. Ljus Sheet Justering
OBS: För att uppnå bästa resultat bör det säkerställas att strålmidjan hos ljus arket är i fokusplanet för objektivlinsen. Positionen för strålmidjan endast kan anpassas genom att observera ljus arket i vertikal position med avseende på kapillären (se steg 2,5-2,8).
- Använd ett inverterat mikroskop och montera SPIM exciteringsmodulen, såsom beskrivits i Ref. 16, till bottenplattan av positioneringsbordet (se figur 1A).
- Utrusta mikroskop med en 10X / 0,3 eller 20X / 0,5 mikroskopobjektivlins och en lämplig långpassfilter (t.ex. λ ≥ 515 nm) i detekteringsbana mikroskopet.
- Montera en integrerande kameran till indikering av mikroskopet.
- Använd en parallell kollimerad stråle av en laser eller en laserdiod med en excitationsvåglängd av företrädesvis 470 nm och tillämpa den på SPIM modulen.
- Vrid cylindrisk lins genom 90 grader, som överför ljuset arket till ett vertikalt läge för en axiell justering av strålmidjan av ljuset arket.
- Placera en kapillär som innehåller en vätska med ett fluorescerande färgämne i provhållaren.
- Fäst provhållaren med kapillären till positioneringsbordet av mikroskopet och rikta den position av kapillären så att den är centrerad och balken midjan av ljuset arket är i fokus.
- Justera strålmidjan genom variation av det axiella läget hos den cylindriska linsen själv. Vrid tillbaka linsen efter annonsenjusteringen vara.
3 Cell Sfär Ansökan och Mikroskop Feed Synkronisering
- Placera cell sfäroiderna separat eller i grupper inom rektangulär borosilikatglas kapillärer 16 med ett inre tvärsnitt av 600 ^ m x 600 ^ m och en väggtjocklek av 120 um. Två tekniker för att tillämpa en cell sfäroid har visat sig vara framgångsrik.
- Ta den tomma kapillär upprätt med tummen och långfingret och försegla den övre öppningen med pekfingret. Ta den nedre öppningen nära cell sfäroid i dess omgivande vätska (EBSS eller odlingsmedium). Släpp pekfinger från den övre öppningen. Vätska med cell sfäroid i den kommer läggas i blöt i omedelbart av kapillärkrafter. Justera positionen för sfäroiden inom den fyllda kapillär genom gravitation i respektive upprätt position kapillär.
- Alternativt, applicera cell sfäroiden till kapillär via pipettering. Ta hand that öppnandet av pipettspetsen är, å ena sidan, tillräckligt stor för sfäroid storlek och, å andra sidan, är mindre eller lika stor som den inre diametern hos kapillären.
- Placera kapillär med sfäroid i den i en speciell provhållare för mikroskopi.
- Fäst provhållaren med kapillären till positioneringsbordet av mikroskopet och rikta positionen av cellen sfäroid sådan att den är centrerad och fokuserad.
- Ställ matchningen mellan ljus arket och fokalplanet hos mikroskopobjektivlins i detekteringsbana genom att justera positionen för reflektionsspegel och den cylindriska linsen (se justeringsskruven i Figur 1B).
- Justera mikrometerskruven (se figur 1B) enligt de brytningsindex och den numeriska aperturen hos objektivlinsen för att kompensera den fish effekt.
OBS: Olika brytningsindexen för provet och media kring tHan objektiv leder till en skillnad mellan den förskjutning av objektivlinsen och förskjutningen av fokalplanet. Eftersom ljus arket förflyttas av målet turret, är obalansen mellan förskjutningen av ljus arket (motsvarande förskjutning av objektivlinsen) och förskjutningen av fokalplanet kompenseras av en hävarm (se figur 1B). Den mikrometerskruv används för att anpassa avståndet mellan den övre och den undre tappen för att justera förskjutningen av ljus arket enligt den numeriska aperturen för objektivlinsen och de brytningsindex.
Figur 1 (A) Bild på ett plan belysningsmodul monterad på bottenplatta av positioneringsbordet av ett inverterat mikroskop, (B) installationen av enda plan belysningmodul och mikroskopet matnings synkroniseringen att kompensera lyft-mismatch (fishtank effekt) mellan fokalplanet och belysningsplan. Az o indikerar förskjutningen av objektiv och Az f förskjutningen av fokalplanet och ljuset arket. Inlägget visar tvärsnitt av sfäroida innehåller kapillärer. Vänster: rektangulär kapillär med innerdiameter på 600 nm (väggen 120 nm). Höger: Inställning används för rotation. En inre runda kapillär (innerdiameter 400 pm, ytterdiameter 550 nm) roteras i den yttre rektangulära kapillär. Utrymmet mellan de två kapillärerna är fylld med en nedsänkning vätska.
4 Mätning i Dynamic Liquid Miljö
OBS: Det tidigare protokollet används för statisk inkubering före en mätning där cell sfäroid tidigare har inkuberas och sedan hållas på plats i kapillären genom enkel gravitation. Det finns inget behov av ytterligare fixatipå. Men för mätningar i strömmande media där en dynamisk inkubation och därför är önskvärt att mäta upptag kinetik en dynamisk miljö, kan man åstadkomma detta underprotokoll. Steg 4,5-4,9 är avgörande för att undvika luftbubblor når provet.
- Fyll kapillären med FCS under 30 min för att stödja senare cellulär adhesion av en cell sfäroid till den inre glasytan.
- Låt resterande FCS beläggningen i utarmade kapillär torka i minst 12 timmar.
- Presentera cell sfäroiden till FCS belagd kapillär som beskrivs i steg 3.2.
- Lämna kapillären i inkubator vid 5% CO2 och 37 ° C under ytterligare 2-4 h för att orsaka cellulär adhesion av sfäroid.
- Ställ in afflux del av mikroflödessystem (se figur 2). Använd en peristaltisk pump för att fylla afflux av slangen (innerdiameter: 0,89 mm) med odlingsmedium innehållande det fluorescerande färgämnet, läkemedel eller medel.
- Connect den afflux del av mikrofluidsystem till en bubbelfälla (se figur 2).
- Först clamp kapillären bubbelfritt till afflux slangen och därefter spänna fast den andra sidan av kapillären till dräneringsslangen.
- Tune vätskans temperatur på vattenbadet på önskat värde (t.ex. 37 ° C).
- Justera den peristaltiska pumpen till den önskade pumphastigheten (t.ex., flödeshastighet: 9 | il / min; pumphastigheten i kapillären: 25 mm / min).
- Samla den pumpade vätskan antingen i en mottagare (open-loop setup), mata den tillbaka till sin källa (slutna setup) eller mata in det direkt i slangen av den peristaltiska pumpen (tight slutna setup).
Figur 2 Microfluidic setup (open-loop och tät slutna); inlaga: Belysning av en spheroid inom en mikro kapillär med hjälp av ljus plåt baserad fluorescensmikroskopi kopplad till ett inverterat mikroskop.
5. Datainsamling och analys
- Ställ in lasereffekten och integrationstiden för bildtagning.
- Se till att de parametrar som definieras i steg 5.1 inte överskrider ljus dosvärden ca 50-100 J / cm 2 för infödda celler eller 10-20 J / cm 2 för celler inkuberade med en fluorescerande färg eller transfekterade med ett fluorescerande protein kodande plasmid till undvika fototoxicitet (för detaljer se Ref. 12).
- Ange påslag för z-stack till Az = 5-10 um som är att föredra för 3-dimensionella dataanalys som ljusplåttjockleken är ca 10 nm.
- Utför mätningar av enstaka bilder eller z-stackar genom variation av fokalplanet i cellen sfäroid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Experiment 1: Cell sfäroider inkuberas med ett kemoterapeutiskt läkemedel
En z-stack genomsökning av ett tidigare odlades MCF-7 cell sfäroid (8 iM doxorubicin, 6 timmar) visas i Figur 3. Den ger detaljerad information om det cellulära upptaget och distribution av doxorubicin 17 och dess nedbrytningsprodukt 18,19. Inom det yttre cellskiktet i sfäroid röd fluorescerande doxorubicin är huvudsakligen lokaliserad i kärnan, medan det i inner sfäroida områden grön fluorescens som emitteras av en nedbrytningsprodukt blir dominerande i det cellulära membranet 19.
Figur 3. Fluorescens bilder från olika lager (Az = 10 nm) av en MCF-7 bröstcancer cell spheroid inkuberades med doxorubicin (8 ^ M, 6 tim) registreras av ett plan belysning mikroskopi; 3-dimensionell rekonstruktion med hjälp av z-projektion (excitation: λ = 470 nm, fluorescensdetektering: λ ≥ 515 nm, mikroskop objektiv: 10X / 0.30 Plan Neofluar).
Upptaget av det kemoterapeutiska läkemedlet doxorubicin i nativa MCF-7 humana bröstcancercell sfäroider är avbildad i figur 4 för en enda cellskikt väljs genom SPIM. Vid tillämpning av 2 ^ M i odlingsmedium inom flödessystem röd och grön fluorescens av doxorubicin och dess nedbrytningsprodukt ökade kontinuerligt (bilder och spektrum avbildas).
Figur 4 Tidsförlopp för cellulärt upptag av 2 ^ M doxorubicini odlingsmediet via mikroflödessystemet. Fluorescensbilder av ett enda skikt av en MCF-7 bröstkarcinom cell sfäroid registreras genom en enda plan belysning mikroskopi på ett avstånd av 80 ^ m från sin kant med ytterligare fluorescensemissionsspektrum (excitation: λ = 470 nm, fluorescensdetektering: λ ≥ 515 nm , mikroskop objektiv: 10X / 0.3 Plan Neofluar).
Experiment 2: Oxidation processen i sfäroider som uttrycker ett redox-sensor
SPIM mätningar av intracellulära redox stater kan ge viss information om reaktiva syreföreningar, t ex i tumörer. För detta ändamål en sfäroid med U251MG-L106 glioblastomceller permanent transfekterade med glutation känsliga grönt fluorescerande redox sensor Grx1-roGFP2 användes. Oxidation av glutation inducerades genom exponering för 50 pM väteperoxid (H 2 O 2) i salt solut jon (EBSS) via mikroflödessystem och främst skett i de yttre cellskikt sfäroiddiametern.
Som rapporterats tidigare 20 upptaget av H 2 O 2 resulterar i en minskning av fluorescensintensitet exciteras vid 470 nm, motsvarande den reducerade formen av redox-sensorn. Vid början av inkubationen H 2 O 2 påverkar starkt de yttre cellskikten (tjocklek: 50 ^ m) av den sfäroid och sedan tränger djupare in i det inre området (diameter: 150 ^ m) av den sfäroid med ökande inkubationstid resulterar i en långsammare nedbrytning av fluorescensintensitet. Tidsförloppet för denna minskning är avbildad i figur 5, som visar möjligheten att snabba drogansökan i kombination med snabb detektion av SPIM systemet 20.
993fig5highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 5 Tidsförloppet av fluorescens minskning vid 50 ^ M H 2 O 2 inkubation av en U251MG-L106 glioblastom cell sfäroid permanent transfekterad med glutation känsliga grönt fluorescerande redox sensor Grx1-roGFP2. De intracellulära redox state kinetiken för de yttre skikten och det inre området av en cell sfäroid erhölls genom medelintensitetsvärden för fluorescensbilder som registrerats av enda plan belysning mikroskopi (enkelt skikt av cell sfäroid enligt flöde).
Experiment 3: Inledande och märkning av cellnekros inom spheroids
För att initiera cellulär nekros en U251-MG-L106-Grx1-roGFP2 glioblastom cell sfäroid inkuberades med 1 pM rotenon för 3 tim. Den neurotoxiska medlet rotenon är en hämmare av den mitokondriella elektrontransportkedjan och leder till en förlust av cellmembranintegritet. Till videoanläggninglize den nekrotiska effekten, sfäroid var sam-inkuberas med grönfluorescerande cytotoxicitet-märkning färgämne (1 | al i 1 ml odlingsmedium, 3 tim), som tränger in i det skadade cellen och binder till DNA i cellkärnan (se figur 6A, C). För referens, är ett ljust fält belysnings bilden av hela sfäroid visas i figur 6B.
Figur 6. (A) fluorescens bilder från olika lager (Az = 5 nm) av en U251-MG-L106-Grx1-roGFP2 glioblastom cell sfäroid saminkuberas med rotenon (1 ^ M, 3 h) och grön cytotoxicitet färgämne (1 il i 1 ml odlingsmedium, 3 h) registreras av ett plan belysning mikroskopi (skal 100 pm), (B) ljus fiELD belysning av hela sfäroid, och (C) rekonstruerade 3-dimensionell fluorescensbild (excitation: λ = 470 nm, fluorescensdetektering: λ ≥ 515 nm; mikroskopobjektivlins: 20X / 0,5 Plan Neofluar).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den nuvarande manuskriptet beskriver en lätt ark eller enda plan belysning mikroskopi (SPIM) enhet som är optimerad för 3-dimensionella cellsystem, t.ex. flercelliga tumör sfäroider (MCTS). Tre exempel på användningsområden är (1) upptagning av ett cytostatikum och dess partiella omvandling till en nedbrytningsprodukt (vars bidrag till kemoterapeutisk effekt återstår att utvärderas), (2) mätningar av redoxtillståndet genom användning av en genetiskt kodad glutation sensor på tillägg av ett oxidationsmedel, och (3) initiering och märkning av cellnekros vid hämning av den mitokondriella andningskedjan.
Främsta fördelarna med denna SPIM modul jämfört med befintliga system (t.ex. de som rapporterats i ref. 7, 8, 9, 14, 15) är att den lätt kan anpassas till varje inverterad brett fält mikroskop, och att proven är belägna i små mätningskammare (mikro kapillärerna), som behöver endast små mängder of fluorescerande färgämnen, farmaceutiska medel eller läkemedel som skall tillämpas för olika typer av experiment, vilket minimerar kostnaderna, t.ex. för läkemedelstester. Detta gäller också, om en mikrofluidsystemet, såsom rapporteras i detta manuskript, används. Det bör dock nämnas, att även om en öppen slinga inställning låga flöden är fördelaktiga för kostnadseffektiv läkemedelsscreening, hastigheter på upp till 1440 l / min (motsvarande hastigheter upp till 4000 mm / min) visade sig vara möjligt enligt de föreliggande experimentella betingelser utan lösgörande av sfäroiderna från kapillären. För en tät sluten slinga installation krävs minst total vätskevolym på 200-300 l, oberoende av pumphastighet.
Varje ljuskälla som kan fokuseras till en diffraktionsbegränsad fläck, t.ex. en laser eller laserdiod, kan användas för belysning. Tillämpning av olika ljuskällor kräver emellertid kromatisk korrigering, antingen genom extra telesklara system placerade framför enskilda ljuskällorna 20 eller genom att utforma en akromatisk belysningssystem. Ytterligare problemet beror på uttalad framåtspridning, som kan vara inhomogen över provet, vilket orsakar artefakter som ränder eller skuggor. Variation av infallsvinkel i ett vacklande läge 21 eller särskilda mjukvarualgoritmer 22 kan emellertid minska dessa artefakter.
Föreliggande belysningssystem består av en telecentrisk stråle expansion och fokusering av en cylindrisk lins med 50 mm brännvidd och en numerisk apertur A N = 0,08. Enligt formeln d = λ / A N för Fraunhofer diffraktion detta resulterar i en tjocklek av ca 6 | im av ljuset ark (beroende på excitationsvåglängden λ), vilket ungefär motsvarar tjockleken av ett cellskikt och verkar vara idealisk för observation av enskilda skikt. Om en högre axiell upplösning is önskas kan den numeriska aperturen ökas genom insättning av en ytterligare mikroskopobjektivlins av måttlig eller hög numerisk apertur i belysningsstråle med ljuset arket som fokuseras i dess öppningsplanet. Detta resulterar i en annan ljus ark i planet för provet, som emellertid roteras av 90 ° (en rotation av den cylindriska linsen med 90 ° kan kompensera för denna rotation). Sedan långdistansmikroskoplinser har numeriska öppningar av upp till ca 0,60, kan tjockleken hos ljus arket minskas till 1 pm eller ännu mindre, vilket närmar sig den axiella upplösningen erhållen i konfokala lasersvepmikroskop. Samtidigt det skärpedjup som är proportionell mot A N -2 reduceras från ca 100 | im till mindre än 2 | im.
En fokal skift korrigering används för att kompensera den så kallade fish effekt på grund av ett brytnings mismatch index. Förskjutningen av mikroskopobjektivet lens längs den optiska axeln skiljer sig från den fokusförskjutning inuti provet. Beroende på förhållandet mellan brytningsindexen mellan luften och mediet som omger provet höjden objektet visas fäste med en faktor av ungefär 1,35 och leder till en lyft felpaming med samma faktor mellan fokalplanet och den belysningsplanet i SPIM för inspelning z -stacks (för referens se figur 1B).
Fler cellulära tumör sfäroider (MCT) är ganska symmetriska prover, vilka kan belysas från någon riktning. Men för mindre symmetriska prover eller små organismer belysning från olika håll kan vara önskvärt. Därför nyligen utvecklade vi en setup 23, där proven är belägna i en mikro kapillär av cylindrisk form (innerdiameter 400 pm, ytterdiameter 550 nm) som kan roteras i den rektangulära kapillären (innerdiameter 600 pm, väggtjocklek 120 im), såsom avbildas i the inlägg i figur 1B. På grund av att nästan perfekt optisk koppling av två kapillärer ljus ark baserad mikroskopi kan kombineras med rotation av provet utan någon begränsning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Projektet finansierades av delstaten Baden-Württemberg och av EU, Europäischer Fonds für die Regionale Entwicklung. Författarna tackar Rainer Wittig (ILM Ulm) för att tillhandahålla U251-MG-L106-Grx1-roGFP2 cellinje och Claudia Hintze för skickliga tekniskt stöd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microtiter plate | Orange Scientific | 4430100 | For cell spheroid growing |
| Agarose | Carl Roth GmbH | 3810.1 | For cell spheroid growing |
| MCF-7 cell line | CLS Cell Lines Service GmbH | 300273 | Cell line |
| U251-MG-L106 cell line | Cell line | ||
| DMEM | Biochrom AG (Merck Millipore) | FG0435 | Culture medium |
| DMEM/Ham's F-12 | Biochrom AG (Merck Millipore) | FG4815 | Culture medium |
| FCS | Biochrom AG (Merck Millipore) | S0615 | Cell culture supplement |
| Penicillin/streptomycin | Biochrom AG (Merck Millipore) | A 2213 | Antibiotics |
| Hygromycin B | PAA Laboratories | P02-015 | Antibiotic |
| EBSS | Sigma-Aldrich Inc. | E3024 | Cell culture supplement |
| Doxorubicin | Sigma-Aldrich Inc. | D1515 | Fluorescent dye (CAUTION: acute toxicity) |
| Green cytotoxicity dye | Promega GmbH | G8742 | CellTox - fluorescent cytotoxicity dye |
| Rotenone | Sigma-Aldrich Inc. | R8875 | Cellular inhibitor (CAUTION: acute toxicity) |
| Hydrogen peroxide (H2O2) | Sigma-Aldrich Inc. | 95302 | Reagent for oxidation (CAUTION: acute toxicity) |
| Capillary | VitroCom | 8260-050 | Sample preparation |
| Microscope | Carl Zeiss Jena | Axiovert 200M | |
| AxioCam MRc CCD-camera | Carl Zeiss MicroImaging GmbH | 426508-9901-000 | CCD-camera |
| AxioVision data aquisition software | Carl Zeiss MicroImaging GmbH | version 4.8.2. | |
| Laser diode | Pico Quant GmbH | LDH-P-C-470 | Used with driver PDL800-B |
| Peristaltic pump | Ismatec Labortechnik | MS-1 Reglo | Re-calibrated to reduce the minimum pump speed by 1/10 |
| Silicone tubes | IDEX Health & Science GmbH | TYGON R3607 |
References
- Pawley, J. Handbook of biological confocal microscopy. , Plenum Press. New York. (1990).
- Webb, R. H.
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- König, K.
- Neil, M. A., Juskaitis, R., Wilson, T. Method of obtaining optical sectioning by using structured light in a conventional microscope. Opt. Lett. 22 (24), 1905-1907 (1997).
- Gustafsson, M. G. L., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophys. J. 94 (12), 4957-4970 (2008).
- Huisken, J., Swoger, J., del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical sectioning deep inside live embryos by SPIM. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Huisken, J., Stainier, D. Y. R. Selective plane illumination microscopy techniques in development biology. Development. 136 (12), 1963-1975 (2009).
- Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. J. Histochem. Cytochem. 59 (2), 129-138 (2011).
- Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. The use of 3-D cultures for high throughput screening: the multi-cellular spheroid model. J. Biomol. Screen. 9 (4), 273-285 (2004).
- Schneckenburger, H., et al. Multi-dimensional fluorescence microscopy of living cells. J. Biophotonics. 4 (3), 143-149 (2011).
- Schneckenburger, H., et al. Light exposure and cell viability in fluorescence microscopy. J. Microsc. 245 (3), 311-318 (2012).
- Ritter, J. G., Veith, R., Veenendaal, A., Siebrasse, J. P., Kubitschek, U. Light sheet microscopy for single molecule tracking in living tissue. PLoS One. 5 (7), e11639:1-e11639:7 (2010).
- Mertz, J., Kim, J. Scanning light-sheet microscopy in the whole mouse brain with HiLo background rejection. J. Biomed. Opt. 15 (1), 016027 (2010).
- Fahrbach, F. O., Rohrbach, A. A line-scanned light-sheet microscope with phase shaped self-reconstructing beams. Opt. Express. 18 (23), 24229-24244 (2010).
- Bruns, T., Schickinger, S., Wittig, R., Schneckenburger, H. Preparation strategy and illumination of 3D cell cultures in light-sheet based fluorescence microscopy. J. Biomed. Opt. 17 (10), 101518 (2012).
- Ma, H. L., et al. Multicellular tumor spheroids as an in vivo-like tumor model for three-dimensional imaging of chemotherapeutic and nano material cellular penetration. Mol. Imaging. 11 (6), 487-498 (2012).
- Weber, P., Wagner, M., Schneckenburger, H. Cholesterol dependent uptake and interaction of doxorubicin in MCF-7 breast cancer cells. Int. J. Mol. Sci. 14 (4), 8358-8366 (2013).
- Hovorka, O., et al. Spectral analysis of doxorubicin accumulation and the indirect quantification of its DNA intercalation. Eur. J. Pharm. Biopharm. 76 (3), 514-524 (2010).
- Schickinger, S., Bruns, T., Wittig, R., Weber, P., Wagner, M., Schneckenburger, H. Nanosecond ratio imaging of redox states in tumor cell spheroids using light sheet-based fluorescence microscopy. J. Biomed. Opt. 18 (12), 126007 (2013).
- Optical arrangement for the production of a light sheet. U.S. Patent. Lippert, H., Wald, M., Radt, B. , 7,787,179 B2 (2010).
- Lorenzo, C., et al. Live cell division dynamics monitoring in 3D large spheroid tumor models using light sheet microscopy. Cell Division. 6 (22), 1-8 (2011).
- Sample holder for rotation of three-dimensional specimens in microscopy. European Patent Application. Bruns, T., Schneckenburger, H., Schickinger, S. , EP 13 184 931.7 (2013).
