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Engineering

एकल विमान रोशनी मॉड्यूल और एक व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोप के लिए माइक्रो केशिका दृष्टिकोण

Published: August 15, 2014 doi: 10.3791/51993
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institute of Applied Research, Aalen University

Summary

एक विमान रोशनी माइक्रोस्कोपी के लिए एक मॉड्यूल (SPIM) आसानी से एक औंधा व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोप के लिए अनुकूलित और 3 आयामी सेल संस्कृतियों के लिए अनुकूलित है जो वर्णन किया गया है. नमूना एक आयताकार केशिका के भीतर स्थित है, और एक microfluidic प्रणाली फ्लोरोसेंट रंगों के माध्यम से, दवा एजेंटों या दवाओं कम मात्रा में लागू किया जा सकता है.

Abstract

आसानी से, एक औंधा व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोप के लिए अनुकूलित और 3 आयामी सेल संस्कृतियों के लिए अनुकूलित है जो वर्णन किया गया है प्रकाश चादर या एक विमान रोशनी माइक्रोस्कोपी (SPIM) के लिए एक मॉड्यूल जैसे, बहु सेलुलर ट्यूमर spheroids (MCTS). SPIM उत्तेजना मॉड्यूल आकार और नमूना सीधा माइक्रोस्कोप का पता लगाने के पथ के लिए एक प्रकाश चादर द्वारा प्रबुद्ध है कि इस तरह के प्रकाश विक्षेपित. प्रणाली रोशन प्रकाश शीट की तुल्यकालिक समायोजन और साथ ही साथ प्रतिदीप्ति का पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता उद्देश्य लेंस से, नमूने (भी घूर्णन के लिए एक माइक्रो केशिका दृष्टिकोण से और एक उन्नत संस्करण में) आयोजित करने के लिए एक आयताकार केशिका के उपयोग के द्वारा होती है फ्लोरोसेंट रंगों, कम मात्रा में दवा एजेंटों या दवाओं के आवेदन के लिए एक microfluidic प्रणाली के अनुकूलन द्वारा. इस प्रणाली के साथ काम करने के लिए एक प्रोटोकॉल दिया जाता है, और कुछ तकनीकी विवरण रिपोर्ट कर रहे हैं. प्रतिनिधि परिणाम (1) के माप शामिलएक ऑक्सीकरण एजेंट के अलावा पर एक cytostatic दवा (डॉक्सोरूबिसिन) और एक गिरावट उत्पाद को अपनी आंशिक रूपांतरण के एक आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग glutathione सेंसर का उपयोग करके, (2) redox माप लेते हैं, और (3) दीक्षा और के निषेध पर सेल परिगलन की लेबलिंग mitochondrial सांस की श्रृंखला. मौजूदा सिस्टम के साथ तुलना में वर्तमान SPIM मॉड्यूल के मतभेद और लाभ पर चर्चा कर रहे हैं.

Introduction

अच्छी तरह से स्थापित तरीकों (confocal या बहु फोटॉन लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी 1-4, संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी 5,6) प्रकाश चादर या एक विमान रोशनी माइक्रोस्कोपी (SPIM) के अलावा 3 डी इमेजिंग 7,8 के एक मूल्यवान विधि साबित हो गया है, 9. खास रुचि दवाओं की खोज अनुसंधान 10,11 के लिए तेजी से उपयोग किया जाता है जो 3 आयामी सेल संस्कृतियों, जैसे, बहु सेलुलर ट्यूमर spheroids (MCTS), के लिए अपने आवेदन पत्र है. इसके अलावा, SPIM भी लंबी अवधि के जोखिम या दोहराव माप पर कम प्रकाश खुराक ही इस विमान प्रकाश के संपर्क में है नमूना के प्रत्येक विमान की माप के लिए के बाद से, नमूना के व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए आवश्यक हैं जब एक तरजीही तरीका है. यह प्रत्येक फोकल हवाई जहाज़ का पता लगाने के लिए पूरे नमूना प्रबुद्ध है जहां अन्य माइक्रोस्कोपी तकनीक, के विपरीत है, प्रकाश खुराक रकम कई विमानों की रिकॉर्डिंग पर इतना है कि और नमूना 12 नुकसान हो सकता है. हल्की चादर माइक्रोस्कोपी या SPIM एक बेलनाकार लेंस का उपयोग करके या (एक समीक्षा संदर्भ में देखते हैं. 8 के लिए) रोमांचक लेजर बीम को स्कैन करके या तो अवलोकन पथ को सीधा दिशा में नमूना की रोशनी पर आधारित है. इस बार विशेष नमूना कक्षों 13,14 या matrices, आवश्यकता है जैसे, agarose 7,15, विशेष उच्च लागत सूक्ष्मदर्शी में लागू किया है. उन सिस्टम के लिए एक विकल्प के रूप में SPIM के लिए एक तुलनात्मक सरल रोशनी डिवाइस विकसित किया गया है और एक पारंपरिक उलटा माइक्रोस्कोप 16 (1 चित्र देखें) को रूपांतरित किया. लगभग 100 मीटर के क्षेत्र की गहराई से अधिक 6-10 माइक्रोन मोटाई की एक प्रकाश शीट के लिए यह एक बेलनाकार लेंस (0.08: 50 मिमी, संख्यात्मक एपर्चर फोकल लंबाई) द्वारा 8 मिमी की एक व्यास के लिए विस्तार और केंद्रित एक लेजर बीम के होते हैं . नमूने खुर्दबीन उद्देश्य लेन के सामने रखा 600-900 माइक्रोन भीतरी व्यास का एक आयताकार केशिका में स्थित हैंप्रतिदीप्ति का पता लगाने के लिए है. ये मुख्य विशेषताएं इस समय पूरी की और आयोजित करने के लिए और प्रतिदीप्ति का पता लगाने (समान ऑप्टिकल पथ के लिए इस्तेमाल किया (अक्षीय दिशा में) नमूने, रोशन प्रकाश शीट की तुल्यकालिक समायोजन और उद्देश्य लेंस घूर्णन के लिए उन्नत माइक्रो केशिका दृष्टिकोण के उपयोग से अनुकूलित कर रहे हैं विस्थापन की लंबाई इस प्रकार आवश्यक मात्रा और खर्च को कम करने, यांत्रिक फ़ीड के सुधार), और फ्लोरोसेंट रंजक, दवा एजेंटों या दवाओं के आवेदन के लिए एक microfluidic प्रणाली के अनुकूलन की आवश्यकता होती है.

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Protocol

1 सेल उपगोल बढ़ रही है और ऊष्मायन

  1. प्रयोग 1: सेल spheroids एक chemotherapeutic दवा के साथ incubated
    1. (6 प्लेटों के लिए पर्याप्त) 30 मिलीलीटर संस्कृति के माध्यम से agarose की 0.45 ग्राम जोड़कर संस्कृति के माध्यम में agarose 1.5% की तैयारी.
    2. समय समय पर यह क्रियाशीलता जबकि कदम 1.1.1 से कम से कम 80 डिग्री सेल्सियस तक मिश्रण गर्मी.
    3. एक 96 अच्छी तरह से थाली में से प्रत्येक कुएं में कदम 1.1.2 से गर्म मिश्रण के 50 μl भरें और इसे 1-2 घंटे के भीतर जमना. उपयोग करें जब तक 5 डिग्री सेल्सियस पर फ्रिज में बंद कर दिया और कवर प्लेटें स्टोर.
    4. तैयार 96 अच्छी तरह से 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस) के साथ पूरक हाम एफ -12 संस्कृति के माध्यम से Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) में थाली और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के प्रत्येक कुएं में 150 MCF 7 स्तन कैंसर की कोशिकाओं के बारे में बीज .
    5. 5% सीओ 2 और 37 में एक मशीन में लगभग 200-300 मीटर की एक व्यास अप करने के लिए 5-7 दिनों के लिए spheroids बढ़ो76, सी.
    6. 5% सीओ 2 और 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में 2 माइक्रोन और (संस्कृति माध्यम में) 8 माइक्रोन के बीच लेकर एक एकाग्रता में 6 घंटे के लिए anthracycline एंटीबायोटिक डॉक्सोरूबिसिन हाइड्रोक्लोराइड के साथ सेल spheroids सेते हैं.
    7. संस्कृति मध्यम या अर्ल बैलेंस्ड नमक समाधान (EBSS) माइक्रोस्कोपी से पहले साथ सेल spheroids धो लें.
  2. प्रयोग 2: एक redox सेंसर व्यक्त spheroids में ऑक्सीकरण प्रक्रिया
    1. DMEM में एक 96 अच्छी तरह से थाली के स्थायी रूप से agarose जेल में लिपटे कुओं में glutathione संवेदनशील हरी फ्लोरोसेंट redox सेंसर Grx1-roGFP2 (प्रक्रिया चरणों में वर्णित 1.1.1-1.1.3) के साथ ट्रांसफ़ेक्ट 400 U251 एमजी-L106 glioblastoma कोशिकाओं के बारे में बीज संस्कृति के माध्यम से 10% एफसीएस, 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन और hygromycin बी (/ एमएल 150 माइक्रोग्राम) के साथ पूरक.
    2. 5% सीओ 2 और 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में लगभग 200-300 मीटर की एक व्यास अप करने के लिए 5-7 दिनों के लिए spheroids आगे बढ़ें.
    3. 10 & # जोड़ें181, एक 100 मिमी शेयर समाधान बनाने के लिए 990 μl द्वि आसुत जल को हाइड्रोजन पेरोक्साइड समाधान (purum देहात, ≥ 30%) के एल 12 घंटे के भीतर इस्तेमाल किया जाएगा.
    4. सही प्रयोग से पहले कदम से EBSS में 1.2.3 से 50 माइक्रोन शेयर समाधान पतला.
    5. Redox सेंसर के ऑक्सीकरण के लिए EBSS में हाइड्रोजन पेरोक्साइड 50 माइक्रोन के साथ माप के दौरान microfluidic प्रणाली के माध्यम से सेल spheroids सेते हैं.
  3. 3 प्रयोग: शुरूआत और spheroids भीतर सेलुलर परिगलन की लेबलिंग
    1. साथ पूरक DMEM संस्कृति माध्यम में एक 96 अच्छी तरह से थाली के agarose जेल में लिपटे कुओं में बीज के बारे में 400 कोशिकाओं (जैसे, U251 एमजी-L106-Grx1-roGFP2 glioblastoma कोशिकाओं) (प्रक्रिया चरणों में वर्णित 1.1.1-1.1.3) 10% एफसीएस, 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन और hygromycin बी (150 मिलीग्राम / एमएल).
    2. 5% सीओ 2 और 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में लगभग 200-300 मीटर की एक व्यास अप करने के लिए 5-7 दिनों के लिए spheroids आगे बढ़ें.
    3. सेल सेतेसंस्कृति के माध्यम में 1 माइक्रोन की एकाग्रता में 3 घंटे के लिए mitochondrial इलेक्ट्रॉन परिवहन अवरोध rotenone साथ spheroids सेलुलर परिगलन प्रेरित करने के लिए. साथ ही, परिगलित कोशिकाओं लेबल 1 मिलीलीटर संस्कृति माध्यम में 1 μl की एकाग्रता में 3 घंटे के लिए एक हरे रंग की cytotoxicity डाई के साथ सह सेते हैं.
    4. संस्कृति के माध्यम या माइक्रोस्कोपी से पहले EBSS साथ सेल spheroids धो लें.

2 लाइट शीट समायोजन

नोट: सबसे अच्छा परिणाम प्राप्त करने के लिए यह प्रकाश शीट की किरण कमर उद्देश्य लेंस का फोकस विमान में है कि यह सुनिश्चित किया जाना है. किरण कमर की स्थिति केवल (- 2.8 कदम 2.5 देखें) केशिका के संबंध में खड़ी स्थिति में प्रकाश चादर देख कर गठबंधन किया जा सकता है.

  1. एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग करें और संदर्भ में वर्णित है, SPIM उत्तेजना मॉड्यूल माउंट. 16, स्थिति तालिका के baseplate (चित्रा 1 ए देखें).
  2. एक 1 के साथ खुर्दबीन लैस0x / 0.3 या 20X / 0.5 माइक्रोस्कोप उद्देश्य लेंस और सूक्ष्मदर्शी का पता लगाने के रास्ते में एक उपयुक्त लंबे पास फिल्टर (जैसे, λ ≥ 515 एनएम).
  3. माइक्रोस्कोप का पता लगाने के बंदरगाह के लिए एक एकीकृत कैमरा माउंट.
  4. Preferentially 470 एनएम के एक उत्तेजना तरंग दैर्ध्य के साथ एक लेजर या एक लेजर डायोड का एक समानांतर collimated बीम का प्रयोग करें और SPIM मॉड्यूल के लिए लागू होते हैं.
  5. प्रकाश शीट की किरण कमर की एक अक्षीय समायोजन के लिए एक ऊर्ध्वाधर स्थिति में प्रकाश शीट स्थानान्तरण जो 90 डिग्री, द्वारा बेलनाकार लेंस घुमाएँ.
  6. नमूना धारक में एक फ्लोरोसेंट डाई के साथ एक तरल युक्त एक केशिका रखें.
  7. माइक्रोस्कोप की स्थिति तालिका में केशिका साथ नमूना धारक देते हैं और यह केंद्रित है और प्रकाश शीट की किरण कमर ध्यान में है कि इस तरह के केशिका की स्थिति संरेखित.
  8. बेलनाकार लेंस खुद का अक्षीय स्थिति की भिन्नता से किरण कमर समायोजित करें. विज्ञापन के बाद लेंस वापस बारीjustment.

3 सेल उपगोल आवेदन और माइक्रोस्कोप फ़ीड तुल्यकालन

  1. 600 माइक्रोन x 600 माइक्रोन की एक आंतरिक पार अनुभाग और 120 माइक्रोन की एक दीवार मोटाई के साथ अलग से या आयताकार borosilicate ग्लास केशिकाओं 16 के भीतर समूहों में सेल spheroids रखें. एक सेल अंडाकार आकृति के आवेदन के लिए दो तकनीक सफल साबित किया है.
    1. अपने अंगूठे और बीच की उंगली के साथ ईमानदार खाली केशिका लो और अपनी तर्जनी के साथ ऊपरी उद्घाटन सील. कम अपने आसपास के तरल में सेल अंडाकार आकृति के करीब उद्घाटन (EBSS या संस्कृति के माध्यम) लाओ. ऊपरी खोलने से तर्जनी रिलीज. इसमें सेल अंडाकार आकृति के साथ तरल केशिका बलों द्वारा तत्काल में भिगो कर दिया जाएगा. केशिका के संबंधित ईमानदार स्थिति में गुरुत्वाकर्षण से भरा केशिका भीतर अंडाकार आकृति की स्थिति को समायोजित करें.
    2. वैकल्पिक रूप से, pipetting माध्यम केशिका सेल अंडाकार आकृति लागू होते हैं. ख्याल था लोअंडाकार आकृति आकार के लिए काफी बड़ा एक ओर पिपेट है की टिप के उद्घाटन,, टी और, दूसरी ओर, कम या केशिका के भीतरी व्यास के आकार में बराबर.
  2. माइक्रोस्कोपी के लिए एक विशेष नमूना धारक में उस में अंडाकार आकृति के साथ केशिका रखें.
  3. माइक्रोस्कोप की स्थिति तालिका में केशिका साथ नमूना धारक देते हैं और यह केंद्रित है और जोर दिया है कि इस तरह के सेल अंडाकार आकृति की स्थिति संरेखित.
  4. प्रकाश चादर और प्रतिबिंब दर्पण की स्थिति और बेलनाकार लेंस का समायोजन करके पता लगाने के रास्ते में माइक्रोस्कोप उद्देश्य लेंस के फोकल हवाई जहाज़ के बीच मिलान सेट (चित्रा 1 बी में समायोजन पेंच देखें).
  5. माइक्रोमीटर पेंच समायोजित अपवर्तन सूचकांक और fishtank प्रभाव की भरपाई करने के लिए उद्देश्य लेंस के संख्यात्मक एपर्चर के अनुसार (चित्रा 1 बी देखें).
    नोट: अलग अपवर्तन नमूना के सूचकांक और टी आसपास के मीडियावह उद्देश्य लेंस की पारी और फोकल हवाई जहाज़ की पारी के बीच एक अंतर के उद्देश्य लेंस का नेतृत्व. प्रकाश चादर उद्देश्य बुर्ज द्वारा ले जाया जाता है, प्रकाश शीट (ऑब्जेक्टिव लेंस की पारी के लिए इसी) और फोकल हवाई जहाज़ की पारी की पारी के बीच बेमेल एक लीवर हाथ से मुआवजा दिया है (चित्रा 1 बी देखें). माइक्रोमीटर पेंच उद्देश्य लेंस के संख्यात्मक एपर्चर और अपवर्तन सूचकांक के अनुसार प्रकाश शीट की पारी को समायोजित करने के लिए ऊपरी और निचले पिन के बीच की दूरी अनुकूलित करने के लिए प्रयोग किया जाता है.

चित्रा 1
एक विमान रोशनी की चित्रा 1 (ए) एक औंधा माइक्रोस्कोप की स्थिति तालिका के baseplate के लिए मुहिम शुरू ही विमान रोशनी मॉड्यूल के चित्र, (बी) सेटअपमॉड्यूल और माइक्रोस्कोप फ़ीड तुल्यकालन फोकल हवाई जहाज़ और रोशनी विमान के बीच उठाने-बेमेल (fishtank प्रभाव) क्षतिपूर्ति करने के लिए. Δz ओ फोकल हवाई जहाज़ की पारी और प्रकाश चादर च उद्देश्य लेंस और Δz के बदलाव का संकेत भी. जड़ना अंडाकार आकृति युक्त केशिकाओं के पार वर्गों से पता चलता है. वाम: आयताकार केशिका 600 माइक्रोन (दीवार 120 माइक्रोन) के भीतरी व्यास के साथ. अधिकार: रोटेशन के लिए इस्तेमाल किया सेटअप. एक आंतरिक दौर केशिका (भीतरी व्यास 400 माइक्रोन, बाहरी व्यास 550 माइक्रोन) बाहरी आयताकार केशिका भीतर घुमाया जा रहा है. दो केशिकाओं के बीच की जगह एक विसर्जन द्रव से भर जाता है.

गतिशील तरल वातावरण में 4 मापन

नोट: पिछले प्रोटोकॉल सेल अंडाकार आकृति को पहले साधारण गुरुत्वाकर्षण द्वारा केशिका में जगह में incubated और फिर आयोजित किया गया है जहां एक माप करने से पहले स्थिर ऊष्मायन के लिए प्रयोग किया जाता है. आगे fixati के लिए कोई ज़रूरत नहीं हैपर. हालांकि, एक गतिशील ऊष्मायन और, इसलिए, एक गतिशील वातावरण तेज कैनेटीक्स को मापने के लिए वांछनीय है जहां मीडिया बहने में माप के लिए, एक इस उप प्रोटोकॉल हासिल कर सकते हैं. 4.5-4.9 नमूना तक पहुँचने हवाई बुलबुले से बचने के लिए महत्वपूर्ण हैं कदम.

  1. 30 मिनट आंतरिक कांच की सतह के लिए एक सेल अंडाकार आकृति के बाद सेलुलर आसंजन का समर्थन करने के लिए एफसीएस साथ केशिका भरें.
  2. समाप्त केशिका में शेष एफसीएस कोटिंग कम से कम 12 घंटे के लिए बाहर सूखी हैं.
  3. कदम 3.2 में वर्णित के रूप में FCS लेपित केशिका सेल अंडाकार आकृति का परिचय.
  4. अंडाकार आकृति के सेलुलर आसंजन पैदा करने के लिए 5% सीओ 2 और अतिरिक्त 2-4 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में केशिका छोड़ दें.
  5. Microfluidic प्रणाली की afflux हिस्सा सेट अप (चित्रा 2 देखें). (: 0.89 मिमी भीतरी व्यास) फ्लोरोसेंट रंजक, दवा या एजेंट युक्त संस्कृति के माध्यम से ट्यूबिंग का afflux भरने के लिए एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप का प्रयोग करें.
  6. Conneएक बुलबुला फंसाने के लिए microfluidic प्रणाली की afflux हिस्सा कनेक्टिकट (चित्रा 2 देखें).
  7. पहले afflux ट्यूबिंग के लिए बुलबुला मुक्त केशिका दबाना और फिर नाली ट्यूबिंग को केशिका के दूसरी ओर दबाना.
  8. ट्यून वांछित मूल्य (जैसे, 37 डिग्री सेल्सियस) के लिए पानी के स्नान के तरल तापमान.
  9. वांछित पंप वेग को क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप समायोजित (जैसे, प्रवाह दर: 9 μl / मिनट, पंप वेग केशिका में: 25 मिमी / मिनट).
  10. एक प्राप्तकर्ता (खुले पाश सेटअप) में पंप तरल या तो लीजिए अपने स्रोत (बंद लूप सेटअप) को वापस खिलाने या क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप (तंग बंद लूप सेटअप) की ट्यूबिंग में सीधे खाते हैं.

चित्रा 2
चित्रा 2 Microfluidic सेटअप (खुले पाश और तंग बंद लूप); जड़ना: एक SPH की रोशनीएक औंधा माइक्रोस्कोप के लिए युग्मित प्रकाश चादर आधारित प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग एक सूक्ष्म केशिका भीतर eroid.

5 डाटा अधिग्रहण और विश्लेषण

  1. लेजर शक्ति और छवि अधिग्रहण के लिए एकीकरण समय निर्धारित करें.
  2. कदम 5.1 में परिभाषित मापदंडों प्रकाश खुराक मूल्यों देशी कोशिकाओं के बारे में 50-100 जम्मू / 2 सेमी या एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन एन्कोडिंग प्लाज्मिड करने के साथ एक फ्लोरोसेंट डाई के साथ incubated या ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के लिए 10-20 जम्मू / 2 सेमी से अधिक नहीं है कि ध्यान रखना (विवरण के संदर्भ. 12 देखने के लिए) phototoxicity से बचें.
  3. Δz के लिए z ढेर के लिए वेतन वृद्धि = प्रकाश शीट मोटाई के बारे में 10 माइक्रोन के रूप में 3 आयामी डेटा विश्लेषण के लिए बेहतर है जो 5-10 माइक्रोन सेट करें.
  4. सेल अंडाकार आकृति के भीतर फोकल हवाई जहाज़ की भिन्नता द्वारा एकल छवियों या जेड के ढेर के मापन का प्रदर्शन.

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Representative Results

प्रयोग 1: सेल spheroids एक chemotherapeutic दवा के साथ incubated

एक पहले incubated MCF 7 सेल अंडाकार आकृति (8 माइक्रोन डॉक्सोरूबिसिन, 6 घंटा) की एक z ढेर स्कैन चित्रा 3 में दिखाया गया है. यह सेलुलर तेज और डॉक्सोरूबिसिन 17 के वितरण और इसकी गिरावट उत्पाद 18,19 के बारे में विस्तृत जानकारी देता है. भीतरी अंडाकार आकृति क्षेत्रों में एक गिरावट उत्पाद द्वारा उत्सर्जित हरी प्रतिदीप्ति सेलुलर झिल्ली 19 में प्रभावी हो जाता है, जबकि अंडाकार आकृति लाल फ्लोरोसेंट डॉक्सोरूबिसिन के बाहरी सेल परत के भीतर मुख्य रूप से, नाभिक में स्थानीय है.

चित्रा 3
एक MCF 7 स्तन कार्सिनोमा सेल SPH की विभिन्न परतों (Δz = 10 माइक्रोन) से चित्रा 3 प्रतिदीप्ति छवियोंएक विमान रोशनी माइक्रोस्कोपी द्वारा दर्ज डॉक्सोरूबिसिन (8 माइक्रोन, 6 घंटा) के साथ incubated eroid; Z-प्रक्षेपण का उपयोग 3 आयामी पुनर्निर्माण (उत्तेजना: λ = 470 एनएम, प्रतिदीप्ति जांच: λ ≥ 515 एनएम, माइक्रोस्कोप उद्देश्य लेंस: 10x / 0.30 योजना NEOFLUAR).

देशी MCF 7 मानव स्तन कैंसर सेल spheroids में chemotherapeutic दवा डॉक्सोरूबिसिन के तेज SPIM द्वारा चयनित एक एकल कोशिका परत के लिए 4 चित्र में दिखाया गया है. लगातार डॉक्सोरूबिसिन का प्रवाह प्रणाली लाल और हरे रंग प्रतिदीप्ति के भीतर मध्यम संस्कृति में 2 माइक्रोन के आवेदन और इसकी गिरावट उत्पाद में वृद्धि होने पर (छवियों और स्पेक्ट्रम दर्शाया).

चित्रा 4
2 माइक्रोन डॉक्सोरूबिसिन के सेलुलर तेज की 4 चित्र टाइम कोर्सmicrofluidic प्रणाली के माध्यम से संस्कृति के माध्यम में. अतिरिक्त प्रतिदीप्ति उत्सर्जन स्पेक्ट्रम (उत्तेजना के साथ अपनी बढ़त से 80 माइक्रोन की दूरी पर ही विमान रोशनी माइक्रोस्कोपी द्वारा दर्ज एक MCF 7 स्तन कार्सिनोमा सेल अंडाकार आकृति की एक परत के प्रतिदीप्ति छवियों: λ = 470 एनएम, प्रतिदीप्ति जांच: λ ≥ 515 एनएम ; माइक्रोस्कोप उद्देश्य लेंस: 10x / 0.3 योजना NEOFLUAR).

प्रयोग 2: एक redox सेंसर व्यक्त spheroids में ऑक्सीकरण प्रक्रिया

Intracellular redox राज्यों की SPIM माप ट्यूमर में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों, जैसे, पर कुछ जानकारी दे सकते हैं. इस प्रयोजन के लिए U251MG-L106 glioblastoma कोशिकाओं का एक अंडाकार आकृति को स्थायी रूप से संवेदनशील हरी फ्लोरोसेंट redox सेंसर Grx1-roGFP2 इस्तेमाल किया गया था glutathione साथ ट्रांसफ़ेक्ट. Glutathione के ऑक्सीकरण नमक solut में 50 माइक्रोन हाइड्रोजन पेरोक्साइड (एच 2 हे 2) के लिए जोखिम से प्रेरित किया गया था microfluidic प्रणाली के माध्यम से आयन (EBSS) और मुख्य रूप से अंडाकार आकृति के बाहरी सेल परतों में हुई.

Redox सेंसर की कम फार्म के लिए इसी एच 470 एनएम पर उत्साहित प्रतिदीप्ति तीव्रता की कमी में 2 हे 2 परिणामों के पहले 20 तेज, जैसा कि रिपोर्ट. ऊष्मायन एच की शुरुआत में 2 हे 2 दृढ़ता (मोटाई: 50 माइक्रोन) बाहरी सेल परतों को प्रभावित करता है अंडाकार आकृति की और उसके बाद भीतरी क्षेत्र में (व्यास: 150 माइक्रोन) गहरे प्रवेश एक धीमी गिरावट में जिसके परिणामस्वरूप ऊष्मायन समय बढ़ाने के साथ अंडाकार आकृति की प्रतिदीप्ति तीव्रता का. इस कमी के समय पाठ्यक्रम SPIM प्रणाली 20 से तेजी से पता लगाने के साथ संयुक्त तेजी से दवा आवेदन करने की संभावना का प्रदर्शन, चित्रा 5 में दिखाया गया है.

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एक U251MG-L106 ग्लियोब्लास्टोमा सेल अंडाकार आकृति के 2 ओ 2 ऊष्मायन 50 माइक्रोन एच में प्रतिदीप्ति कमी की चित्रा 5 टाइम कोर्स को स्थायी रूप से glutathione संवेदनशील हरी फ्लोरोसेंट redox सेंसर Grx1-roGFP2 साथ ट्रांसफ़ेक्ट. बाहरी परत और एक सेल अंडाकार आकृति के भीतरी क्षेत्र के लिए intracellular redox राज्य कैनेटीक्स ही विमान रोशनी माइक्रोस्कोपी (प्रवाह के तहत सेल अंडाकार आकृति की एक परत) द्वारा दर्ज प्रतिदीप्ति छवियों का मतलब तीव्रता मूल्यों से प्राप्त हुई थी.

3 प्रयोग: शुरूआत और spheroids भीतर सेलुलर परिगलन की लेबलिंग

सेलुलर गल जाना आरंभ करने के लिए एक U251 एमजी-L106-Grx1-roGFP2 ग्लियोब्लास्टोमा सेल अंडाकार आकृति 3 घंटे के लिए 1 माइक्रोन rotenone साथ incubated था. न्यूरोटौक्सिक एजेंट rotenone mitochondrial इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला के एक अवरोध करनेवाला है और कोशिका झिल्ली अखंडता का नुकसान होता है. Visua करने के लिएLize परिगलित प्रभाव, अंडाकार आकृति क्षतिग्रस्त कोशिका में प्रवेश और सेल नाभिक में डीएनए को बांधता है, जो (1 मिलीलीटर संस्कृति मध्यम, 3 घंटा में 1 μl) (देखें चित्र हरी फ्लोरोसेंट cytotoxicity लेबलिंग डाई के साथ सह incubated था 6A, सी). संदर्भ के लिए, पूरे अंडाकार आकृति का एक उज्ज्वल क्षेत्र रोशनी छवि चित्र 6B में दिखाया गया है.

चित्रा 6
की विभिन्न परतों (Δz = 5 माइक्रोन) से चित्रा 6 (ए) प्रतिदीप्ति छवियों एक U251 एमजी-L106-Grx1-roGFP2 ग्लियोब्लास्टोमा सेल उपगोल सह incubated rotenone (1 माइक्रोन, 3 घंटा) और हरी cytotoxicity डाई के साथ (1 एक विमान रोशनी माइक्रोस्कोपी (पैमाने बार 100 मीटर), (ख) उज्ज्वल फाई द्वारा दर्ज 1ml संस्कृति के माध्यम में μl, 3 घंटा)पूरे अंडाकार आकृति, और (सी) के वृद्धावस्था रोशनी 3 आयामी प्रतिदीप्ति छवि (उत्तेजना: λ = 470 एनएम, प्रतिदीप्ति जांच: λ ≥ 515 एनएम, माइक्रोस्कोप उद्देश्य लेंस: 20X / 0.5 योजना NEOFLUAR) खंगाला.

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Discussion

वर्तमान पांडुलिपि एक प्रकाश चादर या 3 आयामी सेल प्रणाली के लिए अनुकूलित है जो एक विमान रोशनी माइक्रोस्कोपी (SPIM) डिवाइस, जैसे, बहु सेलुलर ट्यूमर spheroids (MCTS) का वर्णन है. तीन अनुकरणीय आवेदन पत्र (1) एक cytostatic दवा के तेज और (जिसका chemotherapeutic प्रभावकारिता के लिए योगदान अभी भी मूल्यांकन किया जाना बना रहता है) एक गिरावट उत्पाद को अपनी आंशिक रूपांतरण, एक आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग glutathione सेंसर का उपयोग पर से redox राज्य के (2) माप शामिल एक ऑक्सीकरण एजेंट के अलावा, और (3) दीक्षा और mitochondrial सांस की श्रृंखला के निषेध पर सेल परिगलन की लेबलिंग.

मौजूदा सिस्टम (जैसे, उन refs में सूचना दी. 7, 8, 9, 14, 15) के साथ तुलना में इस SPIM मॉड्यूल का मुख्य लाभ यह आसानी से किसी भी उल्टे व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोप के लिए अनुकूलित किया जा सकता है कि कर रहे हैं, और नमूनों में स्थित हैं कि केवल थोड़ी मात्रा ओ जरूरत है जो छोटे से मापने कक्षों (सूक्ष्म केशिकाओं),च फ्लोरोसेंट रंजक, दवा एजेंटों या दवाओं इस प्रकार दवा परीक्षण के लिए जैसे लागत, कम से कम, प्रयोगों के विभिन्न प्रकार के लिए लागू किया जाएगा. एक सूक्ष्म fluidic प्रणाली, इस पांडुलिपि में सूचना दी, प्रयोग किया जाता है, तो यह है, साथ ही रहती है. हालांकि, यह एक खुले पाश के लिए सेटअप कम प्रवाह दरों लागत प्रभावी दवा स्क्रीनिंग के लिए फायदेमंद हैं, हालांकि, 1,440 μl / मिनट के लिए ऊपर एक्सचेंज (4,000 मिमी / मिनट के लिए ऊपर वेग के लिए इसी), कि उल्लेख किया जाना चाहिए तहत संभव होने का पता चला केशिका से spheroids की टुकड़ी के बिना वर्तमान प्रयोगात्मक शर्तों. एक तंग बंद लूप सेटअप के लिए 200-300 μl की एक न्यूनतम कुल तरल मात्रा स्वतंत्र रूप से पंप वेग से, आवश्यक है.

, जैसे, एक लेजर या लेजर डायोड, एक विवर्तन सीमित जगह पर ध्यान केंद्रित किया जा सकता है जो किसी भी प्रकाश स्रोत रोशनी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. विभिन्न प्रकाश स्रोतों के अनुप्रयोग, तथापि, अतिरिक्त TELES द्वारा या तो, रंगीन सुधार की आवश्यकताव्यक्तिगत प्रकाश स्रोतों 20 के सामने या एक अवर्णी रोशनी प्रणाली डिजाइन द्वारा रखा प्रणालियों सामना. , नमूना से अधिक inhomogeneous हो सकता है जो स्पष्ट आगे बिखरने से एक और समस्या के परिणाम, इस प्रकार धारियों या छाया की तरह कलाकृतियों के कारण. एक wobbling मोड 21 या विशेष सॉफ्टवेयर एल्गोरिदम 22 में रोशनी कोण से बढ़ रहे हैं, हालांकि, उन कलाकृतियों को कम कर सकते हैं.

वर्तमान रोशनी प्रणाली एक telecentric किरण विस्तार के होते हैं और 50 मिमी की एक बेलनाकार लेंस फोकल लंबाई और एक संख्यात्मक एपर्चर एक एन = 0.08 द्वारा ध्यान केंद्रित. फार्मूला डी के मुताबिक = λ / A यह लगभग 6 मीटर मोटे तौर पर एक सेल परत की मोटाई से मेल खाती है और जो (उत्तेजना तरंग दैर्ध्य λ पर निर्भर करता है) प्रकाश शीट, के के एक मोटाई में परिणाम Fraunhofer विवर्तन के लिए एन आदर्श लगती है व्यक्तिगत परतों के अवलोकन के लिए. एक उच्च अक्षीय संकल्प मैं तोवांछित है, संख्यात्मक एपर्चर प्रकाश चादर अपने एपर्चर विमान में ध्यान केंद्रित किया जा रहा है साथ रोशनी रे में मध्यम या उच्च संख्यात्मक एपर्चर की एक और माइक्रोस्कोप उद्देश्य लेंस की प्रविष्टि द्वारा बढ़ाया जा सकता है. यह, हालांकि, (यह रोटेशन के लिए क्षतिपूर्ति कर सकते हैं 90 डिग्री से बेलनाकार लेंस के एक रोटेशन) को 90 डिग्री तक घुमाया जा रहा है, जो नमूना, के विमान में एक और प्रकाश चादर में यह परिणाम है. लंबी दूरी की खुर्दबीन लेंस के बारे में 0.60 तक का संख्यात्मक apertures है, प्रकाश शीट की मोटाई इस प्रकार लेजर confocal माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग में प्राप्त अक्षीय संकल्प आ भी कम 1 माइक्रोन या कम किया जा सकता. इसके साथ ही एक एन के लिए आनुपातिक है जो क्षेत्र की गहराई -2 कम से कम 2 माइक्रोन तक के बारे में 100 माइक्रोन से कम है.

एक केन्द्र पारी सुधार की वजह से एक अपवर्तनांक बेमेल को तथाकथित fishtank प्रभाव की भरपाई करने के लिए प्रयोग किया जाता है. खुर्दबीन उद्देश्य से ले बदलावऑप्टिकल अक्ष के साथ एनएस नमूना अंदर ध्यान बदलाव से अलग है. हवा और नमूना वस्तु ऊंचाई आसपास के मध्यम बीच अपवर्तक सूचकांक के अनुपात के आधार पर मोटे तौर पर 1.35 का एक पहलू से जीता और जेड रिकॉर्डिंग के लिए SPIM में फोकल हवाई जहाज़ और रोशनी विमान के बीच एक ही पहलू से एक उठाने बेमेल की ओर जाता दिखाई देता है -stacks (संदर्भ के लिए चित्रा 1 बी देखें).

बहु सेलुलर ट्यूमर spheroids (MCTS) किसी भी दिशा से प्रबुद्ध किया जा सकता है बल्कि सममित नमूने हैं. हालांकि, विभिन्न पक्षों से कम सममित नमूने या छोटे जीवों रोशनी के लिए वांछनीय हो सकता है. इसलिए, हमने हाल ही में आयताकार केशिका भीतर घुमाया जा सकता है कि नमूने बेलनाकार आकृति का एक सूक्ष्म केशिका में स्थित हैं, जहां एक सेटअप 23, (भीतरी व्यास 400 माइक्रोन, बाहरी व्यास 550 माइक्रोन) विकसित (भीतरी व्यास 600 माइक्रोन, दीवार मोटाई 120 माइक्रोन), वें के रूप में दर्शायाचित्रा 1 बी की ई जड़ना. कारण दो केशिकाओं प्रकाश चादर आधारित माइक्रोस्कोपी के लगभग पूर्ण ऑप्टिकल युग्मन के लिए किसी भी सीमा के बिना नमूना के रोटेशन के साथ जोड़ा जा सकता है.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

इस परियोजना भूमि Baden-Württemberg से और साथ ही यूरोपीय संघ, Europäischer Fonds द्वारा वित्त पोषित फर Regionale ENTWICKLUNG मर गया था. लेखकों कुशल तकनीकी सहायता के लिए U251 एमजी-L106-Grx1-roGFP2 सेल लाइन और क्लौडिया Hintze प्रदान करने के लिए रेनर Wittig (ILM उल्म) धन्यवाद.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microtiter plate Orange Scientific 4430100 For cell spheroid growing
Agarose  Carl Roth GmbH 3810.1 For cell spheroid growing
MCF-7 cell line CLS Cell Lines Service GmbH 300273 Cell line
U251-MG-L106 cell line Cell line
DMEM Biochrom AG (Merck Millipore) FG0435 Culture medium
DMEM/Ham's F-12 Biochrom AG (Merck Millipore) FG4815 Culture medium
FCS Biochrom AG (Merck Millipore) S0615 Cell culture supplement
Penicillin/streptomycin Biochrom AG (Merck Millipore) A 2213 Antibiotics
Hygromycin B PAA Laboratories   P02-015 Antibiotic
EBSS Sigma-Aldrich Inc. E3024 Cell culture supplement
Doxorubicin Sigma-Aldrich Inc. D1515 Fluorescent dye (CAUTION: acute toxicity)
Green cytotoxicity dye Promega GmbH G8742 CellTox - fluorescent cytotoxicity dye
Rotenone Sigma-Aldrich Inc. R8875 Cellular inhibitor (CAUTION: acute toxicity)
Hydrogen peroxide (H2O2) Sigma-Aldrich Inc. 95302 Reagent for oxidation (CAUTION: acute toxicity)
Capillary VitroCom  8260-050 Sample preparation
Microscope Carl Zeiss Jena Axiovert 200M
AxioCam MRc CCD-camera Carl Zeiss MicroImaging GmbH 426508-9901-000 CCD-camera
AxioVision data aquisition software Carl Zeiss MicroImaging GmbH version 4.8.2.
Laser diode Pico Quant GmbH LDH-P-C-470 Used with driver PDL800-B
Peristaltic pump Ismatec Labortechnik MS-1 Reglo Re-calibrated to reduce the minimum pump speed by 1/10 
Silicone tubes IDEX Health & Science GmbH TYGON R3607

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References

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भौतिकी अंक 90 प्रतिदीप्ति प्रकाश शीट एक विमान रोशनी माइक्रोस्कोपी (SPIM) 3 डी सेल संस्कृतियों आयताकार केशिका microfluidics बहु सेलुलर ट्यूमर spheroids (MCTS) व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोपी
एकल विमान रोशनी मॉड्यूल और एक व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोप के लिए माइक्रो केशिका दृष्टिकोण
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Bruns, T., Schickinger, S., Schneckenburger, H. Single Plane Illumination Module and Micro-capillary Approach for a Wide-field Microscope. J. Vis. Exp. (90), e51993, doi:10.3791/51993 (2014).

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