Summary
Un módulo para la iluminación microscopía de plano único (SPIM) se describe que se adapta fácilmente a un microscopio de campo amplio invertida y optimizado para cultivos celulares 3-dimensionales. La muestra se encuentra dentro de un capilar rectangular, y a través de un sistema de microfluidos colorantes fluorescentes, agentes farmacéuticos o medicamentos puede ser aplicado en pequeñas cantidades.
Abstract
Un módulo para la hoja de luz o iluminación microscopía de plano único (SPIM) se describe que se adapta fácilmente a un microscopio de campo amplio invertida y optimizado para cultivos de células de 3 dimensiones, por ejemplo, esferoides tumorales multicelulares (MCT). Las formas del módulo de excitación SPIM y desvía la luz de tal manera que la muestra es iluminada por una lámina de luz perpendicular a la trayectoria de detección del microscopio. El sistema se caracteriza por el uso de un capilar rectangular para sostener (y en una versión avanzada también por un enfoque de micro capilar para hacer girar) las muestras, mediante el ajuste sincrónico de la hoja de luz de iluminación y la lente del objetivo utilizada para la detección de fluorescencia, así como por la adaptación de un sistema de microfluidos para la aplicación de tintes fluorescentes, agentes farmacéuticos o medicamentos en pequeñas cantidades. Se da un protocolo para trabajar con este sistema, y algunos detalles técnicos son reportados. Los resultados representativos incluyen (1) mediciones de la UPtomar de un fármaco citostático (doxorrubicina) y su conversión parcial a un producto de degradación, (2) mediciones redox mediante el uso de un sensor de glutatión codificado genéticamente después de la adición de un agente oxidante, y (3) la iniciación y el etiquetado de necrosis celular de la inhibición de la cadena respiratoria mitocondrial. Se discuten las diferencias y ventajas de la presente módulo SPIM en comparación con los sistemas existentes.
Introduction
Además de los métodos bien establecidos (confocal o de múltiples fotones microscopía de escaneo láser 1-4, iluminación estructurada de microscopía 5,6) de lámina de luz o microscopía de iluminación plano único (SPIM) ha demostrado ser un valioso método de formación de imágenes 3D 7,8, 9. De particular interés es su aplicación a cultivos de células de 3 dimensiones, por ejemplo, esferoides tumorales multicelulares (MCT), que se utilizan cada vez más para la investigación de descubrimiento de fármacos 10,11. Además, SPIM es un método preferencial cuando incluso después de la exposición a largo plazo o mediciones repetitivas se requieren dosis bajas de luz para mantener la viabilidad de la muestra, ya que para la medición de cada plano de la muestra sólo este plano se expone a la luz. Esto está en contraste con otras técnicas de microscopía, donde para la detección de cada plano focal se ilumina toda la muestra, de modo que tras la grabación de numerosos planos las sumas dosis de luz y puede dañar la muestra 12. Microscopía de lámina de luz o SPIM se basa en la iluminación de la muestra en dirección perpendicular a la trayectoria de observación ya sea mediante el uso de una lente cilíndrica o escaneando el haz de láser excitante (para una revisión ver ref. 8). Esto a menudo requiere cámaras de muestras especiales 13,14 o matrices, por ejemplo, agarosa 7,15, implementado en los microscopios especiales de alto costo. Como una alternativa a los sistemas de un dispositivo de iluminación sencilla comparable para SPIM se ha desarrollado y adaptado a un microscopio invertido convencional 16 (véase la Figura 1). Se compone de un haz de láser expandido a un diámetro de 8 mm y enfocada por una lente cilíndrica (longitud focal: 50 mm, apertura numérica: 0,08) a una hoja de luz de 6-10 micras de espesor sobre una profundidad de campo de aproximadamente 100 micras . Las muestras se encuentran en un capilar rectangular de 600-900 m de diámetro interior colocado delante del microscopio len objetivos para la detección de fluorescencia. Estas características principales están actualmente completado y optimizado por el uso de enfoques micro-capilares avanzadas para sujetar y para la rotación de las muestras, el ajuste sincrónico de la hoja de luz de iluminación (en dirección axial) y la lente del objetivo utilizados para la detección de fluorescencia (camino óptico idéntico longitudes de desplazamiento requieren una corrección de la alimentación mecánica), y la adaptación de un sistema de microfluidos para la aplicación de tintes fluorescentes, agentes farmacéuticos o medicamentos, minimizando de este modo las cantidades y los gastos necesarios.
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Protocol
1. célula que crece esferoide e Incubación
- Experimento 1: esferoides de células incubadas con un fármaco quimioterapéutico
- Preparar agarosa al 1,5% en medio de cultivo mediante la adición de 0,45 g de agarosa a 30 ml de medio de cultivo (suficiente para 6 platos).
- Calentar la mezcla de la etapa 1.1.1 a al menos 80 ° C mientras se agita de vez en cuando.
- Llenar 50 l de la mezcla calentada desde el paso 1.1.2 en cada pocillo de una placa de 96 pocillos y se deja solidificar dentro de 1-2 horas. Guarde las placas cerradas y cubiertas en el refrigerador a 5 º C hasta su uso.
- Semilla sobre 150 células MCF-7 de cáncer de mama en cada pocillo de la placa preparada 96 pocillos en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con medio F-12 de cultivo de Ham suplementado con 10% de suero de ternera fetal (FCS) y 1% de penicilina / estreptomicina .
- Grow esferoides durante 5-7 días hasta un diámetro de aproximadamente 200-300 micras en un incubador a 5% de CO2 y 3776; C.
- Incubar los esferoides celulares con el clorhidrato de doxorrubicina antibiótico de antraciclina durante 6 horas a una concentración que oscila entre 2 M y 8 M (en medio de cultivo) en una incubadora a 5% de CO2 y 37 ° C.
- Lave los esferoides celulares con medio de cultivo o solución salina equilibrada de Earle (EBSS) antes de la microscopía.
- Experimento 2: Proceso de oxidación en esferoides que expresan un sensor redox
- Semilla sobre 400 células de glioblastoma U251-MG-L106 permanentemente transfectadas con el sensor de glutatión redox verde fluorescente sensible Grx1-roGFP2 en los pozos recubiertos con gel de agarosa (procedimiento descrito en los pasos 1.1.1-1.1.3) de una placa de 96 pocillos en DMEM medio de cultivo suplementado con 10% de FCS, 1% de penicilina / estreptomicina e higromicina B (150 mg / ml).
- Crecer esferoides durante 5-7 días hasta un diámetro de alrededor de 200 a 300 micras en una incubadora a 5% de CO2 y 37 ° C.
- Añadir 10 & #181; l de solución de peróxido de hidrógeno (pa purum, ≥ 30%) a 990 agua bidestilada l para crear una solución madre 100 mM para ser utilizado dentro de 12 horas.
- Diluir la solución madre de la etapa 1.2.3 a 50 M en EBSS justo antes del experimento.
- Incubar los esferoides de células a través del sistema de microfluidos durante la medición con peróxido de hidrógeno 50 mM en EBSS para la oxidación del sensor redox.
- Experimento 3: Iniciación y etiquetado de necrosis celular dentro de esferoides
- Semilla alrededor de 400 células (por ejemplo, células de glioblastoma U251-MG-L106-Grx1-roGFP2) en pozos recubiertos con gel de agarosa (procedimiento descrito en los pasos 1.1.1-1.1.3) de una placa de 96 pocillos en medio de cultivo DMEM suplementado con 10% de FCS, 1% de penicilina / estreptomicina e higromicina B (150 mg / ml).
- Crecer esferoides durante 5-7 días hasta un diámetro de alrededor de 200 a 300 micras en una incubadora a 5% de CO2 y 37 ° C.
- Incubar la célulaesferoides con el transporte de electrones mitocondrial rotenona inhibidor durante 3 horas a una concentración de 1 mM en medio de cultivo para inducir la necrosis celular. Además, co-incubar con un tinte verde citotoxicidad durante 3 horas a una concentración de 1 l en 1 ml de medio de cultivo para etiquetar células necróticas.
- Lave los esferoides celulares con medio de cultivo o EBSS antes de la microscopía.
2. Hoja Luz de ajuste
NOTA: Para lograr los mejores resultados, se debe garantizar que la cintura del haz de la hoja de luz está en el plano de enfoque de la lente objetivo. La posición de la cintura del haz sólo se puede alinear mediante la observación de la hoja de luz en posición vertical con respecto al capilar (consulte los pasos 2.5 a 2.8).
- Utilice un microscopio invertido y montar el módulo de excitación SPIM, como se describe en la Ref. 16, a la placa base de la mesa de posicionamiento (véase la Figura 1A).
- Equipar el microscopio con un 10X / o 20X 0,3 / 0,5 microscopio de lente de objetivo y un filtro apropiado de paso largo (por ejemplo, λ ≥ 515 nm) en la trayectoria de detección del microscopio.
- Montar la integración de una cámara al puerto de detección del microscopio.
- Utilice un haz colimado paralela de un láser o un diodo láser con una longitud de onda de excitación de 470 nm y preferentemente aplicar al módulo SPIM.
- Girar la lente cilíndrica 90 grados, que transfiere la hoja de la luz en una posición vertical para un ajuste axial de la cintura del haz de la hoja de luz.
- Coloque un capilar que contiene un líquido con un tinte fluorescente en el portamuestras.
- Una el soporte de la muestra con el capilar a la mesa de posicionamiento del microscopio y alinear la posición del capilar de manera que se centra y la cintura del haz de la hoja de la luz está en el foco.
- Ajuste la cintura del haz por la variación de la posición axial de la lente cilíndrica sí mismo. A continuación, girar la lente después de adglaje.
3. Cell Aplicación esferoide y Microscopio RSS Sincronización
- Coloque los esferoides de células por separado o en grupos dentro de capilares de vidrio de borosilicato 16 rectangular con una sección transversal interior de 600 micras x 600 micras y un espesor de pared de 120 micras. Dos técnicas para la aplicación de un esferoide de células han demostrado ser exitoso.
- Tome el capilar vacío en posición vertical con el dedo pulgar y el dedo medio y sellar la abertura superior con el dedo índice. Traiga la abertura inferior cerca del esferoide de células en su líquido circundante (EBSS o medio de cultivo). Soltar el dedo índice desde la abertura superior. Líquido con el esferoide de células en ella se empapó en forma inmediata por las fuerzas capilares. Ajustar la posición del esferoide dentro del capilar llenado por gravedad en posición vertical respectivo del capilar.
- Alternativamente, aplicar el esferoide de células para el capilar a través de pipeteado. Tome el cuidado del that la abertura de la punta de la pipeta es, por un lado, lo suficientemente grande para el tamaño del esferoide y, por otra parte, menos o igual en tamaño al diámetro interior del capilar.
- Coloque el capilar con el esferoide en ella en un soporte especial de la muestra para microscopía.
- Una el soporte de la muestra con el capilar a la mesa de posicionamiento del microscopio y alinear la posición del esferoide de células de tal manera que se centra y se concentró.
- Establecer la correspondencia entre la lámina de luz y el plano focal de la lente objetivo del microscopio en la trayectoria de detección mediante el ajuste de la posición del espejo de reflexión y la lente cilíndrica (véase tornillo de ajuste en la Figura 1B).
- Ajuste el tornillo micrométrico (véase la Figura 1B) de acuerdo con los índices de refracción y la apertura numérica de la lente objetivo para compensar el efecto pecera.
NOTA: Los diferentes índices de refracción de la muestra y el medio circundante tél plomo lente objetivo a una diferencia entre el desplazamiento de la lente objetivo y el cambio del plano focal. Puesto que la lámina de luz se mueve por la torreta objetivo, el desfase entre el desplazamiento de la lámina de luz (correspondiente al desplazamiento de la lente objetivo) y el desplazamiento del plano focal es compensada por un brazo de palanca (véase la Figura 1B). El tornillo micrométrico se utiliza para adaptar la distancia entre la parte superior y el pasador inferior para ajustar el desplazamiento de la hoja de luz de acuerdo con la apertura numérica de la lente objetivo y los índices de refracción.
Figura 1. (A) Imagen del módulo de iluminación plano único montado en la placa de base de la tabla de posicionamiento de un microscopio invertido, (B) de configuración del plano de iluminación únicomódulo y la sincronización de alimentación microscopio para compensar la elevación-desajuste (efecto pecera) entre el plano focal y el plano de iluminación. O Delta z indica el desplazamiento de la lente objetivo y Delta z f el desplazamiento del plano focal y la hoja de luz. La incrustación muestra secciones transversales de esferoide que contiene capilares. Izquierda: capilar rectangular con diámetro interior de 600 micras (de pared de 120 micras). Derecha: el programa de instalación utilizado para la rotación. Un capilar interior redonda (diámetro interior de 400 m, diámetro exterior de 550 micras) se gira dentro del capilar rectangular exterior. El espacio entre los dos tubos capilares se llena con un fluido de inmersión.
4. medición en líquido dinámico para el Medio Ambiente
NOTA: El protocolo anterior se utiliza para la incubación estática antes de una medición en el que el esferoide de células ha sido previamente incuba y luego se mantiene en su lugar en el capilar mediante la simple gravitación. No hay necesidad de nuevas FIJACIÓNsucesivamente. Sin embargo, para mediciones en donde los medios de comunicación que fluye de una incubación de dinámica y, por lo tanto, un entorno dinámico es deseable medir la cinética de absorción, se puede lograr este sub-protocolo. Los pasos 4.5 hasta 4.9 son fundamentales para evitar las burbujas de aire que llegan a la muestra.
- Llenar el capilar con FCS durante 30 min para apoyar la adhesión celular después de un esferoide de células a la superficie de vidrio interior.
- Deje que el recubrimiento FCS restante en el capilar empobrecido se seque por lo menos durante 12 horas.
- Introducir el esferoide de células al capilar recubierto FCS como se describe en el paso 3.2.
- Deje el capilar en el incubador a 5% de CO2 y 37 ° C durante 2-4 horas adicionales para causar la adhesión celular del esferoide.
- Configure la parte aflujo del sistema de microfluidos (ver Figura 2). Utilice una bomba peristáltica para llenar el aflujo de la tubería (diámetro interior: 0,89 mm) con medio de cultivo que contiene el colorante fluorescente, fármaco o agente.
- Connect la parte aflujo del sistema microfluídico a una trampa de burbujas (véase la Figura 2).
- En primer lugar sujetar el capilar sin burbujas a la tubería de aflujo y luego sujetar el otro lado del capilar a la tubería de drenaje.
- Sintonice la temperatura del líquido del baño de agua hasta el valor deseado (por ejemplo, 37 ° C).
- Ajustar la bomba peristáltica a la velocidad de la bomba deseada (por ejemplo, velocidad de flujo: 9 l / min; la velocidad de la bomba en el capilar: 25 mm / min).
- Recoger el líquido bombeado sea en un (configuración de bucle abierto) destinatario, alimentar de nuevo a su fuente (configuración de circuito cerrado) o alimentarlo directamente en el tubo de la bomba peristáltica (configuración de circuito cerrado apretado).
Figura 2. configuración de microfluidos (lazo abierto y apretado de circuito cerrado); incrustaciones de: Iluminación de un spheroid dentro de un micro-capilar mediante hoja de luz de microscopía de fluorescencia basada acoplado a un microscopio invertido.
5. Adquisición de datos y análisis
- Ajuste la potencia del láser y el tiempo de integración para la adquisición de imágenes.
- Tenga cuidado de que los parámetros definidos en el paso 5.1 no exceden los valores de dosis de luz sobre 50-100 J / cm 2 para las células nativas o 10-20 J / cm 2 para las células incubadas con un colorante fluorescente o transfectadas con un plásmido que codifica la proteína fluorescente a evitar la fototoxicidad (para detalles ver. Ref 12).
- Ajuste el incremento para el z-stack a Delta z = 5-10 micras que es preferible para el análisis de datos en 3 dimensiones como el grosor de lámina de luz es de aproximadamente 10 micras.
- Realizar mediciones de imágenes individuales o z-pilas por la variación del plano focal dentro del esferoide de células.
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Representative Results
Experimento 1: esferoides de células incubadas con un fármaco quimioterapéutico
Una tomografía z-stack de un esferoide de células previamente incubadas MCF-7 (8 M doxorrubicina, 6 horas) se representa en la figura 3. Proporciona información detallada acerca de la captación celular y la distribución de doxorrubicina 17 y su producto de degradación 18,19. Dentro de la capa celular externa de la doxorubicina fluorescente de color rojo esferoide se localiza principalmente en el núcleo, mientras que en las zonas interiores esferoide fluorescencia verde emitida por un producto de degradación se vuelve dominante en la membrana celular 19.
Figura 3. imágenes de fluorescencia de diferentes capas (Delta z = 10 micras) de un MCF-7 mamaria sph celular de carcinomaeroid se incubaron con doxorrubicina (8 M, 6 h) registrada por microscopía de iluminación plano único; Reconstrucción en 3 dimensiones utilizando z-proyección (excitación: λ = 470 nm; detección de fluorescencia: λ ≥ 515 nm; microscopio lente objetivo: 10X / 0.30 Plan de Neofluar).
La absorción del fármaco quimioterapéutico doxorubicina en células MCF-7 de mama humano esferoides celulares de cáncer nativos se representa en la figura 4 para una única capa de células seleccionadas por SPIM. Tras la aplicación de 2 M en medio de cultivo dentro del sistema de flujo de fluorescencia roja y verde de la doxorubicina y su aumento producto de degradación continua (imágenes y espectro representados).
Figura 4. curso Tiempo de la captación celular de doxorrubicina 2 Men medio de cultivo a través del sistema de microfluidos. Las imágenes de fluorescencia de una sola capa de un MCF-7 de células de carcinoma mamario esferoide registrado por microscopía de iluminación solo plano a una distancia de 80 m desde su borde con el espectro de emisión de fluorescencia adicional (excitación: λ = 470 nm; detección de fluorescencia: λ ≥ 515 nm ; microscopio lente objetivo: 10X / 0,3 Plan de Neofluar).
Experimento 2: Proceso de oxidación en esferoides que expresan un sensor redox
Mediciones SPIM de estados redox intracelulares pueden dar alguna información sobre las especies reactivas de oxígeno, por ejemplo, en los tumores. Para este propósito un esferoide de células de glioblastoma U251MG-L106 transfectadas permanentemente con el glutatión se utilizó sensible verde fluorescente sensor redox Grx1-roGFP2. La oxidación del glutatión fue inducida por la exposición a 50 mM de peróxido de hidrógeno (H 2 O 2) en solut sal ion (EBSS) a través del sistema de microfluidos y predominantemente ocurrieron en las capas de células exteriores de la esferoide.
Como se informó anteriormente 20 la absorción de H 2 O 2 resulta en una disminución de la intensidad de fluorescencia excitada a 470 nm, correspondiente a la forma reducida del sensor de redox. Al comienzo de la incubación H 2 O 2 afecta fuertemente a las capas de células exteriores (espesor: 50 micras) del esferoide y luego penetra más profundamente en la zona interior (diámetro: 150 micras) del esferoide con el aumento de tiempo de incubación que resulta en una degradación más lenta de intensidad de fluorescencia. El curso temporal de esta disminución se representa en la Figura 5, lo que demuestra la posibilidad de aplicación rápida fármaco combinado con la rápida detección por el sistema de SPIM 20.
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Figura 5 Evolución temporal de disminución de fluorescencia a 50 mM H 2 O 2 de incubación de un U251MG-L106 esferoides de células de glioblastoma transfectadas permanentemente con el glutatión sensor redox verde fluorescente sensible Grx1-roGFP2. La cinética de estado redox intracelular para las capas exteriores y el área interior de un esferoide de células se obtuvieron por los valores medios de intensidad de imágenes de fluorescencia grabadas por microscopía de iluminación plano único (de una sola capa del esferoide de células bajo un flujo).
Experimento 3: Iniciación y etiquetado de necrosis celular dentro de esferoides
Para iniciar la necrosis celular un esferoide de células de glioblastoma U251-MG-L106-Grx1-roGFP2 se incubó con rotenona 1 M durante 3 h. La rotenona agente neurotóxico es un inhibidor de la cadena de transporte de electrones mitocondrial y conduce a una pérdida de integridad de la membrana celular. Para Visualize el efecto necrótico, el esferoide se co-incubaron con el colorante fluorescente citotoxicidad etiquetado verde (1 l en un medio de 1 ml de cultivo, 3 h), que penetra en la célula dañada y se une al ADN en el núcleo de la célula (véase la figura 6A, C). Para referencia, una imagen de iluminación de campo brillante de todo el esferoide se muestra en la Figura 6B.
Figura 6: (A) Las imágenes de fluorescencia de diferentes capas (Delta z = 5 micras) de un U251-MG-L106-Grx1-roGFP2 esferoides de células de glioblastoma co-incubadas con rotenona (1 M, 3 h) y la citotoxicidad tinte verde (1 l en medio de cultivo de 1 ml, 3 h) registrada por microscopía de iluminación plano único (barra de escala 100 micras), (B) brillante fiimagen de fluorescencia de 3 dimensiones (excitación: λ = 470 nm; detección de fluorescencia: λ ≥ 515 nm; microscopio de lente de objetivo: 20X / 0,5 Plan de Neofluar) iluminación de campo de todo el esferoide, y (C) reconstruido.
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Discussion
El presente manuscrito describe una hoja de luz o microscopía de iluminación plano único (SPIM) del dispositivo que está optimizado para sistemas de células de 3 dimensiones, por ejemplo, esferoides tumorales multicelulares (MCT). Tres aplicaciones ejemplares incluyen (1) la absorción de un fármaco citostático y su conversión parcial a un producto de degradación (cuya contribución a la eficacia de la quimioterapia sigue siendo ser evaluado), (2) mediciones del estado redox mediante el uso de un sensor de glutatión codificada genéticamente en adición de un agente oxidante, y (3) la iniciación y el etiquetado de necrosis celular de la inhibición de la cadena respiratoria mitocondrial.
Las principales ventajas de este módulo SPIM en comparación con los sistemas existentes (por ejemplo, aquellos reportados en las Refs. 7, 8, 9, 14, 15) son que puede ser fácilmente adaptado a cualquier microscopio de campo amplio invertida, y que se encuentran en muestras pequeñas cámaras de medición (micro-capilares), que necesitan sólo pequeñas cantidades ocolorantes fluorescentes f, agentes farmacéuticos o medicamentos que deben aplicarse a diversos tipos de experimentos, minimizando así los costos, por ejemplo, para pruebas farmacéuticas. Esto es así, si un sistema de micro-fluidos, como se informó en este manuscrito, se utiliza. Sin embargo, se debe mencionar, que aunque para un bucle abierto caudales bajos de configuración son ventajosas para la detección de drogas rentable, velocidades de hasta 1440 l / min (correspondiente a velocidades de hasta 4000 mm / min) reveló a ser posible bajo las presentes condiciones experimentales sin desprendimiento de los esferoides del capilar. Para una configuración de circuito cerrado hermético se requiere un volumen de líquido total mínima de 200 a 300 l, independientemente de la velocidad de la bomba.
Cualquier fuente de luz que se puede enfocar a un punto de difracción limitada, por ejemplo, un diodo láser o láser, se puede utilizar para la iluminación. Aplicación de diversas fuentes de luz, sin embargo, requiere la corrección cromática, ya sea por teles adicionaleshacer frente sistemas colocados delante de las fuentes de luz individuales 20 o mediante el diseño de un sistema de iluminación acromático. Otro problema surge dispersión frontal pronunciado, que pueden ser no homogénea en la muestra, lo que provoca artefactos como rayas o sombras. Variación del ángulo de iluminación en un modo de oscilación 21 o específicos algoritmos de software 22, sin embargo, puede reducir los artefactos.
El presente sistema de iluminación consiste en una expansión de haz telecéntrico y centrándose por una lente cilíndrica de 50 mm de longitud focal y una abertura numérica A N = 0,08. De acuerdo con la fórmula d = λ / A N para la difracción Fraunhofer esto resulta en un espesor de aproximadamente 6 m de la lámina de luz (dependiendo de la longitud de onda λ de excitación), que corresponde aproximadamente al espesor de una capa de células y parece ser ideal para la observación de las capas individuales. Si una mayor resolución axial is se desea, la apertura numérica se puede aumentar mediante la inserción de un microscopio de lente objetivo adicional de apertura numérica moderado o alto en el rayo de iluminación con la hoja de luz que se centró en su plano de apertura. Esto da lugar a otra lámina de luz en el plano de la muestra, que, sin embargo, se hace girar 90 ° (una rotación de la lente cilíndrica 90 ° puede compensar esta rotación). Dado que las lentes de microscopio de larga distancia tienen aperturas numéricas de hasta aproximadamente 0,60, el espesor de la lámina de luz puede ser reducida a 1 micras o incluso menos, acercándose tanto, la resolución axial obtenido en microscopía confocal de barrido láser. Simultáneamente, la profundidad de campo que es proporcional a A N -2 se reduce desde aproximadamente 100 micras a menos de 2 m.
Una corrección de desplazamiento focal se utiliza para compensar el llamado efecto pecera debido a un desajuste del índice de refracción. El cambio del objetivo de microscopio lens a lo largo del eje óptico difiere del cambio de enfoque dentro de la muestra. Dependiendo de la relación de los índices de refracción entre el aire y el medio que rodea a la muestra de la altura del objeto aparece aseguró por un factor de más o menos 1,35 y conduce a una falta de coincidencia de elevación por el mismo factor entre el plano focal y el plano de iluminación en SPIM para la grabación z -stacks (para referencia véase la Figura 1B).
Esferoides tumorales multicelulares (MCT) son muestras más bien simétricas, que pueden ser iluminados desde cualquier dirección. Sin embargo, para muestras menos simétricas o de pequeños organismos iluminación desde diversos lados puede ser deseable. Por lo tanto, recientemente hemos desarrollado una configuración 23, donde se encuentran las muestras en un micro-capilar de forma cilíndrica (diámetro interior 400 m, diámetro exterior 550 micras) que se puede girar dentro del capilar rectangular (diámetro interior 600 m, espesor de pared 120 m), como se representa en ªe incrustaciones de la Figura 1B. Debido a acoplamiento óptico casi perfecta de la microscopia basado dos capilares de lámina de luz se puede combinar con la rotación de la muestra sin ninguna limitación.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este proyecto fue financiado por el Estado federado de Baden-Württemberg, así como por la Unión Europea, Europäischer Fonds für die Regionale Entwicklung. Los autores agradecen a Rainer Wittig (ILM Ulm) para proporcionar la línea celular U251-MG-L106-Grx1-roGFP2 y Claudia Hintze para la asistencia técnica en un crack.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microtiter plate | Orange Scientific | 4430100 | For cell spheroid growing |
| Agarose | Carl Roth GmbH | 3810.1 | For cell spheroid growing |
| MCF-7 cell line | CLS Cell Lines Service GmbH | 300273 | Cell line |
| U251-MG-L106 cell line | Cell line | ||
| DMEM | Biochrom AG (Merck Millipore) | FG0435 | Culture medium |
| DMEM/Ham's F-12 | Biochrom AG (Merck Millipore) | FG4815 | Culture medium |
| FCS | Biochrom AG (Merck Millipore) | S0615 | Cell culture supplement |
| Penicillin/streptomycin | Biochrom AG (Merck Millipore) | A 2213 | Antibiotics |
| Hygromycin B | PAA Laboratories | P02-015 | Antibiotic |
| EBSS | Sigma-Aldrich Inc. | E3024 | Cell culture supplement |
| Doxorubicin | Sigma-Aldrich Inc. | D1515 | Fluorescent dye (CAUTION: acute toxicity) |
| Green cytotoxicity dye | Promega GmbH | G8742 | CellTox - fluorescent cytotoxicity dye |
| Rotenone | Sigma-Aldrich Inc. | R8875 | Cellular inhibitor (CAUTION: acute toxicity) |
| Hydrogen peroxide (H2O2) | Sigma-Aldrich Inc. | 95302 | Reagent for oxidation (CAUTION: acute toxicity) |
| Capillary | VitroCom | 8260-050 | Sample preparation |
| Microscope | Carl Zeiss Jena | Axiovert 200M | |
| AxioCam MRc CCD-camera | Carl Zeiss MicroImaging GmbH | 426508-9901-000 | CCD-camera |
| AxioVision data aquisition software | Carl Zeiss MicroImaging GmbH | version 4.8.2. | |
| Laser diode | Pico Quant GmbH | LDH-P-C-470 | Used with driver PDL800-B |
| Peristaltic pump | Ismatec Labortechnik | MS-1 Reglo | Re-calibrated to reduce the minimum pump speed by 1/10 |
| Silicone tubes | IDEX Health & Science GmbH | TYGON R3607 |
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