Summary
Un modulo per singolo piano di illuminazione microscopia (SPIM) è descritto, che si adatta facilmente ad un microscopio a largo campo invertito e ottimizzato per colture cellulari 3-dimensionale. Il campione si trova all'interno di un capillare rettangolare, e tramite un sistema di microfluidica coloranti fluorescenti, agenti farmaceutici o farmaci può essere applicato in piccole quantità.
Abstract
Un modulo per foglio leggero o solo piano di illuminazione microscopia (SPIM) è descritto, che si adatta facilmente ad un microscopio a largo campo invertito e ottimizzato per colture cellulari in 3 dimensioni, ad esempio, sferoidi tumorali multicellulari (MCTS). Il modulo SPIM eccitazione forme e devia la luce in modo tale che il campione è illuminato da un foglio leggero perpendicolare al percorso rilevamento del microscopio. Il sistema è caratterizzato dall'uso di un capillare rettangolare per la tenuta (e in una versione avanzata anche da un approccio micro-capillare per ruotare) i campioni, regolando sincrono del foglio leggero illuminante e la lente obiettivo utilizzato per la rilevazione della fluorescenza e da adattamento di un sistema microfluidica per l'applicazione di coloranti fluorescenti, agenti farmaceutici o farmaci in piccole quantità. Un protocollo per lavorare con questo sistema è dato, e alcuni dettagli tecnici sono riportati. Risultati rappresentativi includono (1) misure del pianoprendere di un farmaco citostatico (doxorubicina) e la sua conversione parziale di un prodotto di degradazione, (2) misure redox mediante l'uso di un sensore di glutatione geneticamente codificato dopo l'aggiunta di un agente ossidante, e (3) l'inizio e l'etichettatura di necrosi cellulare su inibizione di la catena respiratoria mitocondriale. Differenze e vantaggi del presente modulo SPIM in confronto con i sistemi esistenti sono discussi.
Introduction
Oltre ai metodi ben consolidati (confocale o multi-fotone microscopia a scansione laser 1-4, strutturato illuminazione microscopia 5,6) foglio di luce o di solo piano di microscopia illuminazione (SPIM) ha dimostrato di essere un metodo valido di imaging 3D 7,8, 9. Di particolare interesse è la sua applicazione di colture cellulari 3-dimensionale, ad esempio, sferoidi tumorali multicellulari (MCTS), che vengono utilizzati sempre più per la ricerca di scoperta della droga 10,11. Inoltre, SPIM è un metodo preferenziale in cui anche in caso di esposizione a lungo termine o misurazioni ripetute dosi di scarsa luminosità sono tenuti a mantenere la vitalità del campione, dal momento che per la misura di ogni piano del campione solo questo piano è esposto alla luce. Questo è in contrasto con altre tecniche di microscopia, dove per la rilevazione di ciascun piano focale è illuminato l'intero campione, in modo che dopo la registrazione di numerosi piani somme dose di luce e può danneggiare il campione 12. Microscopia foglio leggero o SPIM si basa sulla illuminazione del campione in direzione perpendicolare al percorso osservazione mediante l'uso di una lente cilindrica o effettuando la scansione del fascio laser eccitante (per una rassegna vedi cod. 8). Questo spesso richiede camere di campioni speciali 13,14 o matrici, ad esempio, agarosio 7,15, realizzato in microscopi speciali ad alto costo. In alternativa a tali sistemi è stato sviluppato un semplice dispositivo di illuminazione comparabilmente per SPIM e adattato ad un microscopio invertito convenzionale 16 (vedi Figura 1). È costituita da un fascio laser espanso ad un diametro di 8 mm e focalizzato da una lente cilindrica (lunghezza focale: 50 mm, apertura numerica: 0.08) per un foglio leggero spessore di 6-10 micron su una profondità di campo di circa 100 micron . I campioni sono situati in un capillare rettangolare di 600-900 micron di diametro interno posizionato davanti al microscopio len obiettivos per il rilevamento della fluorescenza. Queste caratteristiche principali sono attualmente completate e ottimizzati mediante l'uso di approcci micro-capillari avanzata per la tenuta e per ruotare i campioni, la regolazione sincrona del foglio leggero illuminante (in direzione assiale) e la lente obiettivo utilizzati per il rilevamento di fluorescenza (cammino ottico identico lunghezze di spostamento richiedono una correzione del trascinamento meccanico), e l'adattamento di un sistema microfluidica per l'applicazione di coloranti fluorescenti, agenti farmaceutici o farmaci, minimizzando così i quantitativi e le spese richieste.
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Protocol
1 Cella Coltivazione Spheroid e incubazione
- Esperimento 1: Cellulari sferoidi incubate con un farmaco chemioterapico
- Preparare agarosio 1,5% in terreno di coltura con l'aggiunta di 0,45 g di agarosio a 30 ml di terreno di coltura (sufficiente per 6 piastre).
- Scaldare la miscela dal punto 1.1.1 ad almeno 80 ° C agitando di tanto in tanto.
- Riempire 50 ml di miscela riscaldata dal punto 1.1.2 in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti e lasciare solidificare in 1-2 ore. Conservare le piastre chiuse e coperte in frigorifero a 5 ° C fino al momento dell'uso.
- Seed circa 150 MCF-7 cellule di cancro al seno in ciascun pozzetto della piastra preparata a 96 pozzetti in Modified mezzo di Eagle Dulbecco (DMEM) con mezzo di F-12 cultura del prosciutto supplementato con 10% di siero fetale bovino (FCS) e 1% di penicillina / streptomicina .
- Crescere sferoidi per 5-7 giorni fino ad un diametro di circa 200-300 micron in un incubatore al 5% di CO 2 e 3776; C.
- Incubare le sferoidi di cellule con antracicline doxorubicina cloridrato antibiotico per 6 ore ad una concentrazione compresa tra 2 e 8 mM mM (in terreno di coltura) in un incubatore al 5% di CO 2 e 37 ° C.
- Lavare gli sferoidi cellulari con terreno di coltura o di soluzione salina bilanciata di Earle (EBSS) prima di microscopia.
- Esperimento 2: processo di ossidazione in sferoidi che esprimono un sensore di redox
- Seed circa 400 cellule di glioblastoma U251-MG-L106 trasfettate stabilmente con il glutatione sensore redox verde fluorescente sensibile GRX1-roGFP2 in pozzi gel-rivestito agarosio (procedura descritta nei passaggi 1.1.1-1.1.3) di una piastra a 96 pozzetti in DMEM mezzo di coltura supplementato con 10% FCS, 1% di penicillina / streptomicina e igromicina B (150 mcg / ml).
- Crescere sferoidi per 5-7 giorni fino ad un diametro di circa 200-300 micron in un incubatore al 5% di CO 2 e 37 ° C.
- Aggiungere 10 & #181, l di soluzione di perossido di idrogeno (purum pa, ≥ 30%) per 990 ml di acqua bi-distillata per creare una soluzione madre di 100 mM per essere utilizzato entro le 12 ore.
- Diluire la soluzione stock a partire dal punto 1.2.3 a 50 micron di EBSS destra prima dell'esperimento.
- Incubare le sferoidi di cellule attraverso il sistema di microfluidica durante la misurazione con acqua ossigenata 50 micron di EBSS per l'ossidazione del sensore di redox.
- Esperimento 3: Iniziazione e l'etichettatura di necrosi cellulare all'interno di sferoidi
- Seed circa 400 cellule (ad esempio, U251-MG-L106-GRX1-roGFP2 cellule di glioblastoma) in pozzetti di gel-rivestito agarosio (procedura descritta nei passaggi 1.1.1-1.1.3) di una piastra a 96 pozzetti in terreno di coltura DMEM supplementato con 10% FCS, 1% di penicillina / streptomicina e igromicina B (150 mg / ml).
- Crescere sferoidi per 5-7 giorni fino ad un diametro di circa 200-300 micron in un incubatore al 5% di CO 2 e 37 ° C.
- Incubare la cellasferoidi con l'mitocondriale di trasporto degli elettroni inibitore rotenone per 3 ore ad una concentrazione di 1 mM in mezzo di coltura per indurre necrosi cellulare. Inoltre, co-incubare con una citotossicità colorante verde per 3 ore ad una concentrazione di 1 ml in 1 ml di terreno di coltura per etichettare le cellule necrotiche.
- Lavare gli sferoidi di cellule con terreno di coltura o EBSS prima di microscopia.
2 Regolazione foglio leggero
NOTA: Per ottenere i migliori risultati che è necessario garantire che la vita fascio del foglio luce è nel piano di messa a fuoco della lente dell'obiettivo. La posizione della cintura fascio può essere allineato soltanto in base al foglio leggero in posizione verticale rispetto al capillare (vedi i punti 2,5-2,8).
- Utilizzare un microscopio invertito e montare il modulo di eccitazione SPIM, come descritto in rif. 16, alla piastra di base della tabella di posizionamento (vedere Figura 1A).
- Dotare il microscopio con un 10X / o 20X 0,3 / 0,5 microscopio lente obiettivo e un appropriato filtro passa-lunga (ad esempio, λ ≥ 515 nm) nel percorso rilevamento del microscopio.
- Montare una telecamera integrazione alla porta di rivelazione del microscopio.
- Utilizzare un fascio collimato parallelo di un laser o un diodo laser con una lunghezza d'onda di eccitazione di 470 nm e preferenzialmente applicarlo al modulo SPIM.
- Ruotare la lente cilindrica di 90 gradi, che trasferisce il foglio leggero in una posizione verticale per una regolazione assiale del fascio vita del foglio leggero.
- Inserire un capillare contenente un liquido con un colorante fluorescente nel portacampioni.
- Fissare il supporto del campione con il capillare al tavolo di posizionamento del microscopio e allineare la posizione del capillare tale che sia centrato e la vita fascio del foglio leggero è a fuoco.
- Regolare la vita fascio tramite la variazione della posizione assiale della lente cilindrica stessa. Tornare indietro l'obiettivo dopo annuncioalcuna regolazione.
3. cellulare Spheroid Applicazione e sincronizzazione feed Microscopio
- Posizionare le sferoidi di cellule separatamente o in gruppi all'interno di borosilicato capillari di vetro rettangolare 16 con una sezione trasversale interna di 600 micron x 600 micron ed uno spessore di 120 micron. Due tecniche per l'applicazione di uno sferoide cellule hanno dimostrato di avere successo.
- Prendete il capillare vuoto in posizione verticale con il pollice e il dito medio e sigillare l'apertura superiore con il dito indice. Portare l'apertura inferiore vicino al sferoide cellulare nel suo liquido circostante (EBSS o terreno di coltura). Rilasciare il dito indice dall'apertura superiore. Liquido con la sferoide cellule in esso sarà messo a bagno in subito da forze capillari. Regolare la posizione dello sferoide all'interno del capillare riempito da gravitazione nella rispettiva posizione verticale del capillare.
- In alternativa, applicare il sferoide cella alla capillare mediante pipettaggio. Fate attenzione that l'apertura della punta della pipetta è, da un lato, abbastanza grande per la dimensione sferoide e, dall'altro, minore o uguale di dimensioni al diametro interno del capillare.
- Posizionare il capillare con la sferoide in in un supporto speciale campione per la microscopia.
- Fissare il supporto del campione con il capillare al tavolo di posizionamento del microscopio e allineare la posizione dello sferoide cella tale che sia centrata e focalizzata.
- Impostare la corrispondenza tra il foglio leggero ed il piano focale del microscopio lente obiettivo nel percorso rilevamento regolando la posizione dello specchio di riflessione e la lente cilindrica (vedi vite di regolazione nella Figura 1B).
- Regolare la vite micrometrica (vedi Figura 1B) secondo gli indici di rifrazione e l'apertura numerica della lente dell'obiettivo per compensare l'effetto di acquario.
NOTA: diversi indici di rifrazione del campione e dei media t circostantiegli lente piombo obiettivo di una differenza tra lo spostamento della lente dell'obiettivo e lo spostamento del piano focale. Poiché il foglio leggero viene spostato dalla torretta obiettivo, la mancata corrispondenza tra lo spostamento del foglio leggero (corrispondente allo spostamento della lente dell'obiettivo) e lo spostamento del piano focale è compensata da un braccio di leva (vedere Figura 1B). La vite micrometrica viene utilizzata per adattare la distanza tra la parte superiore e il perno inferiore per regolare lo spostamento del foglio leggero secondo l'apertura numerica della lente obiettivo e gli indici di rifrazione.
Figura 1 (A) Immagine del singolo modulo illuminazione aereo montato sul basamento del tavolo di posizionamento di un microscopio invertito, (B) la configurazione del singolo piano di illuminazionemodulo e la sincronizzazione dei mangimi microscopio per compensare il sollevamento-mancata corrispondenza (effetto acquario) tra il piano focale e il piano di illuminazione. Az o indica lo spostamento della lente obiettivo e Az f lo spostamento del piano focale e il foglio leggero. L'intarsio mostra sezioni di sferoidali contenenti capillari. A sinistra: capillare rettangolare con diametro interno di 600 micron (parete 120 micron). A destra: il programma di installazione utilizzato per la rotazione. Una capillare interno rotondo (diametro interno 400 micron, diametro esterno 550 micron) viene ruotato all'interno del capillare rettangolare esterno. Lo spazio tra i due capillari è riempito con un liquido di immersione.
4 Misura in liquido dinamico Ambiente
NOTA: Il precedente protocollo viene utilizzato per l'incubazione statica prima di una misurazione in cui il sferoide cella è già stato incubato e poi tenuto in posto nel capillare per semplice gravità. Non vi è alcuna necessità di ulteriori fixatisu. Tuttavia, per misure in flusso multimediale in cui una incubazione dinamico e, quindi, un ambiente dinamico è auspicabile per misurare la cinetica di assorbimento, si può raggiungere questo sub-protocollo. I passaggi 4,5-4,9 sono fondamentali per evitare bolle d'aria che raggiungono il campione.
- Riempire il capillare con FCS per 30 min a sostenere l'adesione successiva cellulare di uno sferoide cella alla superficie del vetro interno.
- Lasciate il rivestimento FCS rimanente nel capillare impoverito asciugare per almeno 12 ore.
- Introdurre il sferoide cella alla capillare rivestito FCS come descritto al punto 3.2.
- Lasciare il capillare in incubatore al 5% di CO 2 e 37 ° C per ulteriori 2-4 ore a causare adesione cellulare della sferoide.
- Impostare la parte afflusso del sistema microfluidica (vedere Figura 2). Utilizzare una pompa peristaltica per riempire l'afflusso del tubo (diametro interno: 0,89 millimetri) con mezzo di coltura contenente il colorante fluorescente, droga o l'agente.
- Connect parte afflusso del sistema microfluidica ad un gorgogliatore (vedi figura 2).
- Innanzitutto serrare il capillare senza bolle al tubo afflusso e quindi serrare l'altro lato del capillare al tubo di scarico.
- Tune la temperatura del liquido della vasca dell'acqua al valore desiderato (ad esempio, 37 ° C).
- Regolare la pompa peristaltica alla velocità della pompa desiderata (ad esempio, portata: 9 ml / min; velocità pompa nel capillare: 25 mm / min).
- Raccogliere il liquido pompato o in un recipiente (configurazione ad anello aperto), dargli da mangiare alla sua fonte (configurazione a circuito chiuso) o alimentarlo direttamente nel tubo della pompa peristaltica (configurazione a circuito chiuso a tenuta).
Figura 2 impostazione Microfluidic (anello aperto e stretto a circuito chiuso); intarsio: Illuminazione di un spheroid all'interno di un micro-capillare mediante foglio leggero microscopia a fluorescenza basato accoppiato ad un microscopio invertito.
5. acquisizione dati e analisi
- Impostare la potenza del laser e il tempo di integrazione per l'acquisizione delle immagini.
- Fare attenzione che i parametri definiti al punto 5.1 non superano i valori di dose di luce circa 50-100 J / cm 2 per le cellule native o 10-20 J / cm 2 per le cellule incubate con un colorante fluorescente o transfettate con un plasmide codifica proteina fluorescente a evitare di fototossicità (per i dettagli vedi Rif. 12).
- Impostare l'incremento per la z-stack per Az = 5-10 micron, che è preferibile per l'analisi dei dati 3-dimensionale, come lo spessore della lamiera della luce è di circa 10 micron.
- Eseguire misurazioni di singole immagini o z-stack dalla variazione del piano focale all'interno della sferoide cellulare.
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Representative Results
Esperimento 1: Cellulari sferoidi incubate con un farmaco chemioterapico
Una scansione z-stack di una precedentemente incubate MCF-7 sferoidale celle (8 micron doxorubicina, 6 ore) è illustrato in Figura 3. Esso fornisce informazioni dettagliate circa l'assorbimento cellulare e la distribuzione di doxorubicina 17 e del suo prodotto di degradazione 18,19. All'interno della cella strato esterno della doxorubicina fluorescente rossa sferoide è localizzato principalmente nel nucleo, mentre nelle zone interne sferoidali fluorescenza verde emessa da un prodotto di degradazione diventa dominante nella membrana cellulare 19.
Figura 3. immagini di fluorescenza provenienti da diversi strati (Az = 10 micron) di una MCF-7 mammario sph cellule di carcinomaeroid incubate con doxorubicina (8 micron, 6 ore) registrati dal singolo microscopio illuminazione piano; Ricostruzione 3-dimensionale con z-proiezione (di eccitazione: λ = 470 nm; rivelatore a fluorescenza: λ ≥ 515 nm; microscopio lente dell'obiettivo: 10X / 0,30 Piano Neofluar).
L'assorbimento del farmaco chemioterapico doxorubicina in native MCF-7 del seno umano sferoidi di cellule di cancro è rappresentato in Figura 4 per un singolo strato di cellule selezionate da SPIM. Su richiesta di 2 micron di terreno di coltura all'interno del sistema di flusso fluorescenza rossa e verde della doxorubicina e del suo prodotto di degradazione in continuo aumento (immagini e spettro raffigurati).
Figura corso 4 Tempo di assorbimento cellulare di 2 mM doxorubicinanel mezzo di coltura mediante il sistema microfluidica. Immagini di fluorescenza di un singolo strato di una MCF-7 sferoide cellule di carcinoma mammario registrato dal singolo microscopio illuminazione aereo a una distanza di 80 micron dal suo bordo con spettro di emissione di fluorescenza aggiuntivo (eccitazione: λ = 470 nm; rivelatore a fluorescenza: λ ≥ 515 nm ; Microscopio dell'obiettivo: 10X / 0.3 Piano Neofluar).
Esperimento 2: processo di ossidazione in sferoidi che esprimono un sensore di redox
Misurazioni SPIM di stati redox intracellulari possono dare alcune informazioni sulle specie reattive dell'ossigeno, ad esempio, nei tumori. A questo scopo uno sferoide di cellule di glioblastoma U251MG-L106 trasfettate stabilmente con il glutatione sensibile sensore di redox verde fluorescente GRX1-roGFP2 è stato utilizzato. Ossidazione del glutatione è stata indotta da esposizione a 50 mM di perossido di idrogeno (H 2 O 2) in soluz sale ion (EBSS) tramite il sistema di microfluidica e soprattutto si sono verificati negli strati cellulari esterni della sferoide.
Come riportato in precedenza 20 l'assorbimento di H 2 O 2 risultati in una diminuzione dell'intensità di fluorescenza eccitata a 470 nm, corrispondente alla forma ridotta del sensore redox. All'inizio di incubazione H 2 O 2 influisce fortemente gli strati cellulari esterni (spessore 50 micron) dello sferoide e poi penetra più a fondo nella zona interna (diametro: 150 pm) dello sferoide all'aumentare del tempo di incubazione con conseguente degrado lento di intensità di fluorescenza. La durata di questa diminuzione è mostrata in Figura 5, dimostrando la possibilità di applicazione rapida farmaco combinato con rilevazione rapida dal sistema SPIM 20.
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Figura 5 Naturalmente il tempo di diminuzione della fluorescenza a 50 mM H 2 O 2 incubazione di un U251MG-L106 sferoide glioblastoma cellule trasfettate stabilmente con il glutatione sensore redox verde fluorescente sensibile GRX1-roGFP2. La cinetica di stato redox intracellulari per gli strati esterni e la zona interna di uno sferoide cella sono state ottenute da valori di intensità media di fluorescenza immagini registrate da sola microscopia illuminazione aereo (singolo strato dello sferoide cella sotto flusso).
Esperimento 3: Iniziazione e l'etichettatura di necrosi cellulare all'interno di sferoidi
Per avviare una necrosi cellulare U251-MG-L106-GRX1-roGFP2 sferoide cellule di glioblastoma è stata incubata con 1 microM rotenone per 3 ore. Il rotenone agente neurotossico è un inibitore della catena di trasporto degli elettroni mitocondriale e porta ad una perdita di integrità della membrana cellulare. Per VisuaLize l'effetto necrotico, lo sferoide è stato co-incubata con l'fluorescente citotossicità di etichettatura colorante verde (1 ml in 1 ml di terreno di coltura, 3 ore), che penetra nella cellula danneggiata e si lega al DNA nel nucleo della cellula (vedi Figura 6A, C). Per riferimento, un'immagine luminosa illuminazione campo di tutta sferoide è mostrato in Figura 6B.
Figura 6. (A) immagini di fluorescenza provenienti da diversi strati (Az = 5 micron) di un U251-MG-L106-GRX1-roGFP2 sferoide cellule di glioblastoma co-incubate con rotenone (1 mM, 3 ore) e verde citotossicità colorante (1 ml in mezzo di coltura 1ml, 3 ore) registrati dal singolo microscopio illuminazione piano (barra della scala 100 micron), (B) fi luminosoilluminazione campo di tutta la sferoide, e (C) ricostruito l'immagine di fluorescenza a 3 dimensioni (di eccitazione: λ = 470 nm; rivelatore a fluorescenza: λ ≥ 515 nm; microscopio lente dell'obiettivo: 20X / 0.5 Piano Neofluar).
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Discussion
Il presente manoscritto descrive un foglio leggero o singola microscopia illuminazione piano (SPIM) dispositivo che è ottimizzato per sistemi cellulari 3-dimensionale, ad esempio, sferoidi tumorali multicellulari (MCTS). Tre applicazioni esemplari sono (1) l'assorbimento di un farmaco citostatico e la sua conversione parziale di un prodotto di degradazione (il cui contributo all'efficacia chemioterapici rimane ancora da valutare), (2) le misurazioni dello stato redox mediante l'uso di un sensore di glutatione geneticamente codificato su aggiunta di un agente ossidante, e (3) innesco e l'etichettatura di necrosi cellulare dopo inibizione della catena respiratoria mitocondriale.
I principali vantaggi di questo modulo SPIM in confronto con i sistemi esistenti (per esempio, quelle presentate nel Refs. 7, 8, 9, 14, 15) sono che può essere facilmente adattato a qualsiasi microscopio largo campo invertito, e che i campioni sono situati in piccole camere di misura (micro-capillari), che richiedono solo piccole quantità ocoloranti fluorescenti f, agenti farmaceutici o farmaci da applicare per i vari tipi di esperimenti, riducendo al minimo i costi, ad esempio, per i test farmaceutici. Questo vale pure, se un sistema di micro-fluidico, come riportato in questo manoscritto, viene utilizzato. Tuttavia, va detto, che anche se per un open-loop di installazione basse portate sono vantaggiosi per lo screening di farmaci di costo-efficiente, i tassi fino a 1.440 ml / min (corrispondenti a velocità fino a 4.000 mm / min) ha rivelato di essere possibile in le attuali condizioni sperimentali senza distacco delle sferoidi dal capillare. Per una configurazione ad anello chiuso a tenuta è necessario un volume di liquido totale minimo di 200-300 ml, indipendentemente dalla velocità della pompa.
Qualsiasi sorgente di luce che può essere concentrata in un punto di diffrazione limitata, ad esempio, un laser o laser a diodi, può essere utilizzato per l'illuminazione. Applicazione delle varie sorgenti luminose, tuttavia, richiede la correzione cromatica, sia da televisioni supplementarigestire sistemi posti davanti singole sorgenti luminose 20 o progettando un sistema di illuminazione acromatico. Un problema di ulteriori risultati di forward scattering pronunciato, che può essere non omogenea sul campione, causando artefatti come strisce o ombre. Variazione dell'angolo di illuminazione in una modalità di oscillazione di 21 o specifici algoritmi software 22, tuttavia, può ridurre questi artefatti.
L'attuale sistema di illuminazione consiste di una espansione fascio telecentrico e focalizzazione da una lente cilindrica di 50 mm di lunghezza focale e una apertura numerica a n = 0,08. Secondo la formula d = λ / N per diffrazione di Fraunhofer questo si traduce in uno spessore di circa 6 micron del foglio leggero (a seconda della lunghezza d'onda di eccitazione λ), che corrisponde approssimativamente allo spessore di uno strato di cellule e sembra essere ideale per l'osservazione dei singoli strati. Se una maggiore risoluzione assiale is desiderato, l'apertura numerica può essere aumentata con l'inserimento di un ulteriore microscopio lente obiettivo di apertura numerica moderato o alto nel raggio di illuminazione con il foglio leggero essendo concentrata nel suo piano di apertura. Ciò si traduce in un altro foglio leggero nel piano del campione, che, però, viene ruotato di 90 ° (una rotazione della lente cilindrica di 90 ° può compensare questa rotazione). Poiché lenti microscopio lunga distanza hanno aperture numeriche fino a circa 0,60, lo spessore del foglio leggero può essere ridotta a 1 micron o anche meno, avvicinandosi così la risoluzione assiale ottenuto nel microscopio confocale a scansione laser. Contemporaneamente la profondità di campo, che è proporzionale alla A N -2 viene ridotta da circa 100 micron a meno di 2 micron.
Una correzione spostamento focale viene utilizzato per compensare il cosiddetto effetto fishtank causa di una mancata corrispondenza di indice di rifrazione. Lo spostamento dell'obiettivo microscopio lens lungo l'asse ottico differisce dal cambiamento di messa a fuoco all'interno del campione. A seconda del rapporto tra gli indici di rifrazione tra l'aria e il mezzo circostante il campione l'altezza dell'oggetto appare conquistato per un fattore di circa 1,35 e porta ad una mancata corrispondenza sollevamento dello stesso fattore tra il piano focale e il piano di illuminazione a SPIM per la registrazione z -stacks (per riferimento vedi Figura 1B).
Sferoidi tumorali multi-cellulari (MCTS) sono esempi piuttosto simmetriche, che possono essere illuminati da ogni direzione. Tuttavia, per i campioni meno simmetriche o piccoli organismi illuminazione da vari lati può essere desiderabile. Pertanto, abbiamo recentemente sviluppato un setup 23, in cui i campioni si trovano in un micro-capillare di forma cilindrica (diametro interno 400 micron, diametro esterno 550 micron), che può essere ruotato all'interno del capillare rettangolare (diametro interno 600 micron, spessore della parete 120 micron), come rappresentato in the intarsio di Figura 1B. A causa di accoppiamento ottico quasi perfetta della microscopia basato due capillari foglio leggero può essere combinata con la rotazione del campione, senza alcuna limitazione.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo progetto è stato finanziato dal Land Baden-Württemberg, nonché dall'Unione Europea, Europäischer Fonds für die Entwicklung Regionale. Gli autori ringraziano Rainer Wittig (ILM Ulm) per fornire la linea cellulare U251-MG-L106-GRX1-roGFP2 e Claudia Hintze per l'assistenza tecnica abile.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microtiter plate | Orange Scientific | 4430100 | For cell spheroid growing |
| Agarose | Carl Roth GmbH | 3810.1 | For cell spheroid growing |
| MCF-7 cell line | CLS Cell Lines Service GmbH | 300273 | Cell line |
| U251-MG-L106 cell line | Cell line | ||
| DMEM | Biochrom AG (Merck Millipore) | FG0435 | Culture medium |
| DMEM/Ham's F-12 | Biochrom AG (Merck Millipore) | FG4815 | Culture medium |
| FCS | Biochrom AG (Merck Millipore) | S0615 | Cell culture supplement |
| Penicillin/streptomycin | Biochrom AG (Merck Millipore) | A 2213 | Antibiotics |
| Hygromycin B | PAA Laboratories | P02-015 | Antibiotic |
| EBSS | Sigma-Aldrich Inc. | E3024 | Cell culture supplement |
| Doxorubicin | Sigma-Aldrich Inc. | D1515 | Fluorescent dye (CAUTION: acute toxicity) |
| Green cytotoxicity dye | Promega GmbH | G8742 | CellTox - fluorescent cytotoxicity dye |
| Rotenone | Sigma-Aldrich Inc. | R8875 | Cellular inhibitor (CAUTION: acute toxicity) |
| Hydrogen peroxide (H2O2) | Sigma-Aldrich Inc. | 95302 | Reagent for oxidation (CAUTION: acute toxicity) |
| Capillary | VitroCom | 8260-050 | Sample preparation |
| Microscope | Carl Zeiss Jena | Axiovert 200M | |
| AxioCam MRc CCD-camera | Carl Zeiss MicroImaging GmbH | 426508-9901-000 | CCD-camera |
| AxioVision data aquisition software | Carl Zeiss MicroImaging GmbH | version 4.8.2. | |
| Laser diode | Pico Quant GmbH | LDH-P-C-470 | Used with driver PDL800-B |
| Peristaltic pump | Ismatec Labortechnik | MS-1 Reglo | Re-calibrated to reduce the minimum pump speed by 1/10 |
| Silicone tubes | IDEX Health & Science GmbH | TYGON R3607 |
References
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