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Haut différenciation de l'efficacité de pluripotentes humaines des cellules souches à des cardiomyocytes et caractérisation par cytométrie en flux

Published: September 23, 2014 doi: 10.3791/52010
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1, 3, 2, 4,5, 1,6
1Department of Biochemistry, Medical College of Wisconsin, 2Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, 3Department of Anesthesiology, Medical College of Wisconsin, 4Stem Cell and Regenerative Medicine Consortium, LKS Faculty of Medicine, Hong Kong University, 5Division of Cardiology, Johns Hopkins University School of Medicine, 6Cardiovascular Research Center, Biotechnology and Bioengineering Center, Medical College of Wisconsin
* These authors contributed equally

Summary

L'article décrit la méthodologie détaillée pour différencier efficacement les cellules souches pluripotentes humaines dans les cardiomyocytes en modulant de manière sélective la voie Wnt, suivie d'une analyse par cytométrie en flux des marqueurs de référence pour évaluer l'homogénéité et l'identité de la population.

Abstract

Il ya un besoin urgent de développer des approches pour réparer le cœur endommagé, la découverte de nouveaux médicaments thérapeutiques qui n'ont pas d'effets toxiques sur le cœur, et l'amélioration des stratégies de modéliser avec précision les maladies cardiaques. Le potentiel de l'exploitation induite par les cellules souches pluripotentes (hiPSC) la technologie de l'humain pour générer muscle cardiaque "dans un plat" pour ces applications continue de susciter un grand enthousiasme. Au cours des dernières années, la capacité de générer efficacement des cellules cardiomyogéniques à partir de cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) s'est grandement améliorée, nous offrant de nouvelles possibilités pour modéliser un stade très précoce du développement cardiaque humaine pas accessibles autrement. Contrairement à de nombreux procédés antérieurs, le protocole de différenciation des cardiomyocytes décrit ici ne nécessite pas l'agrégation cellulaire ou l'addition d'activine A ou BMP4 et génère robuste des cultures de cellules qui sont hautement positives pour la troponine I cardiaque et T (TNNI3, TNNT2), iroquois- protéine à homéodomaine de classeIRX-4 (Irx4), la myosine réglementaire chaîne légère 2, isoforme ventriculaire / du muscle cardiaque (MLC2v) et la myosine réglementaire chaîne légère 2, isoforme auriculaire (MLC2a) par jour 10 dans l'ensemble cellule souches embryonnaires humaines (CSEh) et les lignes hiPSC testé pour jour. Les cellules peuvent être passées et entretenus pendant plus de 90 jours de culture. La stratégie est techniquement simple à mettre en oeuvre et économique. Caractérisation des cardiomyocytes dérivés de cellules pluripotentes comprennent souvent l'analyse de marqueurs de référence, à la fois au niveau de l'ARNm et des protéines. Pour l'analyse des protéines, la cytométrie de flux est un puissant outil d'analyse pour l'évaluation de la qualité des cellules en culture et la détermination de la sous-population homogène. Cependant, la variation technique dans la préparation de l'échantillon peut affecter considérablement la qualité de cytométrie de flux de données. Ainsi, la standardisation des protocoles de coloration devrait faciliter les comparaisons entre les différentes stratégies de différenciation. En conséquence, optimisé protocoles de coloration pour l'analyse de Irx4, MLC2v, MLC2a, TNNI3, et TNNT2 par cytométrie de flux sont décrits.

Introduction

La génération de cardiomyocytes de hPSCs, y compris les CSEh et hiPSC, peut fonctionner comme un modèle in vitro de processus de développement cardiaques humaines très tôt, donnant un aperçu des étapes pas autrement accessibles pour des études mécanistiques. Ce système de modèle offre des opportunités uniques pour étudier les mécanismes moléculaires qui contrôlent l'engagement de la lignée cardiaque et la spécification du destin cellulaire. Au cours des dernières années, la capacité à générer de manière efficace à partir de cellules cardiomyogéniques hPSCs a grandement amélioré 1-15. Cependant, parmi les protocoles il existe une variation de la ligne de cellule par rapport à l'efficacité dans la production de cellules et cardiomyogéniques synchronisation à laquelle les cellules expriment des marqueurs spécifiques de la chambre (par exemple, le ventricule et oreillettes). Idéalement, pour des applications futures de ce système modèle, les populations plus homogènes de cellules fonctionnellement définies sont souhaitées. Contrairement aux procédés précédents, le protocole de différenciation des cardiomyocytes décrit ici ne nécessite pas CEagrégation ll ou l'ajout d'activine A ou protéine morphogénétique osseuse 4 (BMP4) et robuste génère cultures très positif pour TNNI3, TNNT2, Irx4, MLC2v, et MLC2a par jour 10 cellules dans toutes les lignées de CSEh et hiPSC testés à ce jour. La stratégie est techniquement simple à mettre en œuvre, en particulier par rapport à des cultures tridimensionnelles, la culture de masse, ou des stratégies fondées corps embryoïdes 4-9, et a récemment été définie dans une étude qui décrit une petite molécule à une toxicité sélective pour hPSCs (Boheler et al. ) 65. Caractéristiques de ce protocole comprennent la différenciation des hPSCs en culture monocouche à l'aide d'une seule couche d'une matrice qualifié CSEh (Matrigel), milieux entièrement définis à l'aide de petites molécules pour moduler la signalisation Wnt (semblable, mais distinct de 1,2,7,13), et flux optimisé cytométrie méthodes de coloration pour l'évaluation de l'efficacité de la différenciation et de l'identité de la cellule. En résumé, les avantages de ce protocole par rapport aux rapports précédents comprennent son coût effectivEness, reproductibilité, et sa grande efficacité pour générer des cardiomyocytes entre plusieurs lignes HPSC, y compris les lignées de CSEh et hiPSC.

La cytométrie en flux est un outil d'analyse puissant pour évaluer la qualité des cellules en culture et la détermination de la sous-population homogénéité, et avec un design expérimental approprié, peut fournir des mesures quantitatives. Comme pour toutes les stratégies à base d'anticorps, l'interprétation exacte des résultats expérimentaux nécessite que les éléments de la conception de l'essai, y compris la concentration d'anticorps et de la fixation des conditions de perméabilisation (lorsque ciblant des antigènes intracellulaires) sont soigneusement testés pour chaque anticorps comme des conditions sous-optimales affectent de manière significative l'efficacité de l'anticorps la liaison, et par conséquent, l'interprétation des résultats. Il est important, si la quantification est nécessaire, les anticorps monoclonaux sont indispensables, comme les anticorps polyclonaux peuvent reconnaître des epitopes multiples et sont sujettes à des variations de lot à lot. Actuellement, une variété d'anticorps (polyclonal protocoles et monoclonaux) et de coloration ont été décrits pour l'évaluation de la différenciation in vitro, ce qui rend difficile la comparaison de l'efficacité des protocoles cardiomyogenesis parmi 1,2,9,11. Pour cette raison, les anticorps monoclonaux sont utilisés lorsqu'ils sont disponibles pour toutes les analyses de cytométrie en flux. À l'avenir, il est prévu que la normalisation de ces protocoles de coloration, en particulier en ce qui concerne la quantification, devrait permettre une meilleure comparaison entre les stratégies de différenciation.

Le choix des marqueurs et leurs anticorps correspondants, utilisé pour évaluer la pureté de in vitro cardiomyogenèse varie selon les rapports. TNNT2 a été considéré comme un indicateur de cellules engagées au sort cardiomyogénique et est couramment utilisée pour évaluer l'efficacité des protocoles de différenciation cardiaques. Cependant, TNNT2 est également exprimée dans le muscle squelettique au cours de poussin et le développement du jeune rat 16,17 et il est présent dans le muscle lisse humain 18 in vitro. MLC2v et MLC2a sont couramment utilisés comme marqueurs de la ventriculaires et auriculaires sous-types, respectivement. Cependant, les défis de s'appuyer sur MLC2v et MLC2a pour déterminer le sous-type cardiomyocytes dans le contexte de la différenciation in vitro proviennent du fait que ces produits de gènes peuvent pas se limiter à une chambre spécifique au cours du développement cardiaque, du tube de cœur par adulte. Dans la boucle rongeur coeur, MLC2a ARNm est prédominante dans la / zone des voies d'entrée de l'oreillette et MLC2v ARNm est prédominante dans les régions du tractus ventriculaire / évacuation. Au coeur en boucle, la co-expression de MLC2a et MLC2v ARNm sont observés dans le tractus d'entrée, canal atrio-ventriculaire, et la voie d'éjection 19,20. En trois jours après la naissance, MLC2v ARNm est limitée au ventricule et de 10 jours après la naissance, MLC2a est limité aux oreillettes du coeur de rat nouveau-né 19. Par conséquent, l'interprétationde données concernant l'efficacité cardiomyogenèse et l'identité de sous-type ne doivent pas seulement tenir compte de la présence et la quantité de niveaux de marqueurs de référence, mais doivent tenir compte du stade de développement (s) à laquelle les points dans le temps de la différenciation qui sont analysés correspondent. Cela est particulièrement important étant donné que la phase de maturation des cellules cardiomyogéniques générées par la différenciation in vitro de hPSCs ressemble le plus à ceux du développement embryonnaire / 21-25. Ainsi, en s'appuyant sur l'expression spatiale d'un marqueur au cœur postnatale peut ne pas être approprié pour l'évaluation des cellules HPSC dérivés, au moins dans certains cas.

Dans un effort pour faciliter l'élaboration de critères plus spécifiques pour définir l'identité des cardiomyocytes in vitro, TNNI3 est considérée comme un marqueur utile pour évaluer cardiomyogenèse in vitro comme il est limité au muscle cardiaque tout au long de l'embryogenèse chez les poussins et le poisson zèbre 15,20et est absent dans le muscle squelettique foetal humain 26. Alors que TNNI1 est présent dans le cœur du fœtus humain, TNNI3 est la seule isoforme TNNI présente dans le cœur adulte normal 27,28. En ce qui concerne l'identité du sous-type cardiomyocytes, Irx4 29-31 est un marqueur informatif des cellules avec un sort ventriculaire. Au niveau de la protéine, Irx4 a récemment été montré être limitée au ventricule du tube cardiaque linéaire à travers les étapes néonatale chez la souris 32. En conséquence, les protocoles de coloration optimisés pour l'analyse de TNNI3 Irx4 et par cytométrie de flux sont décrits. À notre connaissance, ceci est la première description d'une méthode efficace pour la coloration et l'analyse des niveaux de Irx4 dans les cardiomyocytes humains à base d'anticorps par cytométrie de flux.

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Protocol

1 Solution et préparation des médias

  1. CSEh Matrice qualifié revêtement Stock Solution
    1. Lentement dégeler CSEh matrice qualifié (5 ml) sur la glace à 4 ° C pendant la nuit. Distribuer aliquotes dans des tubes à centrifuger pré-réfrigérés, 1,5 ml stérile et stocker immédiatement à -20 ° C.
      REMARQUE: Le volume de l'aliquote varie en fonction de beaucoup et se situe typiquement 270-350 pi. Le fabricant fournit des détails concernant le volume de la portion aliquote nécessaire pour obtenir une concentration de 1 x lors de la dilution dans 25 ml de la manière décrite dans l'étape 2.1.
  2. HPSC médias Solutions mères
    1. Utiliser de l'eau ultra-pure en tant que diluant, sauf indication contraire. Stériliser tous les composants à l'aide d'un filtre de 0,22 um. Rangez la suite que des solutions en vrac à 4 ° C: bicarbonate de sodium (75 mg / ml); de l'acide citrique (10 mM, pH = 3).
    2. Stériliser tous les composants à l'aide de filtre de seringue de 0,2 um et stocker chaque forme d'aliquotes à -20 ° C: Rho kinase (ROCK) inhibiteur Y-27632 (10mM dans du DPBS, 100 ul aliquote); L'acide L-ascorbique-2-phosphate (64 mg / ml, 500 ul aliquote); sélénite de sodium (70 pg / ml, 100 ul aliquote); la transferrine (50 mg / ml, 107 ul aliquote); le facteur de croissance fibroblastique 2 (FGF2, 200 ng / ul dans du DPBS, 250 ul aliquote); facteur de croissance transformant bêta 1 (TGFβ1, 100 ng / pl dans 10 mM froid acide citrique, 10 ul aliquote).
  3. Composition HPSC Media Solution E8
    1. Préparer médias utilisant des aliquotes préparé à l'étape 1.2: DMEM / F12 (avec de la L-glutamine et HEPES, 500 ml), du bicarbonate de sodium (3,62 ml; finale: 543 ug / ml), de l'acide L-ascorbique-2-phosphate (500 pi; finaux : 64 pg / ml), du sélénite de sodium (100 ul; finale: 140 ng / ml), transferrine (107 ul; final: 10,7 pg / ml), de l'insuline (1 ml; finale: 20 pg / ml), le FGF2 (250 ul; finale: 100 ng / ml), TGFβ1 (10 pi; finale: 2 ng / ml).
    2. Combinez tous les composants, stériliser de filtre et conserver à 4 ° C pendant 2 semaines.
  4. HPSC médias E8 avec inhibiteur de ROCK
    1. Ajouter inhibiteur de ROCK de 15 pi à 12 ml de E8 milieux préparés comme ci-dessus et bien mélanger. Assurez-vous que la concentration finale est de 10 uM après addition de cellules / médias à l'étape 3.7.
  5. Solutions mères de Wnt modulateurs
    1. Conserver les aliquotes suivantes à -20 ° C. CHIR 99021 (6-[[2-[[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(5​-methyl-1 H -imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethy​l]amino]-3-pyridinecarbonitrile; 10 mM dans le DMSO, 15 ul aliquotes). IWR 1-(4-(1,3,3a, 4,7,7a-hexahydro-1,3-dioxo-4,7-méthano-2H-isoindol-2-yl)-N-8-quinoléinyle-benzamide; 10 mM dans le DMSO, 6 pi aliquotes).
  6. Différenciation des médias
    1. Préparez le support de différenciation # 1 avec RPMI 1640 (avec L-glutamine) avec 2% de supplément d'insuline B27 moins.
    2. Préparez le support de différenciation # 2 avec RPMI 1640 (avec L-glutamine) avec 2% de B27 plus un supplément d'insuline et 2% de FBS.
  7. Solution de lavage cellule fou culture cellulaire
    1. Utiliser une solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS), sans calcium ou magnésium.
  8. Cellule de solution de lavage pour la cytométrie en flux
    1. Utiliser une solution saline tamponnée au phosphate (PBS sans calcium ni magnésium) avec 1% de FBS. Stocker à 4 ° C.
  9. Solution cellule de maintenance pour cytométrie en flux
    1. Utiliser une solution saline équilibrée de Hank (HBSS; sans calcium ou magnésium) avec 5% de FBS. Stocker à 4 ° C.
  10. Solutions de fixation pour cytométrie en flux
    1. Utilisez tampon Cytofix comme solution de fixation pour les anticorps TNNI3 et Irx4.
    2. Utilisez paraformaldéhyde 4% dans du PBS 1X (faire frais) comme solution de fixation pour les anticorps TNNT2 et MLC2a.
    3. Utilisez 70% de méthanol / acétone à 30% comme solution de fixation pour l'anticorps MLC2v.
    4. Conservez toutes les solutions à 4 ° C.
  11. Solutions de perméabilisation pour cytométrie en flux
    1. Utilisez Phosflow Perm tampon III comme perméabilisation solution fou d'anticorps et TNNI3 Irx4. Conserver à température ambiante (25 ° C).
    2. Utilisation de 0,2% de Triton X-100 dans du PBS 1x comme solution de perméabilisation des anticorps TNNT2, MLC2v, et MLC2a. Stocker à 4 ° C.
  12. La solution de blocage
    1. Utilisation du sérum de chèvre à 10% dans du PBS 1x. Assurez frais et stocker à 4 ° C jusqu'à utilisation.

Plaque de revêtement 2

  1. Décongeler lentement 1 aliquote de matrice qualifié CSEh à 4 ° C pendant 30 min, ajouter 25 ml de frais DMEM / F12 et bien mélanger dans stérilisé culture tissulaire capot immédiatement avant le revêtement de plaques de 6 puits.
  2. Ajouter 1 ml par puits d'une plaque à 6 puits stérilisé sous hotte de culture de tissu (une partie aliquote de la matrice qualifiée hESC est suffisante pour revêtir de quatre plaques à 6 puits).
  3. Laisser matrice qualifié CSEh pour régler pendant 30 min à température ambiante sous le capot. Aspirer la matrice qualifié excès CSEh et ajouter 2 ml de E8 médias avec un inhibiteur de ROCK à chaque puits. Utilisez plaques immédiatement, ou si desired, magasin à 4 ° C immédiatement après l'étalement jusqu'à 1 semaine et équilibrer à température ambiante pendant 30 minutes avant de l'utiliser.

3. repiquage et l'entretien des indifférenciées hPSCs en monocouche Culture

  1. Maintenir hPSCs en culture monocouche dans des plaques 6 puits et effectuer toutes les étapes sous une hotte de culture de tissu stérile.
  2. Utilisez les lignes HPSC qui sont bien établies (> p20) et présentent une morphologie homogène sans la présence de cellules avec un neurale, la morphologie epithelial- ou fibroblaste. Assurez cellules prolifèrent robuste, et en moyenne, passage tous les trois jours à 75% de confluence quand ensemencées à 0,75 x 10 6 par puits.
  3. hPSCs Passage avec dissociation au niveau d'une seule cellule au moins 5 fois avant le début de la différenciation pour assurer l'efficacité de la différenciation maximale. Pour hPSCs de passage, les médias aspirer E8 et laver les cellules deux fois avec 4 ml de 1x DPBS (préchauffé à la température ambiante). Ajouter 1 ml de la détacher de la cellulement solution (pré-chauffée à la température ambiante) à chaque puits et laisser le puits au repos pendant 3-7 min, jusqu'à ce que les limites des cellules commencent à rafle.
  4. Utiliser une pipette en verre bouché avec du coton ampoule pour déloger les cellules et les transférer dans un tube conique de 15 ml contenant 1 ml de milieu DMEM / F12 (pour inactiver la solution de détachement cellulaire).
  5. Retirer 10 aliquote ul de solution de cellules et mélanger avec 10 pi de bleu trypan dans un tube à centrifuger. Compter les cellules (par exemple automatisé ou manuel) hémocytomètre en reste des cellules sont collectées par centrifugation à 130 g pendant 5 min à température ambiante. En utilisant ce protocole, attendre 70-80% de viabilité en utilisant un hématimètre automatisé et aller de l'avant, la base tous les numéros de cellulaires sur le nombre total de cellules.
  6. Aspirer le milieu et remettre en suspension le culot cellulaire dans du DMEM / F12 à une concentration finale de 0,75 x 10 6 cellules par 500 pi.
  7. Ajouter 500 ul de la suspension cellulaire dans chaque puits d'une plaque à 6 puits où chaque puits contains 2 ml médias E8 avec un inhibiteur de ROCK, préparé à l'étape 2.3. Laissant plaque sur le plan de travail, déplacez doucement dans des cellules d'avant en arrière et mouvement d'un côté à l'autre de se disperser uniformément dans le puits. Retour cellules dans l'incubateur à 5% de CO 2, 37 ° C.
  8. A partir de 24 heures après repiquage, remplacer le support quotidien à l'aide de 2 ml / puits E8 sans inhibiteur de ROCK. Optimiser la densité de semis atteindre 100% de confluence avant le début de la différenciation. Graine 0,75 x 10 6 cellules / puits quatre jours avant le début de la différenciation, mais optimiser pour chaque lignée cellulaire en tant que de besoin.

4. cardiomyocytes induction de hPSCs par modulation sélective de la voie Wnt Pathway

  1. Actualiser les médias (2 ml / puits) tous les jours pendant 0-7 jours, et tous les autres, jour après jour 8.
  2. Au jour 0, entamer le processus de différenciation en remplaçant E8 médias avec les médias de différenciation # 1. Ajouter 1,2 pi CHIR (6 pM finale) dans chaque puits. Répétez le jour 1.
  3. Les jours 2-3, remplacer par différen fraismédias négocia- ° 1.
  4. Au jour 4, remplacer par la différenciation frais le support n ° 1. Ajouter 1 pi IWR 1-(5 pM final) à chaque puits. Répétez le jour 5.
  5. Les jours 6-7, remplacer par la différenciation frais le support n ° 1.
  6. Au jour 8, remplacer par la différenciation frais le support n ° 2.
  7. Continuer à remplacer par les médias de différenciation # 2 tous les jours pendant le temps désiré de la culture.
  8. Si vous le souhaitez, les cardiomyocytes de passage à l'aide de la solution de détachement cellulaire suivant les étapes décrites dans 3,3-3,6, mais en remplaçant les médias avec les médias de différenciation # 2. Au cours des passages, dissocier les cardiomyocytes en petits groupes de cellules ~ 3-10. Semer à ~ 6 x 10 5 cellules par puits à l'aide de CSEh matrice qualifié puits revêtus et la différenciation des médias n ° 2.

5 Collection de cellules pour la cytométrie en flux

  1. Effectuer tous les autres aspects des étapes 5-9 sur le banc de laboratoire (c.-à-pas stérile).
  2. médias et de croissance Aspirer Laver les cellules deux fois avec du PBS 1X.Ajouter 1 ml de la solution de détachement cellulaire (préchauffée à la température ambiante) à chaque puits et laisser reposer pendant 3-7 min, jusqu'à ce que les limites des cellules commencent à rafle. Utilisez un coton-branché verre borosilicate jetable 9 "pipette avec ampoule à déloger les cellules et transférer dans un tube de 15 ml conique sur la glace.
  3. Tout au long de reste de protocole, maintenir les cellules sur la glace et effectuer centrifugations à 200 g pendant 5 min à 4 ° C.
  4. Recueillir les cellules par centrifugation et la solution d'aspiration. Resuspendre les cellules dans 10 ml de solution de lavage de la cellule en utilisant une pipette sérologique de 10 ml avec trituration, afin de vérifier amas de cellules sont dispersées dans des cellules individuelles. Compter les cellules à l'étape 3.5 en tant que tout reste des cellules sont collectées par centrifugation.
  5. Resuspendre les cellules dans la solution de lavage des cellules en prenant soin de se désagrègent complètement culot cellulaire et une aliquote x 10 6 cellules par tube à fond rond. Recueillir les cellules par centrifugation et la solution d'aspiration.

6 Fixation etPerméabilisation des cellules pour l'antigène intracellulaire coloration

  1. Ajouter la solution de fixation de 100 ul de culot cellulaire. Ajouter la solution goutte à goutte avec vortex douce et continue, puis mis sur la glace pendant 15 min.
  2. Ajouter 3 ml de solution de lavage de la cellule. Recueillir les cellules par centrifugation et la solution d'aspiration.
  3. Ajouter la solution de perméabilisation de 100 ul de culot cellulaire. Ajouter la solution goutte à goutte avec vortex douce et continue ensuite mis sur la glace pendant 30 min. Utilisation fixation et perméabilisation conditions décrites pour chaque anticorps dans le tableau 1.
  4. Ajouter 3 ml de solution de lavage de la cellule. Recueillir les cellules par centrifugation et la solution d'aspiration. Répétez l'opération pour un total de deux lavages après perméabilisation.
Anticorps primaire (Clone) Immunogène / épitope reconnu Contrôle Istotype Montant de l'anticorps primaire par 1 x 10 6 cellules dans 100 ul Fixation Solution Solution de perméabilisation Anticorps secondaire Montant de l'anticorps secondaire / 1 x 10 6 cellules dans 100 ul
Pour des mesures positives pour cent La quantification de l'antigène
TNNI3 (284 (19C7) ISASRKLQL (humaine) Mouse IgG2b 1,0 pg 3,0 pg BD Cytofix BD Phosflow perm III De chèvre anti-souris IgG2b-Alexa488 600 ng
TNNT2 (1C11) Sur toute la longueur de la troponine humaine native de la protéine purifiée T. Mouse IgG1 1,0 pg 2,0 pg 4% de PFA1% dans du PBS 0,2% de Triton X-100 dans du PBS 1% IgG1 chèvre anti-souris - Alexa 488 600 ng
MLC2v (330G5) FDPEGKG IgG2a de souris 2,0 pg 3,0 pg 70% de méthanol / acétone 30% 0,2% de Triton X-100 dans du PBS 1% Chèvre anti-IgG2a de souris - Alexa 647 600 ng
MLC2a (4E7) longueur protéine recombinante humaine de MYL7 humaine produite dans E. coli Mouse IgG1 0,5 pg 3,0 pg 4% de PFA à 1% dans du PBS 0,2% de Triton X-100 dans du PBS 1% IgG1 chèvre anti-souris - Alexa 488 600 ng
Irx4 LQEHRKNP
YPTKGEKI
MLAIITKM
TLTQVST 		IgG de lapin 0,5 pg 0,5 pg BD Cytofix BD Phosflow perm III Chèvre anti-rabbit IgG-PE 600 ng

Tableau 1 Anticorps concentrations. Vente sont l'anticorps primaire, clone (si monoclonaux), les concentrations optimisées et fixation et perméabilisation des conditions pour chaque anticorps primaire et secondaire utilisés pour l'écoulement des analyses de cytométrie. Comme les concentrations d'anticorps d'achat d'actions peuvent varier selon les fournisseurs du même clone, des concentrations finales de chaque anticorps par 1 x 10 6 cellules dans un volume d'essai fixe, plutôt que de dilutions, sont fournis. L'immunogène utilisé pour générer l'anticorps, ou épitope reconnu par l'anticorps, comme prévu par le fabricant, est répertorié mais n'a pas été vérifiée expérimentalement ici.

7. coloration des anticorps

  1. Pour chaque expérience, inclure un témoin non coloré par fixation / état de perméabilisation et le contrôle isotypique approprié pour chaque anticorps primaire utilisé. Inclure les types de cellules non-cardiomyocytes que les contrôles négatifs (par exemple, des cellules souches pluripotentes ou des fibroblastes). Utilisez les contrôles isotypiques à la même concentration que l'anticorps primaire correspondant (voir tableau 1).
  2. Resuspendre les cellules dans 100 pl de solution de blocage à l'aide d'une pipette P200 pour désagréger les cellules. Set échantillons sur la glace pendant 25 minutes sous agitation légère.
  3. Sans enlever la solution de blocage, ajouter anticorps primaire ou isotype contrôle conformément aux lignes directrices figurant dans le tableau 1. Incuber 45 min sur la glace avec doux balancement.
  4. Ajouter 3 ml de solution de lavage de la cellule. Recueillir les cellules par centrifugation et la solution d'aspiration. Répéter pour un total de deux lavages après le marquage de l'anticorps primaire.
  5. Si un anticorps primaire conjugué à un fluorophore est utilisé, passez à 8.1. Quand un anticorps primaire non conjugué est utilisé (comme pour tous les marqueurs décrits ici), effectuer le marquage avec l'anticorps secondaire est conjugué à un fluorophore comme suit.
  6. Resuspendre les cellules dans 100 pi de solution de blocage à l'aide d'une pipette P200 à Disacellules ggregate.
  7. Ajouter anticorps secondaire conformément aux lignes directrices figurant dans le tableau 1. Incuber 30 min sur la glace avec doux balancement.
  8. Ajouter 3 ml de solution de lavage de la cellule. Recueillir les cellules par centrifugation et la solution d'aspiration. Répéter pour un total de deux lavages après marquage de l'anticorps secondaire.

8 Préparation des cellules pour la cytométrie de flux

  1. Resuspendre les cellules dans 400 ul solution de maintenance de la cellule à l'aide d'une pipette P1000 de désagréger les cellules.
  2. Préparer un capuchon de filtre de la cellule sur un tube à fond rond de pré-mouillage avec une solution d'entretien de la cellule de 50 pi. Réglez le tube sur la glace. Utilisez le bouchon du filtre cellulaire pour éviter des agrégats de cellules de boucher le cytomètre en flux.
  3. Transfert de solution de cellule à cellule de bouchon et permettre la suspension de cellules de s'écouler par gravité. Appuyez sur le bas du tube doucement sur paillasse que nécessaire afin que les cellules sont collectées dans le tube et en retrait sur la glace le plus rapidement possible. Crépine Rincer à l'entretien des cellules de 250 pi silution pour assurer la reprise maximale des cellules.
  4. Maintenir les cellules sur de la glace et de protéger de la lumière jusqu'à l'analyse par cytométrie en flux.

9 cytométrie en flux

Les paramètres détaillés d'acquisition varient entre instruments. Paramètres fondamentaux à prendre en compte pour la collecte optimale des données sont décrites ci-dessous.

  1. Pour la stabilité du flux optimal, assurez-vous que la taille de la buse dépasse 5-6x le diamètre de la cellule en cours d'analyse.
    NOTE: Cela peut varier entre les instruments, mais est un facteur important à la fois pour les analyseurs et sélection de la taille de la buse appropriée pour le tri cellulaire. Le diamètre moyen de 10 jours est de 11 cardiomyocytes um (de 8 à 14 um); Ainsi, un tube d'injection d'échantillon de 150 um standard sur un analyseur fonctionne bien.
  2. Immédiatement avant l'analyse des données, chaque tube vortex brièvement pour disperser les agrégats cellulaires.
  3. Optimiser l'avant et les réglages de tension de la dispersion latérale pour chaque type de cellule basés surtémoin non coloré pour chaque condition de fixation / perméabilisation utilisé dans l'expérience de telle sorte que les populations d'intérêt sont à l'échelle et centrées (figure 2A).
    1. Maintenir ces paramètres tout au long d'une seule expérience et être cohérent d'une expérience à sur le même instrument, comme des changements importants peuvent indiquer des problèmes potentiels avec le cytomètre de flux ou de la préparation de l'échantillon.
  4. Pour chaque fluorophore, analyser le contrôle isotypique et ajuster la tension de laser appropriée pour déterminer l'intensité minimale nécessaire à l'obtention d'un histogramme de fluorescence qui présente des bords gauche et droit de la pointe. Maintenir les réglages du laser pour chaque isotype contrôle lors de l'acquisition de données sur des échantillons d'anticorps teinté correspondant.
    REMARQUE: Signal dérive se produit souvent au fil du temps sur le même instrument. Il est essentiel d'ajuster les paramètres du laser au début de chaque essai sur la base du contrôle d'isotype approprié.
  5. Recueillir un minimum de10 000 événements. 50 000 événements sont préférés.
  6. Pour les analyses statistiques, la porte de la population de cellules vivantes d'exclure les débris (figure 2A). Déterminer pourcentage de cellules positives au sein de la population fermée basé sur le placement de marqueur qui permet ≤2% contribution de contrôle isotypique, comme le montre la figure 2B, C.

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Representative Results

Au jour 0, les cellules sont confluentes à 100% avec la morphologie compacte et les débris de cellules minimal. Le jour 2.1, il est courant d'observer la mort cellulaire significative (40-50%), mais les cellules attachées conservera morphologie compacte (figure 1A). Pendant ce temps, les médias est orange et trouble. Médias rose indique la mort cellulaire excessive, et dans ce cas, confirmer au bleu trypan et cesser si la mort de la cellule dépasse 70%. Les cellules seront guéris pendant les jours 3-4 et la densité augmente. Pendant les jours 5-6, la mort cellulaire se produit minimal et des taches denses peut commencer à apparaître. En 7-8 jours, une monocouche confluente est réalisé avec une morphologie compacte entrecoupées de taches denses. Les cellules commencent à se contractant spontanément par jour 8 et les premières contractions sont souvent visibles dans les peuplements denses. En 10 jours, la contraction plus forte est observée et continuera à se répandre dans la culture dans les jours suivants. Immunocytochimie coloration pour α-actinine et la structure TNNT2 spectacle de sarcomère(Figure 1A). Tel que mesuré par quantitatif en temps réel la réaction en chaîne de la polymérase (qRT-PCR), les niveaux d'ARNm des marqueurs de référence des profils temporels mésoderme et d'affichage d'engagement cardiomyogénique comme prévu (figure 1B), avec une expression robuste d'cardiaque protéines marqueurs homéoboîte Nkx-2.5 (Nkx2.5 ), TNNI3, MLC2a, MLC2v, et la myosine-6 ​​(MYH6). Très faible à des niveaux non détectables de muscle lisse (myosine à chaîne lourde 11, MYH11) et le muscle squelettique (myogenin, MYOG) marqueurs sont monnaie courante. Compatible avec le développement rapide où l'expression est observée à la fois dans le muscle cardiaque et squelettique avant d'être restreinte au muscle squelettique chez l'adulte 20,27,28, la troponine isoformes TNNI1 et TNNI2 sont solidement détectés pendant les jours 7-8.

Conformément à d'autres rapports, ce vitro stratégie de différenciation génère cardiomyocytes présentent des caractéristiques de progéniteurs cardiaques précoces (morphologie arrondie, la co-expression de MLC2a, MLC2v) 19 30,32. En cytométrie en flux, les profils de diffusion de la lumière varient selon les types de cellules et de modifier considérablement parmi fixation / conditions de perméabilisation (figure 2A). Dans ces différentes conditions de préparation des cellules, la cytométrie en flux analyse révèle contrôles isotypiques avec des pics simples avec une distinction claire entre le contrôle isotypique et anticorps (figure 2B). Cellules pluripotentes ou d'autres cellules non-cardiomyocytes sont négatifs pour les marqueurs utilisés ici.

En utilisant ce protocole de différenciation et de la coloration, la population cellulaire obtenue est typiquement de 99% TNNI3, 96% Irx4 +, 91% MLC2v +, et 96% par MLC2a + 10 jours de différenciation, telle que mesurée par cytométrie en flux. 99% TNNT2 + cellules sont observées (figures 2C, 2D), mais comme il est décrit ci-dessus, TNNT2 n'est pas uniquede cardiomyocytes au cours du développement et donc l'affirmation selon laquelle les cellules sont 99% des cardiomyocytes authentiques par jour 10 est basé sur la protéine TNNI3. Il est à noter que, avec la culture continue au-delà de 10 jours, les niveaux de protéines de structure de la protéine ne sera pas élevé bien que les niveaux d'expression des gènes par rapport diminue par rapport à un pic d'expression comme contrôlé par qRT-PCR, compatible avec la stabilité de la protéine et le taux de 3,2 et 3,5 jours roulement, respectivement, pour TNNI et TNNT 33. Un exemple de cette observation est disponible pour TNNT2 (expression de l'ARNm de pic au jour 11 (figure 1B), les niveaux de protéines solides à jour 20 + (Figure 2E).

Figure 1
Figure 1: Représentation schématique l'ensemble de la différenciation des cardiomyocytes de hPSCs et des données représentatives. (A) Schéma de cardiomyocytes differentiatio n protocole annoté avec étage correspondant de la lignée et / ou de l'engagement du destin cellulaire. Représentant des images à contraste de phase de cellules dans les principaux stades du processus de différenciation. Barre d'échelle = 10 um. Extrême droite = image de l'ICC des α-actinine (vert) recouvert d'TNNT2 (rouge) et les noyaux (bleu). (B) analyse qRT-PCR (pour ensemble de sondes, voir la table des matières) de 18 mésoderme de référence et des marqueurs de développement cardiaques pendant les 17 premiers jours de différenciation. Toutes les données représentent la moyenne de trois répétitions de chaque biologiques analysés en triple, où les barres d'erreur représentent l'erreur standard de la moyenne, et sont normalisées par rapport à l'actine (ACTB). niveaux de message pour tous les points de temps sont par rapport au premier jour de différenciation où les valeurs de Ct sont détectables (c.-à-Ct <35). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

t "fo: keep-together.within page =" always "> Figure 2
Figure 2: Caractérisation des cardiomyocytes par cytométrie en flux et l'électrophysiologie. (A) des profils de diffusion de la lumière du jour 10 cardiomyocytes hiPSC dérivés dans diverses conditions de fixation et perméabilisation. 50.000 événements ont été recueillies et la population (à l'exclusion de débris) fermée utilisée pour les analyses statistiques sont indiquées en rouge. (B) Les histogrammes de Irx4 au jour 10 de la différenciation à partir de trois conditions fixation / perméabilisation différents, illustrant les différences de coloration efficacité entre les méthodes. Encadrés montrent les différences de coloration de Irx4 sur hiPSCs utilisant chaque condition. Ces données illustrent pourquoi méthanol / acétone est évitée pour Irx4 raison de la faible, mais détectable, coloration sur hiPSCs. (C) histogrammes de TNNI3, TNNT2, MLC2v, MLC2a au jour 10 de Differenti ation en utilisant des conditions de coloration optimisées pour pourcentage de cellules positives plafonds indiqués dans le tableau 1. (D) histogrammes de TNNT2 des expériences de titrage d'anticorps, ce qui montre que 0,5 ug est le montant minimum requis pour mesurer 99% TNNT2 + cellules, mais que 2 pg est le point de saturation requis pour la quantification. Seul un contrôle isotypique seul est représenté, mais des expériences de titrage sont calculées sur la base de la comparaison de chaque anticorps à son titrage correspondant de contrôle d'isotype. (E) La quantification de la protéine TNNT2 sur les cardiomyocytes, les jours 0-24 de différenciation, représentée comme la différence d'intensité de fluorescence médiane entre l'anticorps et le contrôle isotypique pour chaque point. (F) de potentiel d'action enregistrée à partir d'une seule contracter spontanément cardiomyocytes ventriculaires analogue sur 46 jours de différenciation en utilisant la configuration de la pince de courant de cellule entière de la technique patch-clamp temps.es / ftp_upload / 52010 / 52010fig2highres.jpg "target =" _blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Name Company Catalog Number Comments
Cell Culture
BD Matrigel, hESC-qualified matrix BD Biosciences 354277
Accutase cell detachment solution Stem Cell Technologies 7920
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium Life Technologies 14190-136
Dimethyl sulfoxide (DMSO, Hybri-Max, sterile-filtered) Sigma Aldrich D2650
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich 53817
Citric acid Sigma Aldrich C2404-100G
Y-27632 dihydrochloride selective p160ROCK inhibitor R&D Systems 1254
L-Ascorbic acid-2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate Sigma Aldrich A8960-5G
Sodium selenite Sigma Aldrich S5261-10G
Transferrin (Optiferrin – Defined, Animal-free, Recombinant Human) Invitria 777TRF029
Fibroblast growth factor 2 (FGF2) R&D Systems 4144-TC-01M
Transforming growth factor beta 1 (TGFβ1) Peprotech 100-21
DMEM/F12 with L-Glutamine and 15 mM HEPES Life Technologies 11330-032
Insulin Sigma Aldrich I9278-5ML
CHIR-99021 HCl Sellekchem S2924
IWR-1 Sigma Aldrich I0161
RPMI 1640 with L-Glutamine Life Technologies 11875-093
B-27 Supplement Minus Insulin Life Technologies A1895601
B-27 Supplement (with Insulin) Life Technologies 17504-044
Fetal bovine serum Life Technologies 10437
Flow Cytometry Reagents
Phosphate buffered saline (10x) Quality Biological Inc. 119-069-151
Hank's balanced salt solution without Ca2+ and Mg2+ Life Technologies 14175-095
BD Cytofix BD Biosciences 554655
BD Phosflow perm buffer III BD Biosciences 558050
16% Paraformaldehyde Thermo Scientific 28906
Methanol Sigma Aldrich 179957-4L
Acetone Mallenckrodt Chemicals  2440-16
Triton X-100 Amresco M236-10ML
Goat serum Life Technologies 16210-064
Trypan blue solution, 0.4% Life Technologies 15250-061
Materials
5 ml Round bottom polystyrene tube (without cap) Corning 352008 For preparation of cells for flow cytometry
5 ml Round bottom polystyrene tube (with 35 µM cell strainer snap cap) Corning 352235 For preparation of cells for flow cytometry
2 ml rubber bulbs Fischer Scientific 03-448-24
9" borosilicate unplugged glass Pasteur pipets BioExpress P-2904-2
0.65 ml Microcentrifuge tubes, graduated, green GeneMate C-3259-G
1.5 ml Microcentrifuge tubes, graduated, red GeneMate C-3260-R
TC20 automated cell counter BioRad 145-0102
Counting slides for TC20 BioRad 145-0011
6-well Flat bottom tissue-culture treated plate Corning 353046
20 ml Syringes BD Plastipak 300613 For filter sterilization of aliquots
Sterile syringe filters, 0.2 µm polyethersulfone VWR 28145-501 For filter sterilization of aliquots
250 ml Filter system, 0.22 µm polyethersulfone, sterilizing, low binding Corning 431096 For filter sterilization of bulk media 
500 ml filter system, 0.22 µm polyethersulfone, sterilizing, low binding Corning 431097 For filter sterilization of bulk media
Antibodies and Isotype Controls
Anti-TNNI3 (clone: 284 (19C7)) Abcam ab19615 Primary antibody
Anti-TNNT2 (clone: 1C11) Thermo Scientific MA1-16687 Primary antibody
Anti-MYL2 (MLC2v, clone: 330G5) Synaptic Systems 310111 Primary antibody
Anti-MYL7 (MLC2a, clone: 4E7) Abcam AB131661 Primary antibody
Anti-IRX4   Bioss BS-9464R Primary antibody
Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG1  Life Technologies A21121 Secondary antibody
Alexa Fluor 647 Goat anti-mouse IgG2a Life Technologies A21241 Secondary antibody
Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG2b Life Technologies A21141 Secondary antibody
Phycoerythrin(PE) Goat anti-rabbit IgG R&D Systems F0110 Secondary antibody
Mouse IgG1 BD Biosciences 557273 Isotype Control
Mouse IgG2a eBiosciences 16-4724-81 Isotype Control
Rabbit IgG-PE R&D Systems IC105P Isotype Control
TaqMan Probesets for qRT-PCR
ACTB Life Technologies Hs01060665
Brachyury T Life Technologies Hs00610080
CASQ2 Life Technologies Hs00154286
IRX4 Life Technologies Hs01100809
ISL1 Life Technologies Hs00158126
MESP1 Life Technologies Hs01001283
MYH11 (SMMHC) Life Technologies Hs00224610
MYH6 Life Technologies Hs01101425
MYL2 (MLC2v) Life Technologies Hs00166405
MYL7 (MLC2a) Life Technologies Hs01085598
MYOG Life Technologies Hs01072232
NKX2.5 Life Technologies Hs00231763
NPPA Life Technologies Hs01081097
POU5F1 Life Technologies Hs04260367
SOX17 Life Technologies HS00751752
TNNI1 Life Technologies Hs00913333
TNNI2 Life Technologies Hs00268536
TNNI3 Life Technologies HS00165957
TNNT2 Life Technologies Hs00165960

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References

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Biologie cellulaire Numéro 91 les cellules souches pluripotentes humaines la cytométrie en flux la différenciation dirigée cardiomyocytes Irx4 TNNI3 TNNT2 MCL2v MLC2a
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Bhattacharya, S., Burridge, P. W.,… More

Bhattacharya, S., Burridge, P. W., Kropp, E. M., Chuppa, S. L., Kwok, W. M., Wu, J. C., Boheler, K. R., Gundry, R. L. High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (91), e52010, doi:10.3791/52010 (2014).

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