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Diferenciação de alta eficiência de pluripotentes humanas células-tronco para Cardiomyocytes e Caracterização por citometria de fluxo

Published: September 23, 2014 doi: 10.3791/52010
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1, 3, 2, 4,5, 1,6
1Department of Biochemistry, Medical College of Wisconsin, 2Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, 3Department of Anesthesiology, Medical College of Wisconsin, 4Stem Cell and Regenerative Medicine Consortium, LKS Faculty of Medicine, Hong Kong University, 5Division of Cardiology, Johns Hopkins University School of Medicine, 6Cardiovascular Research Center, Biotechnology and Bioengineering Center, Medical College of Wisconsin
* These authors contributed equally

Summary

O artigo descreve a metodologia detalhada para diferenciar de forma eficiente as células estaminais pluripotentes em cardiomiócitos de modular selectivamente a via Wnt, seguido por análise de citometria de fluxo de marcadores de referência para avaliar a homogeneidade e a identidade da população.

Abstract

Há uma necessidade urgente de desenvolver abordagens para reparar o coração danificado, descobrir novas drogas terapêuticas que não têm efeitos tóxicos no coração, e melhorar as estratégias de modelar com precisão a doença cardíaca. O potencial de exploração da tecnologia humana célula-tronco pluripotentes induzidas (hiPSC) para gerar músculo cardíaco "em um prato" para estas aplicações continua a gerar grande entusiasmo. Nos últimos anos, a capacidade de gerar de forma eficiente as células cardiomiogênica a partir de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) tem melhorado muito, nos oferecendo novas oportunidades para modelar estágios muito iniciais de desenvolvimento cardíaco humano não acessíveis de outra forma. Em contraste com muitos métodos anteriores, o protocolo de diferenciação de cardiomiócitos aqui descrito não requer a agregação de células, ou a adição de Activina A ou BMP4 e robustamente gera culturas de células que são altamente positivo para a troponina I cardíaca e T (TNNI3, TNNT2), iroquois- proteína classe homeodomínioIRX-4 (IRX4), miosina regulatória de cadeia leve 2, isoforma muscular ventricular / cardíaco (MLC2v) e miosina regulatória de cadeia leve 2, isoforma atrial (MLC2a) por 10 dias em todas células estaminais embrionárias humanas (hESC) e linhas hiPSC testado para data. As células podem ser passadas e mantida por mais de 90 dias em cultura. A estratégia é tecnicamente simples de implementar e de baixo custo. Caracterização de cardiomiócitos derivados de células pluripotentes inclui muitas vezes a análise de marcadores de referência, tanto ao nível do mRNA e de proteínas. Para a análise de proteínas, a citometria de fluxo é uma poderosa ferramenta analítica para avaliar a qualidade das células na cultura e a determinação subpopulação homogeneidade. No entanto, a variação técnica na preparação da amostra pode afetar significativamente a qualidade de citometria de fluxo de dados. Assim, a padronização de protocolos de coloração deve facilitar as comparações entre as várias estratégias de diferenciação. Deste modo, optimizado para protocolos de coloração para a análise de IRX4, MLC2v, MLC2a, TNNI3, e TNNT2 por citometria de fluxo encontram-se descritos.

Introduction

A geração de cardiomiócitos de hPSCs, incluindo células estaminais embrionárias humanas e hiPSC, pode funcionar como um modelo in vitro de processos de desenvolvimento cardíacos humanos muito antigos, fornecendo informações sobre as fases de outra forma não acessíveis para estudos mecanicistas. Este modelo de sistema fornece uma oportunidade única para estudar as vias moleculares que controlam o compromisso linhagem cardíaca e especificação destino celular. Nos últimos anos, a capacidade de gerar de forma eficiente as células cardiomiogênica de hPSCs tem melhorado muito 1-15. No entanto, entre os protocolos há uma variação de linha de células no que respeita à eficiência na geração de células cardiomiogênica e tempo em que as células expressam marcadores específicos de câmara (por exemplo, átrios e ventrículo). Idealmente, para aplicações futuras deste sistema modelo, as populações mais homogêneas de células funcionalmente definidos são desejados. Em contraste com os métodos anteriores, a diferenciação de cardiomiócitos protocolo aqui descrito não necessita cell agregação ou a adição de Activin A ou proteína morfogenética óssea 4 (BMP4) e robusta gera culturas altamente positivo para TNNI3, TNNT2, IRX4, MLC2v e MLC2a por dia 10 células em todas as linhas hESC e hiPSC testadas até o momento. A estratégia é tecnicamente simples de implementar, especialmente em comparação com culturas tridimensionais, cultura de massa, ou estratégias baseadas corpo embrióide 4-9, e recentemente foi definido em um estudo que descreve uma pequena molécula com toxicidade seletiva para hPSCs (Boheler et al. ) 65. Características deste protocolo incluem a diferenciação hPSCs em cultura em monocamada, utilizando uma única camada de uma matriz qualificado hESC (Matrigel), meios totalmente definidos, utilizando pequenas moléculas para modular a sinalização Wnt (similar, mas distinto do 1,2,7,13), e fluxo optimizado citometria de métodos de coloração para avaliação da eficiência da diferenciação e da identidade da célula. Em resumo, as vantagens deste protocolo em relação a relatórios anteriores incluem o seu custo-effectiveness, reprodutibilidade e sua alta eficiência para a geração de cardiomiócitos entre várias linhas HPSC, incluindo células estaminais embrionárias humanas e hiPSC linhas.

A citometria de fluxo é uma poderosa ferramenta analítica para avaliar a qualidade das células em cultura e determinação subpopulação homogeneidade e com design experimental adequada, pode fornecer medições quantitativas. Tal como acontece com todas as estratégias baseadas em anticorpos, a interpretação precisa dos resultados experimentais exige que os elementos do desenho do ensaio, incluindo concentração de anticorpos e fixação e condições de permeabilização (quando segmentação antígenos intracelulares) são cuidadosamente testados para cada anticorpo como condições sub-ótimas afetar significativamente a eficiência de anticorpo ligação, e portanto, a interpretação dos resultados. É importante notar que se a quantificação é necessária, os anticorpos monoclonais são essenciais, tal como anticorpos policlonais podem reconhecer epitopos múltiplos e são propensos a variação de lote para lote. Actualmente, uma variedade de anticorpos (poprotocolos lyclonal e monoclonais) e de coloração têm sido descritos para a avaliação da diferenciação in vitro, o que torna difícil comparar a eficiência de cardiomyogenesis entre protocolos 1,2,9,11. Por essa razão, os anticorpos monoclonais são utilizados quando disponíveis para todas as análises de citometria de fluxo. Para o futuro, espera-se que a padronização destes protocolos de coloração, especialmente com relação à quantificação, deve permitir uma melhor comparação entre estratégias de diferenciação.

A escolha dos marcadores, e os seus anticorpos correspondentes, utilizados para avaliar a pureza de cardiomyogenesis in vitro varia entre os relatórios. TNNT2 tem sido considerado um indicador das células comprometidas com o destino cardiomiogênica e é rotineiramente utilizado para avaliar a eficiência de protocolos de diferenciação cardíacos. No entanto, também é TNNT2 expresso no músculo esquelético durante o início de pinto de rato e o desenvolvimento 16,17 e está presente no músculo liso humano 18 in vitro. MLC2v e MLC2a são rotineiramente utilizados como marcadores substitutos de subtipos ventriculares e atriais, respectivamente. No entanto, os desafios com contando com MLC2v e MLC2a para determinar o subtipo de cardiomiócitos no contexto de diferenciação in vitro surgem do fato de que estes produtos de genes não pode ser restrito a uma câmara específica ao longo do desenvolvimento cardíaco, tubo de coração através de um adulto. No roedor loop coração, MLC2a mRNA é predominante na zona do átrio / entrada trato e MLC2v mRNA é predominante nas regiões do trato ventricular / descarga. No coração loop, co-expressão de MLC2a e MLC2v mRNAs são observados na via de entrada, canal atrioventricular, e via de saída 19,20. Aos 3 dias após o nascimento, MLC2v mRNA é restrito para o ventrículo e, aos 10 dias após o nascimento, MLC2a é restrita às aurículas do coração de rato neonatal 19. Portanto, a interpretaçãode dados sobre a eficiência cardiomyogenesis e subtipo identidade não só deve considerar a presença ea quantidade de níveis de marcadores de referência, mas deve considerar o estágio (s) de desenvolvimento a que os instantes de diferenciação que são analisados ​​correspondem. Isto é especialmente importante considerando-se que a fase de maturação das células cardiomiogênica gerados pela diferenciação in vitro de hPSCs mais se assemelha aqueles do desenvolvimento embrionário / fetal 21-25. Assim, com base na expressão espacial de um marcador no coração pós-natal pode não ser apropriado para a avaliação de células HPSC derivados, pelo menos em alguns casos.

Em um esforço para facilitar o desenvolvimento de critérios mais específicos para a definição da identidade de cardiomiócitos in vitro, TNNI3 é considerada um marcador importante na avaliação de cardiomyogenesis in vitro, uma vez que é restrito no músculo cardíaco durante toda a embriogênese em garota e peixe-zebra 15,20e está ausente no músculo esquelético humano fetal 26. Enquanto TNNI1 está presente no coração fetal humano, TNNI3 é a única isoforma presente TNNI no coração adulto normal 27,28. Quanto cardiomiócitos subtipo identidade, IRX4 29-31 é um marcador informativo de células com um destino ventricular. Ao nível da proteína, IRX4 foi recentemente mostrado para ser restringida ao ventrículo do coração do tubo linear através de estágios neonatais do rato 32. Por conseguinte, os protocolos de coloração optimizados para a análise de TNNI3 IRX4 e por citometria de fluxo encontram-se descritos. Para nosso conhecimento, esta é a primeira descrição de um método para a coloração com anticorpos e análise eficiente dos níveis IRX4 em cardiomiócitos humanos, por citometria de fluxo.

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Protocol

1. Solution e preparação da mídia

  1. hESC Matrix Qualificado revestimento da Solução
    1. Lentamente descongelar hESC matriz qualificado (5 ml) em gelo, a 4 ° C durante a noite. Dispense alíquotas em microtubos pré-refrigerados, 1,5 ml estéril e armazenar imediatamente a -20 ° C.
      NOTA: O volume da alíquota vai variar com base no lote e varia tipicamente 270-350 ul. Fabricante fornece detalhes sobre o volume de alíquota necessária para alcançar uma concentração 1x por diluição em 25 ml, tal como descrito na etapa 2.1.
  2. HPSC Mídia Banco de Soluções
    1. Utilizar água ultrapura como um diluente, a menos que indicado de outra forma. Esterilizar todos os componentes através de um filtro de 0,22 um. Guarde o seguinte como soluções a granel a 4 ° C: bicarbonato de sódio (75 mg / ml); ácido cítrico (10 mM, pH = 3).
    2. Esterilizar todos os componentes utilizando 0,2 m filtro de seringa e guarde cada um como alíquotas a -20 ° C: Rho-quinase (ROCK) inibidor Y-27632 (10mM em DPBS, alíquota de 100 ul); O ácido L-ascórbico 2-fosfato (64 mg / ml, 500 ul ali quota); selenito de sódio (70 ug / ml, 100 ul ali quota); transferrina (50 mg / ml, 107 ul ali quota); factor de crescimento de fibroblastos 2 (FGF2, 200 ng / mL em DPBS, 250 ul ali quota); factor de transformação de crescimento beta 1 (TGF-p1, com 100 ng / mL em água fria de ácido cítrico a 10 mM, 10 ul aliquota).
  3. Composição HPSC mídia E8 Solution
    1. Prepare media utilizando alíquotas preparadas no Passo 1.2: DMEM / F12 (com L-glutamina e HEPES; 500 ml), bicarbonato de sódio (3,62 ml; final: 543 ng / ml), ácido L-ascórbico 2-fosfato (500 ul; finais : 64 ug / ml), selenito de sódio (100 ul; final: 140 ng / ml), transferrina (107 ul; final: 10,7 ug / ml), insulina (1 ml; final: 20 ug / ml), FGF2 (250 ul; final: 100 ng / mL), TGF-p1 (10 ul; final: 2 ng / ml).
    2. Combine todos os componentes, filtro de esterilizar e armazenar a 4 ° C por até 2 semanas.
  4. HPSC mídia E8 com Inibidor ROCHA
    1. Adicionar 15 mL de inibidor de rock para 12 ml de meio E8 preparadas como acima e misture bem. Certifique-se de que a concentração final é de 10 mM, após a adição de células / media no passo 3.7.
  5. Soluções de Stock de Wnt Moduladores
    1. Guarde as seguintes alíquotas a -20 ° C. CHIR 99021 (6-[[2-[[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(5​-methyl-1 H -imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethy​l]amino]-3-pyridinecarbonitrile; 10 mM em DMSO, 15 mL de alíquota). IWR-1 (4 (1,3,3a, 4,7,7a-hexa-hidro-1,3-dioxo-4,7-metano-2H-isoindol-2-il)-N-8-quinolinil-benzamida; 10 mM em DMSO, 6 mL de alíquota).
  6. Diferenciação de mídia
    1. Prepare mídia diferenciação # 1 com meio RPMI 1640 (com L-glutamina) com 2% de suplemento B27 menos insulina.
    2. Prepare mídia diferenciação # 2 com meio RPMI 1640 (com L-glutamina) com 2% de suplemento B27 mais insulina e 2% de FBS.
  7. Celular solução de lavagem fou cultura celular
    1. Use fosfato salino tamponado de Dulbecco (DPBS), sem cálcio ou magnésio.
  8. Solução de Lavagem celular para Citometria de Fluxo
    1. Utilize tampão fosfato salino (PBS, sem cálcio ou magnésio) com 1% de FBS. Armazenar a 4 ° C.
  9. Solução de Manutenção celular para Citometria de Fluxo
    1. Usar uma solução salina equilibrada de Hank (HBSS; sem cálcio ou magnésio) com 5% de FBS. Armazenar a 4 ° C.
  10. Soluções de Fixação de Citometria de Fluxo
    1. Use tampão Cytofix como solução de fixação de anticorpos TNNI3 e IRX4.
    2. Use paraformaldeído 4% em 1x PBS (fazer doce) como solução de fixação de anticorpos TNNT2 e MLC2a.
    3. Use 70% de metanol / 30% de acetona como solução de fixação de anticorpos MLC2v.
    4. Guarde todas as soluções a 4 ° C.
  11. Soluções para permeabilização Citometria de Fluxo
    1. Use Phosflow Perm Tampão III como solução de permeabilização fou anticorpos TNNI3 e IRX4. Guarde-o em temperatura ambiente (25 ° C).
    2. Use 0,2% de Triton X-100 em 1x PBS como solução de permeabilização de anticorpos TNNT2, MLC2v, e MLC2a. Armazenar a 4 ° C.
  12. Solução de Bloqueio
    1. Use 10% de soro de cabra em 1x PBS. Faça fresco e armazenar a 4 ° C até o uso.

2 Placa de Revestimento

  1. Lentamente descongelar uma alíquota de células estaminais embrionárias humanas matriz qualificada a 4 ° C durante 30 min, adicionar a 25 mL de DMEM refrigerada / F12 e misturar bem na cultura de tecidos esterilizadas capuz imediatamente antes revestindo placas de 6 poços.
  2. Adicionar 1 ml por poço de uma placa de 6 poços sob esterilizado capuz de cultura de tecidos (1 alíquota da matriz qualificada células estaminais embrionárias humanas é suficiente para o revestimento de quatro placas de 6 poços).
  3. Permitir matriz qualificada para definir células estaminais embrionárias humanas, durante 30 min à temperatura ambiente, sob o capô. Aspirar o excesso de matriz qualificado hESC e adicionar 2 ml de meio E8 com inibidor de rock para cada poço. Utilização placas imediatamente, ou se desIRED, armazenar a 4 ° C imediatamente após o plaqueamento, por até 1 semana e equilibrar à temperatura ambiente durante 30 minutos antes de usar.

3. Passaging e Manutenção de indiferenciadas hPSCs em monocamada Cultura

  1. Manter hPSCs em cultura em monocamada em placas de 6 poços e executar todas as etapas em um estéril capa de cultura de tecidos.
  2. Use linhas HPSC que estão bem estabelecidos (> p20) e exibem uma morfologia homogénea sem a presença de células com um neural, morfologia epithelial- ou do tipo fibroblastos. Assegurar que as células proliferam de forma robusta e, em média, a passagem a cada três dias a 75% de confluência, quando semeadas em 0,75 x 10 6 por bem.
  3. HPSCs passagem com dissociação para o nível de uma única célula, pelo menos 5x antes do início da diferenciação para assegurar a máxima eficiência de diferenciação. Para hPSCs passagem, meios aspirado E8 e lavar as células duas vezes com 4 ml de 1x DPBS (pré-aquecida até à temperatura ambiente). Adicionar 1 ml da desanexação celularsolução mento (pré-aquecida até à temperatura ambiente) a cada poço e o poço deixar em repouso durante 3-7 minutos, até os limites da célula começa a round-up.
  4. Usar uma pipeta de vidro ligado-algodão com bolbo para desalojar as células e transferir para um tubo de 15 ml contendo 1 ml de meio DMEM / F12 (para inactivar a solução desprendimento de células).
  5. Retirar 10 mL da solução alíquota de células e misturar com 10 ul de azul de tripano em um tubo de microcentrífuga. Contagem de células (por exemplo, automaticamente ou hemocitómetro Manual) enquanto restante de células são recolhidas por centrifugação a 130 xg durante 5 min à temperatura ambiente. Usando este protocolo, esperar 70-80% de viabilidade utilizando um hemocitômetro automatizada e vai para a frente, a base de todos os números de celulares na contagem de células totais.
  6. Aspirar mídia e ressuspender o sedimento de células em DMEM / F12 a uma concentração final de 0,75 x 10 6 células por 500 ul.
  7. Adicionar 500 ul da suspensão de células a cada poço de uma placa de 6 poços onde cada poço contains 2 media ml E8 com inibidor de ROCK, preparada no passo 2.3. Deixando placa na bancada, mova suavemente em células para frente e para trás e movimento lado-a-lado para dispersar uniformemente em toda a bem. Voltar células para incubadora com 5% de CO 2, 37 ° C.
  8. A partir de 24 horas após passaging, substituir a mídia diariamente usando 2 ml / bem E8 sem inibidor ROCK. Optimizar densidade de sementeira para atingir 100% de confluência antes do início da diferenciação. Semente de 0,75 x 10 6 células / poço quatro dias antes do início da diferenciação, mas optimizar para cada linha celular, conforme necessário.

4 Indução de cardiomiócitos hPSCs por modulação selectiva do Wnt Pathway

  1. Atualizar mídia (2 ml / poço) por dia durante os dias 0-7, e todos os outros dia após dia 8.
  2. No dia 0, iniciar o processo de diferenciação por substituir mídia E8 com media diferenciação # 1. Adicionar 1,2 mL de CHIR (6 uM final) a cada poço. Repita no dia 1.
  3. Nos dias 2-3, substitua por differen frescomídia ciação # 1.
  4. No dia 4, substituir com diferenciação fresco mídia # 1. Adicionar 1 mL IWR-1 (5 uM final) a cada poço. Repita no dia 5.
  5. Nos dias 6-7, troque com a diferenciação fresco mídia # 1.
  6. No dia 8, substituir com diferenciação fresco mídia # 2.
  7. Continue para substituir com a mídia diferenciação # 2 todos os dias durante o tempo desejado de cultura.
  8. Se desejar, cardiomiócitos de passagem utilizando a solução desprendimento de células seguindo os passos descritos em 3,3-3,6, mas substituindo a mídia com media diferenciação # 2. Durante passaging, dissociar cardiomiócitos em pequenos aglomerados de ~ 3-10 células. Semente em ~ 6 x 10 5 células por poço, utilizando células estaminais embrionárias humanas matriz qualificado poços revestidos e diferenciação mídia # 2.

5. coleta de células para citometria de fluxo

  1. Realizar todos os aspectos remanescentes de etapas 5-9 na bancada do laboratório (ou seja, não estéril).
  2. Aspirar o meio de crescimento e lavar as células duas vezes com PBS 1x.Adicionar 1 ml de solução de separação de células (pré-aquecida até à temperatura ambiente) a cada poço e deixar em repouso durante 3-7 minutos, até os limites da célula começa a round-up. Use um conectado-algodão vidro borosilicato descartável 9 "pipeta com o bulbo para desalojar as células e transferir para um tubo de 15 ml no gelo.
  3. Ao longo do restante do protocolo, a manter as células em gelo e realizar centrifugações a 200 xg durante 5 min a 4 ° C.
  4. Coletar as células por centrifugação e solução aspirado. Suspenda as células em 10 ml de solução de lavagem, utilizando uma célula de 10 ml com uma pipeta serológica trituração repetida para assegurar aglomerados de células são dispersos em células individuais. Contagem de células como na etapa 3.5, enquanto restante de células são recolhidas por centrifugação.
  5. Ressuspender as células em solução de lavagem de células, tendo cuidado para desagregar completamente pellet celular e alíquota de 1 x 10 6 culas por tubo de fundo redondo. Coletar as células por centrifugação e solução aspirado.

6. Fixação ePermeabilização de células para intracelular Antigen Coloração

  1. Adicionar solução de fixação 100 ul de sedimento celular. Adicionar solução gota a gota, com vórtice suave contínua e defina em gelo por 15 min.
  2. Adicionar 3 ml de solução de lavagem celular. Coletar as células por centrifugação e solução aspirado.
  3. Adicionar solução de permeabilização 100 ul de sedimento celular. Adicionar solução gota a gota, com vórtice suave contínua defina em gelo por 30 min. Use condições de fixação e permeabilização como delineado para cada anticorpo no Quadro 1.
  4. Adicionar 3 ml de solução de lavagem celular. Coletar as células por centrifugação e solução aspirado. Repetir para um total de duas lavagens após permeabilização.
Anticorpo primário (clone) Imunogénio / epítopo reconhecido Controle Istotype Valor de anticorpo primário por 1 x 10 6 células em 100 ul Solução de Fixação Solução permeabilização Anticorpo secundário Quantidade de anticorpo secundário / 1 6 x 10 células em 100 ul
Para medições por cento positivos Para Antigen quantificação
TNNI3 (284 (19C7) ISASRKLQL (humano) IgG2b 1,0 ug 3,0 mg BD Cytofix BD Phosflow perm III De cabra anti-IgG2b de ratinho-Alexa488 600 ng
TNNT2 (1C11) Comprimento total purificada proteína troponina T humana nativa. IgG1 1,0 ug 2,0 mg 4% PFA1% em PBS 0,2% de Triton X-100 em 1% PBS De cabra anti-IgG1 de ratinho - Alexa 488 600 ng
MLC2v (330G5) FDPEGKG IgG2a 2,0 mg 3,0 mg 70% de metanol / 30% de acetona 0,2% de Triton X-100 em 1% PBS De cabra anti-IgG2a de ratinho - Alexa 647 600 ng
MLC2a (4E7) comprimento total de proteína recombinante humana de MYL7 humana produzida em E. coli IgG1 0,5 ug 3,0 mg 4% de PFA em PBS 1% 0,2% de Triton X-100 em 1% PBS De cabra anti-IgG1 de ratinho - Alexa 488 600 ng
IRX4 LQEHRKNP
YPTKGEKI
MLAIITKM
TLTQVST 		IgG de coelho 0,5 ug 0,5 ug BD Cytofix BD Phosflow perm III Cabra anti-rabbit IgG-PE 600 ng

Tabela 1 Concentrações de anticorpos. Lista são o anticorpo primário, o clone (se monoclonais), concentrações e condições optimizadas de fixação e permeabilização para cada anticorpo primário e secundário utilizados para análises de citometria de fluxo. Como banco de concentrações de anticorpo pode variar entre os fornecedores do mesmo clone, as concentrações finais de cada anticorpo por um x 10 6 células num volume de ensaio fixo, em vez de diluições, são fornecidos. O imunogénio usado para gerar o anticorpo, ou epitopo reconhecido por um anticorpo, como fornecido pelo fabricante, é listado, mas não se verificou experimentalmente aqui.

7 Antibody Coloração

  1. Para cada experiência, inclui um controlo não corado por fixação condição / permeabilização e o controlo de isotipo adequado para cada anticorpo primário utilizada. Incluir tipos de células não-cardiomiócitos como controles negativos (por exemplo, células estaminais pluripotentes ou fibroblastos). Use controlos isotípicos na mesma concentração que o correspondente anticorpo primário (ver Tabela 1).
  2. Ressuspender as células em 100 ul de bloqueio solução usando uma pipeta para desagregar células P200. Definir as amostras em gelo durante 25 min com suave balanço.
  3. Sem retirar solução de bloqueio, adicione o anticorpo primário ou controle isotipo acordo com as diretrizes da Tabela 1. Incubar 45 min no gelo com balanço suave.
  4. Adicionar 3 ml de solução de lavagem celular. Coletar as células por centrifugação e solução aspirado. Repetir para um total de duas lavagens após marcação com anticorpos primários.
  5. Se um anticorpo primário fluoróforo conjugado é usado, vá para o 8.1. Quando um anticorpo primário não conjugado é utilizado (por exemplo, para todos os marcadores descritos aqui), efectuar marcação com anticorpo secundário que está conjugado com um fluoróforo, como se segue.
  6. Ressuspender as células em 100 ul solução de bloqueio, utilizando uma pipeta de P200 a DISAcélulas ggregate.
  7. Adicionar anticorpo secundário por diretrizes na Tabela 1. Incubar 30 min no gelo com balanço suave.
  8. Adicionar 3 ml de solução de lavagem celular. Coletar as células por centrifugação e solução aspirado. Repetir para um total de duas lavagens após marcação com anticorpos secundário.

8 Preparação de células para citometria de fluxo

  1. Ressuspender as células em 400 mL solução de manutenção de células utilizando uma pipeta P1000 desagregar células.
  2. Prepare uma tampa filtro de células em um tubo de fundo redondo de pré-umedecimento com solução de manutenção de células 50 ul. Definir o tubo em gelo. Utilizar o tampão filtro celular para evitar agregados celulares de entupimento do citómetro de fluxo.
  3. Transferir a solução de célula para célula tampão filtro e permitir a suspensão de células a drenar pela força da gravidade. Toque inferior do tubo suavemente no topo da bancada, como necessário para que as células são recolhidas em tubos e recuada em gelo, tão rapidamente quanto possível. Coador de enxaguamento com a manutenção de células de 250 ul de modolução para garantir a recuperação máxima de células.
  4. Manter as células em gelo, e protegido da luz até serem analisadas por citometria de fluxo.

9 Análise do Fluxo Citometria

Configurações detalhadas aquisição irá variar entre os instrumentos. Parâmetros fundamentais a serem considerados para a coleta de dados ideal são descritos abaixo.

  1. Para a estabilidade de fluxo óptima, assegurar que o tamanho do bocal excede 5-6x o diâmetro da célula a ser analisado.
    NOTA: Isto pode variar entre os instrumentos, mas é uma consideração importante, tanto para os analisadores e selecionando tamanho do bico adequado para separação de células. O diâmetro médio de 10 dias cardiomiócitos é de 11 um (variando 8-14 mm); Assim, um tubo de injecção de 150 um padrão de amostra num analisador funciona bem.
  2. Imediatamente antes da análise de dados, cada um dos tubos de vórtice brevemente para dispersar os agregados celulares.
  3. Otimizar a frente e ajustes de tensão dispersão lateral para cada tipo de célula com base emcontrolo não corado, para cada condição de fixação / permeabilização utilizado na experiência de modo a que as populações de interesse são em escala e centrado (Figura 2A).
    1. Manter essas configurações ao longo de um único experimento e ser consistente de experimento para experimento no mesmo instrumento, como mudanças significativas podem indicar possíveis problemas com o citômetro de fluxo ou de preparação da amostra.
  4. Para cada fluoróforo, analisar o isotipo controle e ajuste de tensão do laser apropriado para determinar a intensidade mínima necessária para obter um histograma de fluorescência que exibe margens tanto esquerda e direita do pico. Manter as configurações de laser para cada isotipo controle na aquisição de dados em amostras marcadas com o anticorpo correspondente.
    NOTA: O sinal deriva muitas vezes ocorre ao longo do tempo no mesmo instrumento. É crítico para ajustar as configurações de laser no início de cada experiência com base no controlo de isotipo adequado.
  5. Recolha um mínimo de10.000 eventos. São preferidos 50.000 eventos.
  6. Para análise estatística, portão da população de células vivas para excluir detritos (Figura 2A). Determinar a percentagem de células positivas na população fechado com base no posicionamento de marcador que permite ≤2% contribuição de controlo de isotipo, como mostrado na Figura 2B, C.

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Representative Results

No dia 0, as células são 100% confluentes com morfologia compacta e os detritos celulares mínima. Nos dias 1-2, é comum observar-se morte celular significativa (40-50%), mas as células anexadas reterá morfologia compacto (Figura 1A). Durante este tempo, a mídia é laranja e turva. Meios-de-rosa indica morte excessiva de células, e, neste caso, confirmar com azul de tripan e interromper se a morte celular superior a 70%. As células irão recuperar durante 3-4 dias e vai aumentar a densidade. Durante os dias 5-6, a morte celular ocorre mínima e manchas densas podem começar a aparecer. Por 7-8 dias, uma monocamada confluente é conseguido com morfologia compacto intercaladas com manchas densas. As células começam a contrair espontaneamente por dia 8 e as primeiras contrações, muitas vezes, ser visível nas manchas densas. De dia 10, a contração mais forte é observado e continue a se espalhar por toda a cultura nos dias subseqüentes. Coloração imunocitoquímica para α-actinin e TNNT2 estrutura show de sarcômero(Figura 1A). Conforme medido pelo tempo real de reacção em cadeia da polimerase quantitativa (qRT-PCR), os níveis de mRNA de marcadores de referência de mesoderme e de exibição compromisso cardiomiogênica perfis temporais como esperado (Figura 1B), com a expressão robusta da proteína cardíaca marcadores homeobox Nkx-2.5 (NKX2.5 ), TNNI3, MLC2a, MLC2v e miosina-6 (MYH6). Muito baixo para níveis não detectáveis ​​de músculo liso (miosina de cadeia pesada 11, MYH11) e do músculo esquelético (miogenina, MYOG) marcadores são de rotina. Em consonância com o desenvolvimento precoce onde a expressão é observada tanto no músculo cardíaco e esquelético, antes de ser restrito para o músculo esquelético no adulto 20,27,28, troponina isoformas TNNI1 e TNNI2 são robustamente detectados durante os dias 7-8.

Consistente com outros relatos, isso em estratégia de diferenciação vitro gera cardiomiócitos com características de células progenitoras cardíacas precoces (morfologia arredondada, co-expressão de MLC2a, MLC2v) 19 30,32. Em citometria de fluxo, os perfis de dispersão de luz varia de acordo com os tipos de células e alterar consideravelmente entre fixação / condições de permeabilização (Figura 2A). Nestas diferentes condições de preparação celular, citometria de fluxo análise revela controles isotipo com picos de solteiro com uma clara distinção entre o controle isotipo e anticorpo (Figura 2B). As células pluripotentes ou outras células não-cardiomiócitos são negativas para os marcadores utilizados aqui.

Usando este protocolo de diferenciação e de coloração, a população de células resultante é tipicamente 99% TNNI3, 96% IRX4 +, 91% MLC2v +, e 96% MLC2a + no dia 10 de diferenciação tal como medido por citometria de fluxo. Células 99% TNNT2 + são observadas (Figuras 2C, 2D), mas, como acima descrito, não é único TNNT2de cardiomiócitos durante o desenvolvimento e, portanto, a afirmação de que as células são 99% cardiomiócitos autênticos por dia 10 é baseada em proteína TNNI3. Note-se que com a cultura continuada para além de 10 dias, os níveis de proteínas de proteínas estruturais permanecerá elevada, embora os níveis de expressão de genes em relação diminuirá em relação ao pico de expressão, como monitorizado por qRT-PCR, consistente com a estabilidade da proteína e as taxas de turnover de 3,2 e 3,5 dias, respectivamente, para TNNI e TNNT 33. Um exemplo desta observação é mostrado para TNNT2 (expressão de mRNA de pico no dia 11 (Figura 1B), os níveis da proteína no dia 20 + robustos (Figura 2E).

Figura 1
Figura 1 esquema geral de diferenciação dos cardiomiócitos de hPSCs e dados representativos. (A) Esquema de cardiomiócitos differentiatio n protocolo anotado com estágio correspondente de linhagem e / ou compromisso destino celular. Imagens de contraste de fase de representação de células nas principais etapas do processo de diferenciação. Escala da barra = 10 m. Extrema direita = imagem imunocitoquímica de α-actinin (verde) revestida com TNNT2 (vermelho) e núcleos (azul). (B) Análise de qRT-PCR (para o conjunto de teste, consulte a tabela de Materiais), de 18 de mesoderme referência e marcadores de desenvolvimento cardíaco durante os primeiros 17 dias de diferenciação. Todos os dados são uma média de três réplicas biológicas cada analisadas em triplicado, em que as barras de erro representam o erro padrão da média, e são normalizados para a actina (ACTB). Níveis de mensagens para todos os momentos são em relação ao primeiro dia de diferenciação, onde os valores de Ct são detectáveis ​​(ie Ct <35). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

t "fo: manter-together.within-page =" always "> Figura 2
Figura 2 Caracterização dos cardiomiócitos por citometria de fluxo e eletrofisiologia. (A) perfis de dispersão de luz de dia 10 cardiomiócitos hiPSC derivadas sob várias condições de fixação e permeabilização. 50.000 eventos foram recolhidas ea população fechado (ou seja, excluindo os detritos) utilizado para análises estatísticas é mostrado em vermelho. (B) Histograma de IRX4 no dia 10 de diferenciação por meio de três condições de fixação / permeabilização diferentes, ilustrando as diferenças de coloração eficiência entre os métodos. Inserções mostram diferenças na coloração de IRX4 sobre hiPSCs usando cada condição. Estes dados ilustram por metanol / acetona é evitada por IRX4 devido à baixa, mas detectáveis, de coloração em hiPSCs. (C) Os histogramas de TNNI3, TNNT2, MLC2v, MLC2a no dia 10 de differenti ção usando condições de coloração optimizadas para células máximas percentuais positivos descritos na Tabela 1 (D). histogramas de TNNT2 a partir de experiências de titulação de anticorpos, que ilustra que 0,5 ug é o valor mínimo exigido para a medição de células 99% TNNT2 +, mas que 2 mg é o ponto de saturação necessária para a quantificação. Apenas um único isotipo de controlo é mostrada, mas experiências de titulação são calculadas com base na comparação de cada anticorpo ao seu titulação de controlo de isotipo correspondente. (E) A quantificação de proteínas em cardiomiócitos TNNT2 nos dias 0-24 de diferenciação, representada como a diferença de intensidade de fluorescência mediana entre o anticorpo e o controlo de isotipo para cada ponto de tempo (F) potencial. acção registada a partir de uma única cardiomiócitos ventriculares semelhante contracção espontânea no dia 46 de diferenciação de células usando o conjunto de aperto de configuração actual da técnica de sujeição do emplastro.es / ftp_upload / 52010 / "target =" 52010fig2highres.jpg _blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Name Company Catalog Number Comments
Cell Culture
BD Matrigel, hESC-qualified matrix BD Biosciences 354277
Accutase cell detachment solution Stem Cell Technologies 7920
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium Life Technologies 14190-136
Dimethyl sulfoxide (DMSO, Hybri-Max, sterile-filtered) Sigma Aldrich D2650
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich 53817
Citric acid Sigma Aldrich C2404-100G
Y-27632 dihydrochloride selective p160ROCK inhibitor R&D Systems 1254
L-Ascorbic acid-2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate Sigma Aldrich A8960-5G
Sodium selenite Sigma Aldrich S5261-10G
Transferrin (Optiferrin – Defined, Animal-free, Recombinant Human) Invitria 777TRF029
Fibroblast growth factor 2 (FGF2) R&D Systems 4144-TC-01M
Transforming growth factor beta 1 (TGFβ1) Peprotech 100-21
DMEM/F12 with L-Glutamine and 15 mM HEPES Life Technologies 11330-032
Insulin Sigma Aldrich I9278-5ML
CHIR-99021 HCl Sellekchem S2924
IWR-1 Sigma Aldrich I0161
RPMI 1640 with L-Glutamine Life Technologies 11875-093
B-27 Supplement Minus Insulin Life Technologies A1895601
B-27 Supplement (with Insulin) Life Technologies 17504-044
Fetal bovine serum Life Technologies 10437
Flow Cytometry Reagents
Phosphate buffered saline (10x) Quality Biological Inc. 119-069-151
Hank's balanced salt solution without Ca2+ and Mg2+ Life Technologies 14175-095
BD Cytofix BD Biosciences 554655
BD Phosflow perm buffer III BD Biosciences 558050
16% Paraformaldehyde Thermo Scientific 28906
Methanol Sigma Aldrich 179957-4L
Acetone Mallenckrodt Chemicals  2440-16
Triton X-100 Amresco M236-10ML
Goat serum Life Technologies 16210-064
Trypan blue solution, 0.4% Life Technologies 15250-061
Materials
5 ml Round bottom polystyrene tube (without cap) Corning 352008 For preparation of cells for flow cytometry
5 ml Round bottom polystyrene tube (with 35 µM cell strainer snap cap) Corning 352235 For preparation of cells for flow cytometry
2 ml rubber bulbs Fischer Scientific 03-448-24
9" borosilicate unplugged glass Pasteur pipets BioExpress P-2904-2
0.65 ml Microcentrifuge tubes, graduated, green GeneMate C-3259-G
1.5 ml Microcentrifuge tubes, graduated, red GeneMate C-3260-R
TC20 automated cell counter BioRad 145-0102
Counting slides for TC20 BioRad 145-0011
6-well Flat bottom tissue-culture treated plate Corning 353046
20 ml Syringes BD Plastipak 300613 For filter sterilization of aliquots
Sterile syringe filters, 0.2 µm polyethersulfone VWR 28145-501 For filter sterilization of aliquots
250 ml Filter system, 0.22 µm polyethersulfone, sterilizing, low binding Corning 431096 For filter sterilization of bulk media 
500 ml filter system, 0.22 µm polyethersulfone, sterilizing, low binding Corning 431097 For filter sterilization of bulk media
Antibodies and Isotype Controls
Anti-TNNI3 (clone: 284 (19C7)) Abcam ab19615 Primary antibody
Anti-TNNT2 (clone: 1C11) Thermo Scientific MA1-16687 Primary antibody
Anti-MYL2 (MLC2v, clone: 330G5) Synaptic Systems 310111 Primary antibody
Anti-MYL7 (MLC2a, clone: 4E7) Abcam AB131661 Primary antibody
Anti-IRX4   Bioss BS-9464R Primary antibody
Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG1  Life Technologies A21121 Secondary antibody
Alexa Fluor 647 Goat anti-mouse IgG2a Life Technologies A21241 Secondary antibody
Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG2b Life Technologies A21141 Secondary antibody
Phycoerythrin(PE) Goat anti-rabbit IgG R&D Systems F0110 Secondary antibody
Mouse IgG1 BD Biosciences 557273 Isotype Control
Mouse IgG2a eBiosciences 16-4724-81 Isotype Control
Rabbit IgG-PE R&D Systems IC105P Isotype Control
TaqMan Probesets for qRT-PCR
ACTB Life Technologies Hs01060665
Brachyury T Life Technologies Hs00610080
CASQ2 Life Technologies Hs00154286
IRX4 Life Technologies Hs01100809
ISL1 Life Technologies Hs00158126
MESP1 Life Technologies Hs01001283
MYH11 (SMMHC) Life Technologies Hs00224610
MYH6 Life Technologies Hs01101425
MYL2 (MLC2v) Life Technologies Hs00166405
MYL7 (MLC2a) Life Technologies Hs01085598
MYOG Life Technologies Hs01072232
NKX2.5 Life Technologies Hs00231763
NPPA Life Technologies Hs01081097
POU5F1 Life Technologies Hs04260367
SOX17 Life Technologies HS00751752
TNNI1 Life Technologies Hs00913333
TNNI2 Life Technologies Hs00268536
TNNI3 Life Technologies HS00165957
TNNT2 Life Technologies Hs00165960

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References

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