Introduction
Das Ziel dieser Methode ist es, einfach zu quantifizieren einen neuen Aspekt des einfachen Sozialverhalten in Drosophila melanogaster, von Balz und Aggression unabhängig.
Soziale Interaktionen sind entscheidend für die richtige Entwicklung und Gesundheit von Personen innerhalb der Gesellschaft, sowie die Funktionalität einer sozialen Gruppe als Ganzes. Die hohe Komplexität dieser Wechselwirkungen erfordert große Probengrößen und ein System zur Vereinfachung des Verhaltens ermöglicht, da die genetischen und neuronalen Basen des Sozialverhaltens sind noch weitgehend unverstanden. Drosophila melanogaster ist eine leistungsfähige genetischen Modells, das verwendet werden kann, die genetisch zu identifizieren und Neuronale Grundlagen der sozialen Interaktionen. In der Tat, D. melanogaster hat ein Repertoire von komplexen sozialen Verhaltensweisen und einige direkte Messungen der Sozialisation bereits getan 1-7. Allerdings sind die meisten dieser Bemühungen sind auf relativ komplexe soziale Verhaltensweisen wie aggres fokussiertsive Wechselwirkungen 3,6, verschiedene Aspekte der Balz 3,8-12 und wie soziale Erfahrung wirkt sich auf andere Verhaltensweisen wie Lernen oder zirkadianen Rhythmus 13-17. Darüber hinaus sind viele dieser Tests beruhen auf der Analyse komplexer Wechselwirkung Muster Gruppen entfernt, unter Verwendung von Videoverfolgung und Computersoftware, um die resultierende Datenfülle analysieren. Solche Analysen sind von unschätzbarem Wert, und führen zu wichtigen neuen Erkenntnissen, wie die Dynamik der Fly-Fly-Interaktionen in der Gruppe 7. Eine Einschränkung, jedoch ist die Unzugänglichkeit dieser Tests in die Gemeinschaft zu groß, und die begrenzte Kenntnis der Mechanismen Anerkennung der anderen zugrunde liegen. In anderen Worten ist die Basis der Emission eines Signals von einem Individuum und seiner Erkennung durch eine andere noch schlecht verstanden 18.
Die D.: Im Gegensatz dazu fliegt auch eine einfache Verhalten, soziale Vermeidung, in denen Menschen weg von einem Signal, das durch betonte Fliegen emittiert zeigen Melanogaster Belastungsriechstoff oder DSO-19. In einem Assay mit hohem Durchsatz, kann dieses Verhalten, wie die Vermeidung eines durch andere entfernt oder soziale Vermeidungs 19 emittiert Spannungssignals quantifiziert werden. Fliegen werden in einem T-Labyrinth-Vorrichtung platziert und die Wahl haben, eine Ampulle, die DSO vermeiden. Unter Verwendung dieses Assays, CO 2 wurde gezeigt, dass ein Bestandteil des DSO, und ein Teil der neuronalen Schaltkreise erforderlich, reagieren zu CO 2 wurde 19 zerlegt werden.
Die soziale Vermeidung Test hier dargestellten ähnelt vom Konzept her an die einfachen Verhaltenstests in Seymour Benzer Labor entwickelt, die Generationen von Forschern ermöglicht, komplexe Verhaltensweisen 20 sezieren. Analyse sozialer Vermeidung kann kostengünstig unter Verwendung des T-Labyrinth-Test, so dass für mehr verbreitet Studie des Sozialverhaltens durchgeführt werden. Zum Beispiel mit diesem Test haben wir vor kurzem gezeigt, dass verschiedene genetische Risiken für Autismus gegenläufigen Effekten in sozialen behavior Assays. Mutanten für ein Kandidatengen für Autismus - Neurobeachin 21,22 - heute Mängel sowohl im sozialen Raum (an anderer Stelle 23 beschrieben) und soziale Vermeidung 24. Abnormal dopaminergen Signal wird auch vorgeschlagen, eine Rolle bei der Entstehung von Autismus bei Menschen 25,26 zu spielen. Im Gegensatz zu den mit Neurobeachin erzielten Ergebnisse haben wir festgestellt, dass soziale Vermeidung Leistung war unberührt erhöht oder gesenkt Ebenen der Drosophila Vesicular Monoamin-Transporter (VMAT) in dopaminergen Zellen, wenn auch sozialen Raum wurde direkt mit diesen Ebenen VMAT 27 korreliert. Die mit Neurobeachin und VMAT erhalten kontras Ergebnisse unterstreichen die Möglichkeit zur Identifizierung verschiedener Formen von asoziales Verhalten und damit die verschiedenen zugrunde liegenden neuronalen Schaltkreise Modulation der Reaktion auf andere.
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Protocol
1. Geräte und Reagenzien Erstellt Inhouse (Siehe Liste der Materialien für andere)
- Bereiten Sie eine Drosophila kalten Narkosegerät zu fly Arbeit zu verrichten.
- Schneiden Sie einen porösen Polyethylenfolie, eine kleine Plastikdose (12,7 cm lang, 10,2 cm breit), in der Regel die obere Abdeckung des Pipettenspitzen-Box (12,7 cm lang, 10,2 cm breit, 3,8 cm tief) zu decken.
- Füllen Sie das Feld mit Crushed Ice, decken mit der porösen Polyethylenfolie.
- Bereiten Sie einen T-Labyrinth Apparate; Anpassung der zuvor im Detail 28-31 beschriebenen Vorrichtung.
- Bereiten Sie eine Fliege Aspirator wie beschrieben 32.
- Bereiten Sie eine Phototaxis Antwortgerät um Fliegen in und aus dem Teströhrchen ohne Stress zu versetzen:
- Verwenden Sie einen Gegenstromapparat, wie von 29,33 beschrieben.
HINWEIS: Der T-Labyrinth kann auch für andere Zwecke verwendet werden, wie von 28 beschrieben.
- Stellen Sie sicher, homogeneous Lichtbedingungen: führen Sie das Experiment auf einer Bank mit einer weißen Bank Deckel abgedeckt und vor einem weißen Brett.
HINWEIS: Für diese Experimente waren die Fliegenstämme verwendet Drosophila melanogaster Wildarten: Canton-S, Oregon und Samarkand fliegt von unserem Labor-Aktien 34; Elwood Fliegen wurden im Herbst 2011 in der Nähe von Elwood Huntington auf Long Island, New York, USA gesammelt.
2. Vorbereitung der Fliegen vor dem Experiment
1-2 Tage vor der Durchführung des Experiments:
- Pflegen Fliegen auf Standard-Maismehl-Agar-Melasse-Hefe-Medium bei 25 ° C auf einem 12 Stunden Licht / Dunkel-Zyklus.
- Sammeln Sie die Antwort Fliegen unter kaltem Anästhesie 1-2 Tage vor der Durchführung des Experiments
- Übertragen die entfernt von den Flaschen, in denen sie in 50 ml-Falcon-Röhrchen aufgewachsen, mit einem Trichter.
- Legen Sie die Falcon-Röhrchen mit den Fliegen unter Eis Ebene, in einisolierten Eiskübel.
- Setzen Sie den kalten Narkosegerät mit zerstoßenem Eis bei -4 ° C zu kühlen.
- Warten Sie 5 Minuten für die Fliegen eine Chill Koma zu gelangen.
- Übertragen Sie die Fliegen auf den porösen Polyethylenfolie des kalten Narkosegerät.
- Sammeln Sie die Responder-Fliegen auf dem kalten Narkosegerät. Bei RT unter einem Stereomikroskop, trennen 3-7 Tage alten männlichen von den weiblichen Fliegen und pflegen diese Fliegen in Gruppen von 40.
- Sammle die Emitter entfernt 1-2 Tage vor der Durchführung des Experiments.
- Vorsichtig sammeln Canton-S gemischtgeschlechtlichen fliegt aus ihren Flaschen, mit einem Mund Sauger, Controlling für ihre Zahl.
- Halten Sie diese Fliegen in Gruppe von 60 bis 100, da sie die Emitter sein.
- Als Datenpunkte benötigt Bereiten so viele Proben von Emittern.
- Lassen Sie mindestens eine Nacht der Erholung nach Sammlung der Responder und Strahler, um jede Verwechslung Wirkung der kalten Anästhesie minimierenund Mund Sauger Sammlung auf das Verhalten.
- Öffnen Sie den Beutel von Test-Fläschchen, um die veraltete Plastik riechende Luft in der Tasche zu ermöglichen, durch die frische Luft mindestens 1 Tag vor dem Experiment ersetzt werden.
2 Stunden vor der Durchführung des Experiments:
- Sicherzustellen, dass die Temperatur in dem Raum, in dem der Versuch durchgeführt wird, liegt bei etwa 23-25 ° C, mit noch Licht und Luftfeuchtigkeit über 30%.
- Übertragen Sie die Responder und Emittern Fruchtfliegen in die frische Lebensmittel Fläschchen um sicherzustellen, dass diese Fliegen nicht verhungert.
- Lassen Sie die Fruchtfliegen der Anpassung an die Umgebung für 2 Stunden, auf die Bank, auf der das Experiment durchgeführt werden.
3. Die Durchführung der Sozial Vermeidung Experiment
- Führen Sie jeden Versuch zur gleichen Zeit des Tages, in einem Bereich von 3-4 Stunden am Nachmittag zwischen den Zeitgeber Zeit ZT5 und ZT9.
- Legen Sie das T-Labyrinth auf dem Pochen-Pad, und ziehen Sie die Schraube Clip so tEr Aufzug ist stabil.
- Übertragen Sie die Responder-Fliegen in ein frisches Probenröhrchen. Snap dieses Fläschchen mit der Responder Fliegen auf den oberen Teil des T-Labyrinth.
- Neigen die T-Labyrinth Gerät und tippen Sie auf die Matte hämmerte so dass die Fruchtfliegen in den Aufzug zu fallen.
- Bewegen Sie den oberen Teil der Aufzug nach unten, so dass die Fliegen sind zwischen dem oberen und unteren Teil des T-Labyrinth, aber achten Sie auf den Aufzug über der Wahl Punkt halten - um die Fliegen an der Flucht zu verhindern.
- Erhalten Fläschchen mit DSO (siehe Abschnitt 5, um DSO freien Phiolen, die zuvor von Fliegen besetzt waren zu generieren).
- Während die Responder-Fliegen sind an dieses neue Umfeld Anpassen, legen Sie die Sender Fliegen in einem Testfläschchen.
- Legen Sie ein Stück Baumwolle, das Fläschchen zu schließen, damit die Fruchtfliegen nicht entkommen.
- Mechanisch agitieren diese Phiole auf einer Mini-Wirbel wie folgt: Vortex für 15 Sekunden, entfernen Sie das Röhrchen aus dem Vortex für 5 Sekunden. Wiederholen 3 mal für insgesamt 55 sec.
- Remove die Emitter-Fliegen aus der frischen Flasche - durch die Übertragung in einem Lebensmittel Flasche - und schnell platzieren dieses DSO gefüllten Fläschchen in einer der beiden Seiten des T-Labyrinth Gerät.
- Wechseln auf die Seite der Platzierung für die DSO-gefüllten Flasche in jedem neuen Durchlauf.
- Legen Sie einen neuen Testfläschchen auf der anderen Seite des T-Labyrinth.
- Bringen Sie mit dem Aufzug ganz nach unten, so dass die Fruchtfliegen können zwischen der neuen Testfläschchen und der Testflasche mit DSO gewählt haben, und starten Sie den Timer.
- Lassen Sie die Fliegen zwischen der frischen Ampulle und dem DSO Fläschchen wählen, für 1 min, sofern nicht anders angegeben.
- Nach 1 min, bewegen Sie den Aufzug nach oben, um die Fliegen an der frischen Ampulle, DSO Fläschchen, und die im Aufzug stecken zu trennen.
- Zähle die Anzahl der Fliegen in jedem Fläschchen und in den Aufzug.
- Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden Genotyp / Zustand.
4. Analyse der Social Vermeidung Daten
- Die Anzahl der Fruchtfliegen in jedem Fläschchen für jeden genotyp, und die Daten in eine Tabellenkalkulation.
- Mit einem Tabellenkalkulationsprogramm, berechnen Sie die Performance Index (PI) für jeden Genotyp durch Subtraktion der Anzahl der Fliegen in der DSO-Fläschchen aus der Anzahl der Fliegen in der DSO-freie Fläschchen und dann dividiert durch die Gesamtzahl von Fliegen.
- Vergleichen Sie die PiS "bedeutet unter Verwendung statistischer Analysesoftware für die Analyse der Ergebnisse.
- Im Idealfall vorbereiten 2-3 internen Wiederholungen für jedes Experiment, und 3 unabhängige Wiederholungen, durchgeführt an verschiedenen Tagen mit verschiedenen Flaschen oder überschreitet 30.
- Verwenden Gauß-Verteilung statistische Tests, da die Daten einer Normalverteilung folgen.
- Bei der Prüfung von einem Effekt (dh Dichte - Abbildung 2), mit einem Einweg-ANOVA mit Post-Test für Mehrfachvergleich (spaltenweise) oder einem einfachen t-Test, um jedes Ergebnis einer Kontrolle zu vergleichen.
- Als Gruppe Experimente durchgeführt werden, beide Bedingungen zu testen und Geschlechter (leer Fläschchen, betonte eind unbelasteten Fliegen; und Gender-Effekt - Abbildung 1), mit einem Zwei-Wege-ANOVA.
5. Generieren Vials Zuvor von Unbetonte Fliegen besetzt - Führen statt 3,5-3,6
- Verwenden Sie Phototaxis zu Fläschchen von Fliegen, die nicht hervorgehoben wurden, belegt vorzubereiten, als Kontrolle.
- Übertragen Sie die Fliegen in einem Probenröhrchen, und lassen Sie sie in die Gegenstromapparatur, mit frischen leeren Ampullen in die entgegengesetzte Position.
- Legen Sie das Gerät waagerecht mit dem distalen Fläschchen unmittelbar vor einer 15 W Leuchtstoff kühl-weißes Licht, und mit einem schwarzen Tuch.
- Lassen Sie die Fliegen leicht an der frischen Röhrchen zu bewegen. Dies kann einige Minuten dauern. Nachdem die meisten der Fliegen in Richtung auf das Licht in dem distalen Fläschchen Fuß, den Zeitmesser für 1 min.
- Entfernen Sie vorsichtig die schwarzen Tuch, schalten Sie den Ort des Licht, gewinnen mit der schwarzen Tuch, und lassen Sie die Fliegen um den Test Fläschchen zu verlassen.
- Zu diesem Zeitpunkt initiate die Wahl Experiment wie in 3.2 bis 3.5. Zum 3.6 und 3.7.
- Schieben Sie den Regler des Geräts, um die Fliegen, die den Test Fläschchen von der anderen Seite verlassen zu trennen.
- Verwenden Sie die frei gewordenen Testfläschchen in der T-Labyrinth sofort für die Wahl Experiment, wie in 3.7.
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Representative Results
Die soziale Vermeidung Assay ist eine robuste Test Quantifizierung der Fähigkeit von Drosophila melanogaster, um eine Belastungssignal zu erkennen (DSO) von anderen Fliegen emittiert und damit die Beurteilung ein Aspekt der sozialen Interaktionen. Der Test wird durchgeführt unter Verwendung einer Vorrichtung üblicherweise in verschiedenen Verhaltenstests, wie einem T-Labyrinth, das die Fliegen mit einer Wahl zwischen zwei verschiedenen Optionen zu präsentieren bekannt verwendet - links oder rechts 19,28-31. In diesem Fall wird die Effizienz, mit der die Fliegen vermeiden DSO durch Berechnen und Vergleichen der Leistungsindex (PI) quantifiziert. Ein PI-Null gibt eine 50-50 Verteilung oder keine Vermeidung, während ein PI von 100 gibt an, dass alle Fliegen vermieden DSO. Und ein PI von -100 würde bedeuten, dass alle Fliegen ging in das DSO Fläschchen.
Die Fliegen werden mit einer Ampulle, die DSO durch mechanisch bewegte Fliegen emittiert präsentiert und eine frische (DSO frei) Fläschchen. Repräsentative Ergebnisse präsentiert hier unterstreichen die strength dieses Assays, wie auch einige bekannte Bedingungen notwendig, um optimale Ergebnisse zu erhalten.
Vermeidung von DSO ist nicht geschlechtsspezifische, sondern hängt von Fliegen wird hervorgehoben. Das Geschlecht der Antwortlinie hat keine Auswirkung auf das Vermeiden von DSO (Abbildung 1). Es ist jedoch nicht ausreichend für Fliegen, um den Test Fläschchen, eine Vermeidung dieser Fläschchen entlocken belegt haben, müssen die Fliegen bereits betont haben - in diesem Fall mechanischer Bewegung (Abbildung 1). Wenn keine Fliegen hatte den Test Fläschchen besetzt ist oder wenn die Fliegen haben betreten und verlassen Sie das Fläschchen ohne Stress mit Phototaxis, die Responder entlocken keine Präferenz, wie zuvor berichtet 19.
Obwohl 1 reproduziert bekannten Ergebnissen ist auch ein Beispiel für die Art von Daten mit suboptimalen Bedingungen erhalten. Mit nur 2 bis 5 interne Wiederholungen und keine unabhängigen Studien, die Fehlerbalken stellen den Bereich. Es besteht jedoch ein erheblicher unterscheidenrenz zwischen Fläschchen vorher durch betonte Fliegen und nicht gestressten Fliegen oder leer besetzt, wie bereits berichtet 19. In diesem Zusammenhang zeigen die Fliegen immer noch eine starke PI der Vermeidung. Dies unterstreicht die Robustheit des Assays. Darüber hinaus ist der PI für die Wahl zwischen zwei frische Fläschchen negativ (verschieden von 0, für Frauen p <0,05, und gepoolt sex p <0,01). Dies deutet auf eine Präferenz für eine Seite des T-Labyrinth oder einer Vorspannung aufgrund einer kleinen Probenmenge. Diese Einschränkung kann durch Wechseln der Seite, auf der die Probenröhrchen auf dem T-Labyrinth in den inneren Wiederholungen angeordnet, wie in den nachfolgenden Experimenten dargestellt geschehen begegnet werden.
Trotz des Mangels an Sex-Effekt in der Antwort auf die DSO wurden Responder nach Geschlechtern getrennt, um mögliche Störfaktoren Effekte zu verhindern. Zum Beispiel im Falle von Mutationen, die geschlechtsspezifische Wirkungen, wie diejenigen beeinflussen Gene in olfaktorischen Signal 36 auswirken könnte. Die folgenden Vertre ve Ergebnisse konzentrieren sich auf männliche Responder und gemischten Geschlechts-Strahler.
Vermeidung von DSO ist unabhängig von der Anzahl der Antwortlinie getestet.
Frühere Experimente 19 haben einen Standard von 40 Canton-S fliegt in die Prüfung der sozialen Vermeidung, die eine hohe PI zeigte verwendet, was darauf hinweist, dass die meisten Fliegen bevorzugt die frische DSO freie Fläschchen. Um den Effekt der Gruppengröße in der PI der Responder zu testen, wurde ein Bereich von 10-80 entfernt untersucht, wie in Abbildung 2 zu sehen ist. Ein Minimum von zwei unabhängigen Versuchen und drei interne Wiederholungen pro Versuch wurde durchgeführt. Ein t-Test zeigte keine statistische Signifikanz beim Vergleich der PI von jeder der unterschiedlichen Anzahl der Responder Fliegen auf den Performance-Index des Steuer (vierzig Responderlinie). Somit muss die Anzahl der Antwortlinie keine Wirkung auf den PI-DSO Vermeidung und der Effekt, dass Mutationen zur Vermeidung getestet werden kann, selbst wenn Mutanten sind in kleinen Stückzahlen.
ent "> Höhere Anzahl von Emittern fliegt, führt zu höheren Vermeidung von DSO.Um das Ausmaß, in dem die Anzahl der Emitter Fliegen betroffen DSO und ihre Vermeidung zu bestimmen, haben wir auch untersucht die Auswirkungen der Höhe der betonte Fliegen. In den vergangenen Experimenten 19 und diesem Protokoll haben einen Standard von 70 Canton-S Fliegen verwendet. Wir haben jetzt getesteten 10 bis 160 Emitter entfernt (Figur 3). Die Leistung der Vermeidung hängt direkt mit der Anzahl der Strahler, obwohl es keine Zunahme der Vermeidung mit mehr als 80 Emittern. Interessanterweise wurde eine weitgehende Vermeidung noch erkannt mit nur 10 betonte die Fliegen. Wieder würde dies ermöglichen Prüfung des Emissionsfähigkeiten wenige Fliegen zu einem Zeitpunkt.
Genetischer Hintergrund beeinflusst die DSO Vermeidung Leistung.
Drosophila melanogaster ist eine starke Modellorganismus für genetische Studien. Daher war es wichtig zu bestimmen, ob der Assay verwendet werden, um discr werdeniminate verschiedenen genetischen Hintergründen. Die Reaktion der vier verschiedenen Wildtypen wurde im Hinblick auf ihre Vermeidung von DSO nach Kanton-S emittiert (Abbildung 4) gemessen (Canton-S, Oregon-R, Samarkand und Elwood). Canton-S und Elwood eine höhere PI Vergleich zu Oregon und Samarkand (p <0,05). Diese Ergebnisse zeigen, dass es eine genetische Komponente der Vermeidung des DSO zugrunde liegt, und dass dieser Test hat die Macht, eine Studie dieser genetischen Einfluss durch.
Länge der Wahl Zeit auf die Leistung auswirken.
Der Satz von repräsentativen Daten in den 1, 2, 3 und 4 dargestellt zeigen auch die Wirkung der Länge der Zeit an die Antwort gegeben zu entscheiden, welche sie vermeiden eine Phiole. Wenn Canton-S-Responder sind 30 bis 45 sec gegeben, um ihre bevorzugte Fläschchen wählen, sie erreichen in der Regel Leistungen rund PI = 55 (Abbildung 2 bzw. PI Männer= 57 ± 2; und 52 ± 11). Beim gegebenen 60 sec, ist ihre Leistung höher ist, wie in Figur 4 zu sehen (PI = 77 ± 6,5).
Abbildung 1. Vermeidung von DSO ist nicht geschlechtsspezifische, sondern hängt von Fliegen wird hervorgehoben. Balkendiagramme stellen den Mittelwert ± Bereich der PI der Vermeidung eines Fläschchens der Stress Geruch von regt Fliegen (DSO) nach links. Männliche (rot) und Weibchen (orange) wurden gemeinsam getestet (braun), und dann nach dem Experiment gezählt. Die Fliegen ähnliche Weise durchgeführt, unabhängig von Geschlecht (Zwei-Wege-ANOVA). Aber sie nur dadurch verhindert eine DSO-Fläschchen gefüllt, in dem Fliegen hatte zuvor betont worden (mechanisch bewegt), und nicht ein Fläschchen, in dem Fliegen nicht hervorgehoben worden (Ein-und Aussteigen das Fläschchen durch Phototaxis, p <0,05, Tukey-Mehrfachvergleichs post- Test) oder frische Fläschchen (p <0,001, Tukey-Mehrfachvergleich nach dem Test). InDarüber hinaus gab es keine statistischen Unterschiede zwischen der frischen Ampulle und nicht gestressten Fliegen Bedingungen trotz einer Vorspannung der frische Fläschchen Experiment - n = 2-5 Wiederholungen mit 40 gemischten Geschlechts fliegt jeweils mit 45 Sekunden Wahl Zeit (n = 3 für frische Fläschchen, n = 2 für Fläschchen mit Nicht-Stress-Dateien, n = 5 für Fläschchen mit betont Linie).
Abbildung 2. Vermeidung von DSO ist unabhängig von der Anzahl der Fliegen getestet. Repräsentative Daten zeigt, dass die Zahl der Canton-S-Responder Fliegen im T-Labyrinth hat keine Auswirkungen auf soziale Vermeidung der DSO. Responder Fliegen wurden 30 Sekunden, um zwischen einer frischen Flasche und ein Fläschchen, das DSO entscheiden angegeben (n = 2-6 internen Wiederholungen pro Versuch 1-2 Versuche, mindestens 5 Datenpunkte pro Zustand, Balken stellen die mittlere ± SEM)
Abbildung 4. Wahl Zeit und genetischen Hintergrund von Fruchtfliegen auf die Antwort auf DSO. Canton-S und Elwood Genotypen zeigen eine stärkere Vermeidung der DSO als Oregon und Samarkand (p <0,05 *, t-Test im Vergleich zu Canton-S). Responder Fliegen wurden 1 min gegeben. um zwischen einer frischen Flasche und ein Fläschchen mit DSO entscheiden (n = 4-5 internen Wiederholungen pro Versuch, 2 unabhängige Studien, Balken repräsentieren die durchschnittliche ± SEM)
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Discussion
Dieses Protokoll beschreibt ein detailliertes Verfahren für die soziale Vermeidungstest. Canton-S nur ein Fläschchen zu vermeiden, in denen fliegt zuvor mechanisch belastet gewesen, und dass das Geschlecht und Anzahl der Responder hat keinen Einfluss auf die soziale Vermeidung Leistung. Allerdings hat der genetische Hintergrund der Responder einen großen Einfluss.
Im Folgenden sind einige wichtige Schritte zur Durchführung dieses Experiment erfolgreich: 1) immer vor dem Experiment über die Fliegen 2 h und stellen Sie sicher, nicht auf ihre Umgebung zu stören; 2) durchzuführen, das Experiment immer zur gleichen Tageszeit, ideal zwischen Zeitgeber Zeit ZT5 (Stunden nach Einsetzen des Lichts) und ZT9 Leistungsschwankungen zu reduzieren, um zirkadianen Rhythmus und damit mögliche Variation in der Fortbewegung und Aktivität verbunden sind; 3) Beachten Sie die Temperatur- und Feuchtigkeitsbedingungen bei der Durchführung des Experiments; eine Temperatur von etwa 23-25 ° C und einer Luftfeuchtigkeit von über 30% sind am besten; 4) stellen Sie sicher, nicht auf disturb das T-Labyrinth Gerät während der Fliegen Entscheidungszeit; 5) sicherzustellen, dass die Luft aus den frischen Fläschchen mindestens 24 h vor der Verwendung; und 6) während des Experiments ist es wichtig, die Position des Mess-Küvette im T-Labyrinth-Vorrichtung immer verändern bevorzugt eine Seite des T-Labyrinth vermeiden. Obwohl weitere Tests müssen getan werden, um dies zu bestätigen, empirisch scheint es, dass das DSO entgeht dem "Stress" Fläschchen in weniger als 5 min. Im Gegensatz hierzu scheint es, dass Fliegen sind in der Lage, das DSO nachdem betont bis 1 h auszusenden.
Es gibt mehrere Betrachtungen, die im Protokoll berücksichtigt werden müssen. Die Korrelation zwischen dem Alter der Fliege und soziale Vermeidung ist derzeit nicht bekannt. Daher empfiehlt es sich, das Experiment mit nicht mehr als zwei Wochen alte Fliegen bei 25 ° C durchzuführen, wie Verhaltensänderungen mit der Alterung nicht vor dem Alter 37 angezeigt. Zusammengesetzte Fliegen (gebracht gemischten Geschlechts) sind für das Experiment als gesammeltes ist nicht bekannt, wie die DSO Emission wird durch den Gegenstand der Fliegen betroffen. Obwohl die Verhaltens Ausgang DSO Vermeidung nicht nach Geschlecht betroffen, kann die zugrunde liegende Gehirn-Schaltung geschlechtsdimorphischen sein, und es ist ratsam, männliche und weibliche Fliegen mischen. Schließlich wird eine Verringerung der Anzahl von Emitter fliegt, führt zu einer Abnahme der Vermeidungs, wahrscheinlich zu einer Abnahme der Gesamt DSO emittierten verbunden. Jedoch reicht DSO noch mit nur 10 entfernt vorhanden, was zu einer robusten und reproduzierbaren Vermeidung.
Verringerung der Entscheidungszeit der Antwortlinie von 60 sec bis 30 sec, ergibt sich auch eine Reduzierung der PI für Canton-S fliegt. Dies kann als ein Werkzeug verwendet werden, um Bedingungen oder Mutationen in dem fliegt besser als Canton-S zu unterscheiden. Somit wird in seinem gegenwärtigen Zustand, die soziale Vermeidung Assay kann als Verhaltensparadigma verwendet werden, um die Wirkung von Genen und der Umgebung auf DSO Vermeidungstest. Nachdem die Beherrschung der Technik, weitere Schritte ergriffen werden könnenum die ideale Entscheidung Zeit für DSO Vermeidung und die genaue Anzahl der Emitter Fliegen, die verwendet werden, um die soziale Vermeidung Assay erhalten optimal arbeiten müssen werden zu integrieren.
Eine Einschränkung, die in der Prüfung Mutanten entstehen würde, kann auftreten, wenn der Responder eine schlechte Fortbewegung. Experimentellen Bestimmung eine längere Zeit für die Wahl dieser Mutanten kann eine solche schlechte Fortbewegung zu begegnen. Ebenso fliegt mit sensorischen Defizite, die Detektion von CO 2 zu verhindern würde - ein Hauptbestandteil des DSO oder andere unbekannte Komponente des DSO wäre nicht in der Lage, in diesem Test getestet werden.
Jetzt gibt es keinen anderen Test ermöglicht die Quantifizierung dieser Antwort. Obwohl gezeigt wurde, dass CO 2 ist eine Komponente des DSO 19 wurden andere Komponenten des Signals, sowie Neurotransmitter bei der Wahl, um anderen Personen zu vermeiden betonte beteiligt noch nicht bestimmt worden. Auch der Mechanismus, der die flie treibts zu emittieren DSO ist nicht bekannt. Dieser Assay kann zur Zeit als eine zusätzliche Tischplatte diagnostischen Assay zur Bestimmung der sozialen und Verhaltens-Profil einer Mutante oder Behandlung der Umgebung verwendet werden. Beispielsweise kann eine vergleichen und die Quantifizierung von sozialen Raum, dh die Entfernung zum nächsten Nachbarn 23, auf die Vermeidung von sozialen betonte Fliegen. Beide Verhaltensweisen erfordern als Reaktion auf die Anwesenheit von anderen Individuen, und die Entscheidung zu nahe kommen oder sie zu vermeiden. Das sind sehr einfache, aber leistungsfähige Möglichkeiten, um Gehirn-Schaltung und Neurotransmittern beteiligt sezieren. Diese Verhaltensparadigmen haben auch ein großes Potenzial für die Screening-Zwecken verwendet werden.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereo Zoom Microscope | Nikon | SMZ-645 | Any other standard scope for fly handling would work |
| Small paint brushes | for pushing flies | ||
| Porous Polyethylene, 12" x 12" Sheet | Flystuff - Genesee | 46-100 | http://www.flystuff.com/ProductInfo.php?productID=46-100 Porous Plastic sheet for the cold anesthesia box |
| Mini-Alarm Timer/Stopwatch | |||
| Sharpie pens | |||
| Adhesive Tape | |||
| Mini vortex | Fisher | 14-955-151 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail For mechanical agitation of the flies - any vortex would work. |
| Corning Life Sciences DL No.:352017, Falcon test tube; round bottom; disposable; no closure, 14 ml; 17 x 100 mm | Fisher | 14-959-8 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalogId=29104&productId=2771811&distype=0&highlightProductsItemsFlag=Y&fromSearch=1&searchType=PROD&hasPromo=0 These snap in place in the in-house made T-maze and counter-current apparatus (see text) |
| cotton balls | to close the vials after the experiment. | ||
| trifold board and white bench cover | to provide a white background, and a homogeneous light. | ||
| white bench cover | |||
| pounding pad | any mouse pad works. | ||
| large black cloth | to cover the counter-current apparatus in phototaxis response. | ||
| cool-white light | Home Depot | 1000516563 | http://www.homedepot.ca/product/illume-26-fluorescent-plug-in-linear/911423 any similar linear light with fluorescent light bulb cool-white at 13-15 W would work |
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