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Neuroscience

सामाजिक परिहार की मात्रा में लिए सीधा परख Published: December 13, 2014 doi: 10.3791/52011
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 3
1Department of Molecular Biophysics and Biochemistry, Yale University, 2Department of Biology, York College/CUNY, 3Department of Biology, Western Ontario University

Introduction

इस पद्धति का लक्ष्य आसानी से प्रेमालाप और आक्रामकता से स्वतंत्र ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर में साधारण सामाजिक व्यवहार, का एक नया पहलू यों की है।

सामाजिक संबंधों समुचित विकास और स्वास्थ्य व्यक्तियों की एक समाज के भीतर है, साथ ही एक पूरे के रूप में एक सामाजिक समूह की कार्यक्षमता के लिए महत्वपूर्ण हैं। इन मुलाकातों के उच्च जटिलता बड़ा नमूना आकार और सामाजिक व्यवहार के आनुवंशिक और तंत्रिका ठिकानों अभी भी खराब समझ रहे हैं के रूप में व्यवहार के सरलीकरण के लिए अनुमति देता है कि एक प्रणाली जरूरी। ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर आनुवंशिक पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक शक्तिशाली आनुवंशिक मॉडल है और सामाजिक संबंधों के तंत्रिका कुर्सियां। दरअसल, डी मेलानोगास्टर जटिल सामाजिक व्यवहार का एक प्रदर्शनों की सूची है और समाजीकरण के कुछ प्रत्यक्ष माप पहले से ही 1-7 से किया गया है। हालांकि, इन प्रयासों के इस तरह के ज्यादातर aggres के रूप में अपेक्षाकृत जटिल सामाजिक व्यवहार पर ध्यान केंद्रित किया गया हैनिर्णायक बातचीत 3,6, प्रेमालाप 3,8-12 के विभिन्न पहलुओं, और कैसे सामाजिक अनुभव ऐसे शिक्षण, या circadian ताल 13-17 के रूप में अन्य व्यवहार को प्रभावित करता है। इसके अलावा, इन assays के कई मक्खियों के समूहों के जटिल बातचीत के पैटर्न का विश्लेषण डेटा के परिणामस्वरूप बहुतायत का विश्लेषण करने के लिए वीडियो पर नज़र रखने और कंप्यूटर सॉफ्टवेयर के प्रयोग पर भरोसा करते हैं। इस तरह के विश्लेषण के अमूल्य रहे हैं, और इस तरह के समूहों में 7 मक्खी मक्खी बातचीत के गतिशील के रूप में महत्वपूर्ण नए अंतर्दृष्टि के लिए सीसा। एक सीमा है, हालांकि, बड़े पैमाने पर समुदाय के लिए इन assays की पहुंच है, और दूसरों की मान्यता अंतर्निहित तंत्र का सीमित ज्ञान है। दूसरे शब्दों में, एक व्यक्ति और एक अन्य के द्वारा अपनी मान्यता से एक संकेत के उत्सर्जन के आधार अभी भी खराब 18 समझा जाता है।

डी: इसके विपरीत, यह भी एक सरल व्यवहार, व्यक्तियों पर बल दिया मक्खियों द्वारा उत्सर्जित एक संकेत से दूर स्थानांतरित जहां सामाजिक परिहार, दिखा रहे मक्खियों Melanतनाव odorant या DSO 19 ogaster। एक उच्च throughput परख में इस व्यवहार के अन्य मक्खियों, या सामाजिक परिहार 19 द्वारा उत्सर्जित एक तनाव संकेत से बचाव के रूप में मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। मक्खियों एक टी भूलभुलैया तंत्र में रखा गया है और DSO युक्त एक शीशी से बचने के लिए विकल्प दिया जाता है। इस परख का प्रयोग, सीओ 2 2 19 विच्छेदित किया गया था सीओ का जवाब करने के लिए आवश्यक तंत्रिका circuitry के एक DSO के घटक है, और हिस्सा बनने के लिए दिखाया गया था।

यहाँ प्रस्तुत सामाजिक परिहार परख जटिल व्यवहार के 20 टुकड़े करना शोधकर्ताओं की पीढ़ियों के सक्षम होना चाहिए कि सेमुर Benzer की प्रयोगशाला में विकसित सरल व्यवहार assays के लिए धारणात्मक समान है। सामाजिक परिहार का विश्लेषण लागत प्रभावी ढंग से सामाजिक व्यवहार के अधिक व्यापक अध्ययन के लिए अनुमति देता है, टी भूलभुलैया परख का उपयोग किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, इस परख का उपयोग हम हाल ही में प्रदर्शन किया आत्मकेंद्रित के लिए विभिन्न आनुवंशिक जोखिम सामाजिक बी में विषम प्रभाव है किehavior assays के। 21,22 neurobeachin - - आत्मकेंद्रित के लिए एक उम्मीदवार जीन के लिए म्यूटेंट मौजूद कमियों दोनों सामाजिक अंतरिक्ष में (कहीं 23 में वर्णित) और सामाजिक परिहार 24। असामान्य डोपामिनर्जिक संकेतन भी मनुष्य 25,26 में आत्मकेंद्रित के एटियलजि में एक भूमिका निभाने के लिए प्रस्तावित है। Neurobeachin साथ प्राप्त परिणामों के विपरीत, हम वृद्धि हुई है या डोपामिनर्जिक कोशिकाओं में ड्रोसोफिला Vesicular Monoamine ट्रांसपोर्टर (VMAT) के स्तर में कमी आई द्वारा सामाजिक अंतरिक्ष सीधे VMAT 27 के इन स्तरों के लिए सहसंबद्ध किया गया था, हालांकि सामाजिक परिहार प्रदर्शन, अप्रभावित था पाया। neurobeachin और VMAT के साथ प्राप्त की विषम परिणाम इस प्रकार विभिन्न असामाजिक व्यवहार के रूपों, और दूसरों के जवाब modulating अलग अंतर्निहित तंत्रिका circuitries की पहचान करने की संभावना को रेखांकित।

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Protocol

1. उपकरण और घर में बनाया गया अभिकर्मकों (दूसरों के लिए सामग्री की सूची देखें)

  1. मक्खी काम को करने के लिए एक ड्रोसोफिला ठंड संज्ञाहरण तंत्र तैयार करें।
    1. एक छोटे से प्लास्टिक बॉक्स (10.2 सेमी चौड़ा, 12.7 सेमी लंबी), एक पिपेट सुझावों बॉक्स से आमतौर पर शीर्ष कवर (3.8 सेमी गहरी, 10.2 सेमी चौड़ा, 12.7 सेमी लंबी) को कवर करने के लिए एक झरझरा पॉलीथीन शीट काटें।
    2. कुचल बर्फ के साथ बॉक्स भरें, झरझरा पॉलीथीन शीट के साथ कवर किया।
  2. एक टी भूलभुलैया तंत्र तैयार करें; पहले से विवरण 28-31 में वर्णित तंत्र अनुकूलन।
  3. 32 के रूप में वर्णित एक मक्खी चूषित्र तैयार करें।
  4. में और परीक्षण शीशियों के बाहर तनाव के बिना मक्खियों को विस्थापित करने के लिए एक phototaxis प्रतिक्रिया तंत्र तैयार करें:
    1. 29,33 द्वारा वर्णित के रूप में, एक प्रतिधारा तंत्र का प्रयोग करें।

नोट: 28 द्वारा वर्णित के रूप में टी भूलभुलैया इसके अलावा, अन्य उद्देश्यों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

  1. Hom सुनिश्चित करेंogeneous प्रकाश व्यवस्था की स्थिति: एक सफेद बेंच कवर के साथ कवर एक बेंच पर प्रयोग करते हैं, और एक सफेद बोर्ड के सामने।
    नोट: इन प्रयोगों के लिए, प्रयोग किया जाता मक्खी उपभेदों ड्रोसोफिला जंगली-प्रकार मेलानोगास्टर थे: गुआंगज़ौ एस, ओरेगन और समरकंद हमारी प्रयोगशाला के शेयरों में 34 से मक्खियों; एलवुड मक्खियों लांग आईलैंड, न्यूयॉर्क, संयुक्त राज्य अमेरिका पर, हटिंगटन के एलवुड पड़ोस में पतन 2011 में एकत्र किए गए थे।

2. प्रयोग से पहले मक्खियों की तैयारी

प्रयोग का प्रदर्शन करने से पहले 1-2 दिनों:

  1. एक 12 घंटा / प्रकाश अंधेरे चक्र पर 25 डिग्री सेल्सियस पर मानक cornmeal-अगर-गुड़-खमीर माध्यम पर मक्खियों बनाए रखें।
  2. प्रयोग का प्रदर्शन करने के लिए 1-2 दिन पहले ठंड संज्ञाहरण के तहत प्रत्युत्तर मक्खियों लीजिए
    1. वे एक कीप का उपयोग कर, 50 एमएल फाल्कन ट्यूबों में उठाया गया है, जिसमें बोतलों से मक्खियों स्थानांतरण।
    2. एक में, बर्फ के स्तर के नीचे मक्खियों के साथ फाल्कन ट्यूब प्लेसअछूता बर्फ बाल्टी।
    3. पर -4 सी ठंडा करने के लिए डिग्री कुचल बर्फ के साथ ठंड संज्ञाहरण तंत्र रखें।
    4. मक्खियों एक सर्द कोमा में प्रवेश करने के लिए 5 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
    5. ठंड संज्ञाहरण तंत्र के झरझरा पॉलीथीन शीट पर मक्खियों स्थानांतरण।
    6. ठंड संज्ञाहरण तंत्र पर प्रत्युत्तर मक्खियों लीजिए। आरटी पर, एक stereomicroscope के तहत, महिला मक्खियों से 3-7 दिन पुरानी पुरुष को अलग किया और 40 के समूह में इन मक्खियों को बनाए रखने।
  3. प्रयोग का प्रदर्शन करने के लिए 1-2 दिन पहले emitter के मक्खियों लीजिए।
    1. धीरे कैंटन-एस मिश्रित लिंग उनकी संख्या को नियंत्रित करने, एक मुंह चूषित्र का उपयोग करते हुए, उनके बोतलों से मक्खियों इकट्ठा।
    2. वे emitters के रूप में किया जाएगा, 60-100 के समूह में इन मक्खियों को बनाए रखें।
    3. डेटा बिंदुओं के रूप में जरूरत emitters के रूप में कई नमूने तैयार करें।
  4. ठंड संज्ञाहरण के किसी भी confounding प्रभाव को कम करने के लिए, responders और emitters के संग्रह के बाद वसूली के कम से कम एक रात की अनुमति देंव्यवहार पर और मुंह चूषित्र संग्रह।
  5. कम से कम एक दिन पहले प्रयोग करने के लिए, ताजी हवा की जगह होना बैग में बासी प्लास्टिक महक हवा के लिए अनुमति देने के लिए, परीक्षण शीशियों का बैग खुला।

प्रयोग का प्रदर्शन करने से पहले दो घंटा:

  1. यहां तक ​​कि प्रकाश के साथ प्रयोग किया जाता है, जिसमें कमरे में तापमान लगभग 23-25 ​​डिग्री सेल्सियस है कि सुनिश्चित करने, और 30% से ऊपर नमी।
  2. इन मक्खियों भूखे नहीं कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए ताजा भोजन शीशियों में responders और emitters के फल मक्खियों स्थानांतरण।
  3. फल मक्खियों प्रयोग प्रदर्शन किया जाएगा, जिस पर बेंच पर, 2 घंटे के लिए पर्यावरण के लिए समायोजित करें।

3. सामाजिक परिहार प्रयोग का प्रदर्शन

  1. Zeitgeber समय ZT5 और ZT9 के बीच दोपहर में 3-4 घंटा की एक रेंज में दिन के एक ही समय में एक प्रयोग के प्रदर्शन करना।
  2. तेज़ पैड पर टी भूलभुलैया, जगह और टी इतने पेंच क्लिप कसनेवह लिफ्ट स्थिर है।
  3. एक ताजा परीक्षण शीशी में प्रत्युत्तर मक्खियों स्थानांतरण। टी भूलभुलैया के शीर्ष भाग पर प्रत्युत्तर मक्खियों युक्त इस शीशी तस्वीर।
  4. टी भूलभुलैया तंत्र तिरछा और फल मक्खियों लिफ्ट में गिरावट इतनी तेज़ चटाई पर यह नल।
  5. मक्खियों टी भूलभुलैया के ऊपर और नीचे के खंड के बीच हैं तो नीचे लिफ्ट के शीर्ष भाग ले जाएं, लेकिन चुनाव बिंदु से ऊपर लिफ्ट रखने के लिए ध्यान देना - भागने से मक्खियों को रोकने के लिए।
  6. DSO (पहले मक्खियों द्वारा कब्जा कर रहे थे कि DSO मुक्त शीशियों उत्पन्न करने के लिए धारा 5 देखें) के साथ शीशियों प्राप्त करते हैं।
    1. प्रत्युत्तर मक्खियों इस नए वातावरण को समायोजित कर रहे हैं, वहीं एक परीक्षण शीशी में emitter मक्खियों जगह है।
    2. फल मक्खियों से बच नहीं है तो शीशी बंद करने के लिए कपास का एक टुकड़ा रखें।
    3. 15 सेकंड के लिए भंवर 5 सेकंड के लिए भंवर से शीशी निकालें: यंत्रवत् रूप में इस प्रकार एक मिनी भंवर पर इस शीशी आंदोलन। 55 सेकंड के लिए कुल तीन बार दोहराएँ।
    4. रेमएक खाद्य शीशी में स्थानांतरित करके - - ताजा शीशी के बाहर emitter के मक्खियों ove और जल्दी टी भूलभुलैया तंत्र के दो पक्षों में से एक में इस DSO भरी शीशी जगह है।
    5. प्रत्येक नए समय में DSO भरी शीशी के लिए प्लेसमेंट की ओर वैकल्पिक।
  7. टी भूलभुलैया के दूसरे पक्ष पर एक ताजा परीक्षण शीशी रखें।
  8. फल मक्खियों ताजा परीक्षण शीशी और DSO के साथ परीक्षण शीशी के बीच चुना कर सकते हैं तो, पूरी तरह से नीचे लिफ्ट ले आओ, और टाइमर शुरू करते हैं।
  9. जब तक अन्यथा नोट मक्खियों, एक मिनट के लिए, ताजा शीशी और DSO शीशी के बीच चयन करते हैं।
  10. एक मिनट के बाद, ताजा शीशी, DSO शीशी, और लिफ्ट में फंस उन में मक्खियों अलग करने के लिए लिफ्ट ऊपर ले जाएँ।
  11. प्रत्येक शीशी में मक्खियों की संख्या की गणना, और लिफ्ट में।
  12. प्रत्येक जीनोटाइप / हालत के लिए इस दोहराएँ।

4. सामाजिक परिहार डेटा का विश्लेषण

  1. प्रत्येक genot के लिए प्रत्येक शीशी में फल मक्खियों की संख्या की गणनाype, और एक स्प्रेडशीट के लिए डेटा स्थानांतरण।
  2. एक स्प्रेडशीट प्रोग्राम का उपयोग करना, मक्खियों की कुल संख्या से विभाजित फिर DSO मुक्त शीशी में मक्खियों की संख्या से DSO शीशी में मक्खियों की संख्या घटाकर, और के द्वारा प्रत्येक जीनोटाइप के लिए प्रदर्शन सूचकांक (पीआई) की गणना।
  3. परिणामों के विश्लेषण के लिए सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर PIs 'का अर्थ है की तुलना करें।
    1. आदर्श रूप में, एक प्रयोग के लिए 2-3 आंतरिक दोहराता है, और तीन स्वतंत्र दोहराता तैयार करते हैं, अलग बोतलों के साथ, अलग अलग दिनों पर प्रदर्शन या 30 पार।
    2. डेटा एक सामान्य वितरण का पालन करें, गाऊसी वितरण सांख्यिकीय परीक्षण का प्रयोग करें।
    3. एक प्रभाव जब परीक्षण (यानी, घनत्व - चित्रा 2), एक नियंत्रण करने के लिए प्रत्येक परिणाम की तुलना करने के लिए (स्तंभ द्वारा कॉलम) एकाधिक तुलना के लिए पोस्ट-परीक्षण, या एक साधारण टी परीक्षण के साथ, एक तरह से एनोवा का उपयोग करें।
    4. समूह प्रयोगों का प्रदर्शन कर रहे हैं, स्थिति और लिंग (खाली शीशियों दोनों का परीक्षण पर बल दिया, एकडी संयुक्त राष्ट्र के बल दिया मक्खियों; और लिंग के प्रभाव - चित्रा 1), एक दो तरह एनोवा का उपयोग कर।

5. इससे पहले निर्बल मक्खियों द्वारा अधिकृत शीशियों उत्पन्न - इसके बजाय 3.5-3.6 का प्रदर्शन करना

  1. एक नियंत्रण के रूप में, पर बल दिया नहीं किया गया है कि मक्खियों के कब्जे में शीशियों को तैयार करने के phototaxis का प्रयोग करें।
  2. विपरीत स्थान में ताजा खाली शीशियों के साथ एक परीक्षण शीशी में मक्खियों स्थानांतरण, और प्रतिधारा तंत्र में यह तस्वीर।
  3. सीधे एक 15 डब्ल्यू फ्लोरोसेंट शांत सफेद रोशनी के सामने बाहर का शीशी के साथ क्षैतिज तंत्र रखे, और एक काले कपड़े से कवर किया।
  4. मक्खियों धीरे ताजा शीशी में चलते हैं। यह कई मिनट लग सकते हैं। मक्खियों के सबसे बाहर का शीशी में प्रकाश की ओर चल रहे हैं एक बार, एक मिनट के लिए टाइमर शुरू करते हैं।
  5. धीरे, प्रकाश के स्थान को चालू, काले कपड़े निकालने के लिए काले कपड़े से उबरने में, और मक्खियों परीक्षण शीशी छोड़ने के लिए अनुमति देते हैं।
  6. उस समय, मैं3.2-3.5 के रूप में पसंद प्रयोग nitiate। 3.6 और 3.7 छोड़ें।
  7. दूसरी तरफ से परीक्षण शीशी खाली कि मक्खियों को अलग करने, तंत्र के स्लाइडर ले जाएँ।
  8. सही दूर विकल्प के प्रयोग के लिए, 3.7 में के रूप में टी भूलभुलैया में खाली परीक्षण शीशी का प्रयोग करें।

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Representative Results

सामाजिक परिहार परख अन्य मक्खियों द्वारा उत्सर्जित एक तनाव संकेत पहचान करने के लिए ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर की क्षमता (DSO) बढ़ाता है, और इस प्रकार सामाजिक संबंधों का एक पहलू का आकलन करने के लिए एक मजबूत परीक्षण है। परख आमतौर पर दो अलग-अलग विकल्पों के बीच एक विकल्प के साथ मक्खियों उपस्थित जो एक टी भूलभुलैया, के रूप में जाना जाता है विभिन्न व्यवहार assays में इस्तेमाल एक उपकरण का उपयोग किया जाता है - बाएं या दाएं 19,28-31। इस मामले में, मक्खियों DSO से बचने, जिस पर दक्षता की गणना और उनके प्रदर्शन सूचकांक (पीआई) की तुलना द्वारा मात्रा निर्धारित है। 100 का एक पीआई सब मक्खियों DSO से बचा इंगित करता है कि जबकि शून्य से एक अनुकरणीय, एक 50-50 वितरण या कोई परिहार इंगित करता है। और -100 के पीआई सब मक्खियों DSO शीशी के अंदर चला गया है कि संकेत होगा।

मक्खियों यंत्रवत् उत्तेजित मक्खियों द्वारा उत्सर्जित DSO युक्त एक शीशी के साथ प्रस्तुत किया है, और एक ताजा (DSO मुक्त) शीशी कर रहे हैं। प्रतिनिधि परिणाम यहाँ प्रस्तुत strengt अंडरस्कोरइस परख के एच, के रूप में अच्छी तरह से सबसे अच्छा परिणाम प्राप्त करने के लिए आवश्यक कुछ ज्ञात स्थितियों।

DSO से बचाव सेक्स विशिष्ट नहीं है लेकिन मक्खियों पर जोर दिया जा रहा है पर निर्भर करता है। प्रत्युत्तर मक्खियों की सेक्स DSO के अपने परिहार (चित्रा 1) पर कोई प्रभाव नहीं है। इस मामले में यंत्रवत् (चित्रा 1) उत्तेजित - मक्खियों कि शीशी का एक परिहार बटोर परीक्षण शीशी पर कब्जा कर लिया है करने के लिए हालांकि, यह पर्याप्त नहीं है, मक्खियों पर बल दिया गया है चाहिए। मक्खियों में प्रवेश किया और phototaxis का उपयोग कर तनाव के बिना शीशी से बाहर निकल गया है अगर कोई मक्खियों परीक्षण शीशी पर कब्जा कर लिया है, या था, responders के पहले से 19 की सूचना मिली थी के रूप में कोई वरीयता प्रकाश में लाना।

चित्रा 1 में जाना जाता परिणामों reproduces हालांकि, यह भी उप इष्टतम शर्तों के साथ प्राप्त आंकड़ों की तरह का एक उदाहरण है। केवल 2 से 5 आंतरिक दोहराता है, और कोई स्वतंत्र परीक्षण के साथ, त्रुटि सलाखों रेंज का प्रतिनिधित्व करते हैं। हालांकि, एक महत्वपूर्ण भिन्न नहीं हैपहले से 19 रिपोर्ट के रूप में पहले से बल दिया, मक्खियों और गैर-जोर दिया मक्खियों या खाली द्वारा कब्जा शीशियों के बीच खिलाडि़यों। इस संदर्भ में, मक्खियों अभी परिहार के एक मजबूत गड़बड़ी प्रदर्शित करते हैं। यह परख की मजबूती को रेखांकित करता है। इसके अलावा, दो ताजा शीशियों के बीच चुनाव के लिए पीआई (महिलाओं पी <0.05, और जमा सेक्स पी <0.01 के लिए, शून्य से अलग) नकारात्मक है। इस कारण एक छोटा सा नमूना आकार के टी भूलभुलैया, या एक पूर्वाग्रह के एक तरफ के लिए एक प्राथमिकता इंगित करता है। इस सीमा प्रस्तुत बाद के प्रयोगों में किया के रूप में परीक्षण शीशी, आंतरिक प्रतिकृति में टी भूलभुलैया पर रखा गया है, जिस पर पक्ष बारी से मुकाबला किया जा सकता है।

DSO के जवाब में सेक्स प्रभाव की कमी के बावजूद, responders के संभव confounding प्रभाव को रोकने के लिए सेक्स से अलग हो गए थे। उदाहरण के लिए, ऐसे घ्राण 36 संकेतन में शामिल जीनों को प्रभावित करने वाले लोगों के रूप में लिंग-विशिष्ट प्रभाव, हो सकता है कि म्यूटेशन के मामले में। निम्नलिखित representati परिणाम पुरुष responders, और मिश्रित सेक्स emitters पर ध्यान केंद्रित किया है।

DSO से बचाव का परीक्षण प्रत्युत्तर मक्खियों की संख्या से स्वतंत्र है।

पिछले प्रयोगों 19 सबसे मक्खियों ताजा DSO मुक्त शीशी को प्राथमिकता यह दर्शाता है कि 40 कैंटन-एस एक उच्च गड़बड़ी से पता चला है जो सामाजिक परिहार, परीक्षण में मक्खियों का एक मानक का इस्तेमाल किया है। चित्रा 2 के रूप में देखा responders की गड़बड़ी पर समूह आकार के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए, 10-80 मक्खियों की एक श्रृंखला, assayed किया गया था। दो स्वतंत्र परीक्षणों और परीक्षण प्रति तीन आंतरिक प्रतिकृति की एक न्यूनतम प्रदर्शन किया था। नियंत्रण (चालीस प्रत्युत्तर मक्खियों) का प्रदर्शन सूचकांक को प्रत्युत्तर मक्खियों के विभिन्न संख्या में से प्रत्येक की गड़बड़ी की तुलना करते समय एक टी परीक्षण कोई सांख्यिकीय महत्व दिखाया। इस प्रकार, प्रत्युत्तर मक्खियों की संख्या DSO परिहार की गड़बड़ी और म्यूटेशन म्यूटेंट छोटी संख्या में उपलब्ध हैं, भले ही परीक्षण किया जा सकता परिहार पर है कि प्रभाव पर कोई प्रभाव नहीं है।

ईएनटी "> emitters के हायर संख्या DSO के उच्च परिहार की ओर जाता है मक्खियों।

Emitter के मक्खियों की संख्या DSO और उसके परिहार प्रभावित करने के लिए जो सीमा निर्धारित करने के लिए, हम भी बल दिया मक्खियों की राशि के प्रभाव का परीक्षण किया। पिछले प्रयोगों 19, और इस प्रोटोकॉल में, 70 कैंटन-एस मक्खियों का एक मानक का इस्तेमाल किया है। अब हम 160 emitter के मक्खियों (चित्रा 3) के लिए 10 का परीक्षण किया। 80 से अधिक emitters के साथ परिहार में कोई वृद्धि हुई है, हालांकि परिहार का प्रदर्शन, emitters की संख्या के लिए सीधे संबंधित है। केवल 10 मक्खियों पर बल दिया साथ दिलचस्प है, एक पर्याप्त परिहार अभी भी पता चला था। फिर, यह एक समय में कुछ मक्खियों के उत्सर्जन क्षमताओं का परीक्षण की अनुमति होगी।

आनुवंशिक पृष्ठभूमि DSO परिहार प्रदर्शन को प्रभावित करता है।

ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर आनुवंशिक अध्ययन के लिए एक मजबूत मॉडल जीव है। इस प्रकार यह परख discr करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है या नहीं यह निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण थाविभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि iminate। चार अलग अलग जंगली प्रकार की प्रतिक्रिया कैंटन-एस द्वारा उत्सर्जित DSO के अपने परिहार (चित्रा 4) के लिए सम्मान के साथ (कैंटन-एस, ओरेगन, आर, समरकंद और एलवुड) मापा गया था। कैंटन-एस और एलवुड ओरेगन और समरकंद (पी <0.05) की तुलना में एक उच्च गड़बड़ी है। इन परिणामों के DSO के परिहार अंतर्निहित एक आनुवंशिक घटक है कि वहाँ का प्रदर्शन, और इस परख इस आनुवंशिक प्रभाव का एक अध्ययन प्रदर्शन करने की शक्ति है कि।

चुनाव के समय की लंबाई के प्रदर्शन को प्रभावित।

आंकड़े 1, 2, 3 और 4 में प्रस्तुत प्रतिनिधि डेटा का सेट भी वे बचने शीशी जो तय करने के लिए responders के लिए दिए गए समय की लंबाई के प्रभाव के उदाहरण देकर स्पष्ट करना। कैंटन-एस responders के उनके पसंदीदा शीशी का चयन करने के लिए 45 सेकंड के लिए 30 के लिए दिया जाता है, वे आम तौर पर गड़बड़ी = 55 (चित्रा 2, क्रमशः पीआई पुरुषों के आसपास प्रदर्शन तक पहुँचने= 57 ± 2; और 52 ± 11)। 60 सेकंड दिए गए, जब उनके प्रदर्शन चित्रा में 4 (पीआई = 77 ± 6.5) के रूप में देखा, अधिक है।

चित्रा 1
DSO चित्रा 1. परिहार सेक्स विशिष्ट नहीं है लेकिन मक्खियों पर जोर दिया जा रहा है पर निर्भर करता है। बार रेखांकन एक शीशी उत्तेजित मक्खियों (DSO) द्वारा छोड़ा तनाव गंध से बचाव की गड़बड़ी की औसत ± रेंज का प्रतिनिधित्व करते हैं। पुरुषों (लाल रंग में), और महिलाओं (नारंगी) एक साथ (ब्राउन) का परीक्षण किया है, और फिर प्रयोग के बाद गिना रहे थे। मक्खियों की परवाह किए बिना उनके सेक्स (दो तरह एनोवा) की, इसी तरह का प्रदर्शन किया। लेकिन वे केवल, पी <0.05, Tukey के कई तुलना के बाद प्रवेश करने और phototaxis द्वारा शीशी बाहर निकलने में जो बल दिया नहीं किया गया था मक्खियों मक्खियों पहले से जोर दिया गया था जिसमें एक DSO से भरे शीशी (यंत्रवत् उत्तेजित), और नहीं एक शीशी (टाला परीक्षण), या ताजा शीशी (पी <0.001, Tukey के कई तुलना के बाद परीक्षण)। मेंइसके अलावा, वहाँ, ताजा शीशी और गैर-जोर दिया मक्खियों की स्थितियों के बीच कोई सांख्यिकीय मतभेद था एक पूर्वाग्रह के बावजूद ताजा शीशी प्रयोग - एन = 2-5 (एन = 3 ताजा लिए 40 मिश्रित सेक्स 45 सेकंड चुनाव समय के साथ, प्रत्येक मक्खियों के साथ प्रतिकृति शीशियों, एन = 2) पर बल दिया मक्खियों के साथ शीशी के लिए गैर तनाव फाइलों के साथ शीशी, एन = 5 के लिए।

चित्रा 2
DSO चित्रा 2. परिहार परीक्षण किया मक्खियों की संख्या से स्वतंत्र है। प्रतिनिधि डेटा टी भूलभुलैया में कैंटन-एस प्रत्युत्तर मक्खियों की संख्या DSO के सामाजिक परिहार पर कोई प्रभाव नहीं है कि पता चलता है। प्रत्युत्तर मक्खियों एक ताजा शीशी और DSO युक्त एक शीशी के बीच तय करने के लिए 30 सेकंड दिए गए थे (एन = परीक्षण प्रति 2-6 आंतरिक प्रतिकृति, 1-2 परीक्षणों, हालत प्रति 5 डेटा अंक के न्यूनतम, बार रेखांकन औसत ± SEM का प्रतिनिधित्व करते हैं)

चित्रा 3

चित्रा 4
चित्रा 4. च्वाइस समय और फल मक्खियों की आनुवंशिक पृष्ठभूमि DSO। कैंटन-एस और एलवुड जीनोटाइप के जवाब को प्रभावित ओरेगन और समा से DSO के एक मजबूत परिहार प्रदर्शितrkand (कैंटन-एस की तुलना में पी <0.05 *, टी परीक्षण)। प्रत्युत्तर मक्खियों 1 मिनट दिए गए थे। एक ताजा शीशी और DSO युक्त एक शीशी के बीच तय करने के लिए (एन = परीक्षण प्रति 4-5 आंतरिक प्रतिकृति, 2 स्वतंत्र परीक्षणों, बार रेखांकन औसत ± SEM का प्रतिनिधित्व करते हैं)

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Discussion

इस प्रोटोकॉल सामाजिक परिहार परख के लिए एक विस्तृत प्रक्रिया का वर्णन करता है। कैंटन-एस केवल पहले से यंत्रवत् गया पर बल दिया है मक्खियों जिसमें एक शीशी से बचना होगा, और responders की है कि सेक्स और संख्या सामाजिक परिहार प्रदर्शन को प्रभावित नहीं करता है। हालांकि, responders के आनुवंशिक पृष्ठभूमि एक बड़ा प्रभाव है।

सफलतापूर्वक इस प्रयोग का प्रदर्शन करने के लिए कई महत्वपूर्ण कदम निम्नलिखित हैं: 1) हमेशा प्रयोग से पहले मक्खियों 2 घंटा हस्तांतरण और अपने पर्यावरण को परेशान करने के लिए यकीन नहीं कर; 2) circadian ताल और हरकत और गतिविधि के स्तर में इस प्रकार संभव विभिन्नता से जुड़ा हुआ प्रदर्शन में भिन्नता को कम करने के लिए आदर्श Zeitgeber ZT5 (घंटे प्रकाश की शुरुआत के बाद का समय) और ZT9 बीच, दिन के एक ही समय में हमेशा प्रयोग करते; प्रयोग का प्रदर्शन 3) जब तापमान और आर्द्रता की स्थिति पर ध्यान दें; 30% से ऊपर 23-25 ​​डिग्री सेल्सियस और आर्द्रता के चारों ओर एक तापमान सबसे अच्छा कर रहे हैं; 4) डी यकीन नहीं करने के लिए बनाisturb मक्खियों निर्णय समय के दौरान टी भूलभुलैया तंत्र; 5) कम से कम 24 घंटा उन का उपयोग करने से पहले ताजा शीशियों बाहर हवा के लिए सुनिश्चित करें; और 6) प्रयोग के दौरान यह हमेशा टी भूलभुलैया के एक तरफ को वरीयता से बचने के लिए टी भूलभुलैया तंत्र में परीक्षण शीशी के स्थान को बदलने के लिए महत्वपूर्ण है। अतिरिक्त परीक्षण इस बात की पुष्टि करने के लिए किया जाना चाहिए हालांकि, अनुभव से यह DSO कम से कम 5 मिनट में "तनाव" शीशी पलायन कि लगता है। इसके विपरीत, यह मक्खियों पर जोर दिया जा रहा है के बाद एक घंटा के लिए DSO फेंकना करने में सक्षम हैं कि लगता है।

प्रोटोकॉल में ध्यान में रखा जाना चाहिए कि कई कारणों से कर रहे हैं। मक्खी और सामाजिक परिहार की उम्र के बीच संबंध वर्तमान में अज्ञात है। इसलिए, यह उम्र बढ़ने के साथ जुड़े व्यवहार में बदलाव है कि उम्र 37 करने से पहले नहीं दिखाई देते हैं, के रूप में 25 डिग्री सेल्सियस से अधिक नहीं दो सप्ताह पुराने मक्खियों के साथ प्रयोग करने के लिए सिफारिश की है। Mated मक्खियों (रखे मिश्रित लिंगों) प्रयोग के रूप में के लिए एकत्र कर रहे हैंDSO उत्सर्जन मक्खियों के संभोग की स्थिति से प्रभावित होता है कि कैसे यह अज्ञात है। DSO परिहार के व्यवहार उत्पादन सेक्स से प्रभावित नहीं है हालांकि, अंतर्निहित मस्तिष्क circuitry यौन dimorphic हो सकता है, और यह पुरुष और महिला मक्खियों मिश्रण करने के लिए उचित नहीं है। अंत में, emitter की संख्या में कमी शायद उत्सर्जित कुल DSO में कमी से जुड़ा हुआ परिहार में कमी की ओर जाता है मक्खियों। हालांकि, काफी DSO एक मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिहार के लिए अग्रणी है, अभी भी केवल 10 मक्खियों के साथ मौजूद है।

कैंटन-एस मक्खियों के लिए 60 सेकंड से 30 सेकंड के लिए प्रत्युत्तर मक्खियों के निर्णय के लिए समय की कमी है, यह भी गड़बड़ी की कमी का परिणाम है। इस कैंटन-एस की तुलना में बेहतर प्रदर्शन मक्खियों जिसमें शर्तों या म्यूटेशन के लिए भेदभाव करने के लिए एक उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। इस प्रकार, अपनी वर्तमान स्थिति में, सामाजिक परिहार परख जीनों के प्रभाव और DSO परिहार पर पर्यावरण परीक्षण करने के लिए एक व्यवहार प्रतिमान के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। तकनीक माहिर के बाद, भविष्य कदम उठाए जा सकता हैDSO परिहार और बेहतर काम करने के लिए सामाजिक परिहार परख प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए कि emitter मक्खियों की सही संख्या के लिए आदर्श निर्णय समय शामिल करने के लिए।

Responders के गरीब हरकत है, तो परीक्षण के म्यूटेंट में पैदा होता है कि एक सीमा हो सकती है। प्रयोगात्मक ऐसे गरीब हरकत का मुकाबला हो सकता है इन म्यूटेंट के लिए एक लंबे समय तक चुनाव के समय का निर्धारण। इसी तरह, सीओ 2 का पता लगाने को रोका जा सके कि संवेदी कमियों के साथ मक्खियों - DSO ​​का एक प्रमुख घटक, या DSO के अन्य अज्ञात घटक इस परख में परीक्षण किया जा करने में सक्षम नहीं होगा।

इस प्रतिक्रिया की मात्रा का ठहराव की अनुमति के कोई अन्य परख वर्तमान में है। यह सीओ 2 DSO 19 का एक घटक है कि दिखाया गया था हालांकि, दूसरे पर बल दिया व्यक्तियों से बचने के लिए किए गए चुनाव में शामिल अन्य संकेत के घटकों, साथ ही न्यूरोट्रांसमीटर अभी तक निर्धारित नहीं किया गया है। इसी तरह, तंत्र flie कि ड्राइवएस DSO ज्ञात नहीं है फेंकना। यह परख वर्तमान में एक उत्परिवर्ती, या पर्यावरण उपचार के सामाजिक और समग्र व्यवहार प्रोफाइल को निर्धारित करने के लिए एक अतिरिक्त बेंच शीर्ष नैदानिक ​​परख के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, एक तुलना कर सकते हैं और जोर दिया मक्खियों के सामाजिक परिहार के लिए, सामाजिक अंतरिक्ष, यानी, निकटतम पड़ोसी से 23 दूरी की मात्रा का ठहराव विपरीत। दोनों व्यवहार अन्य व्यक्तियों की मौजूदगी का जवाब देने के लिए, और करीब आने के लिए या उन से बचने के लिए निर्णय लेने की आवश्यकता है। ये मस्तिष्क circuitry और शामिल न्यूरोट्रांसमीटर टुकड़े करना बहुत ही सरल अभी तक शक्तिशाली तरीके हैं। ये व्यवहार मानदंड भी एक जबरदस्त क्षमता स्क्रीनिंग उद्देश्यों के लिए इस्तेमाल किया जाना है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stereo Zoom Microscope  Nikon   SMZ-645 Any other standard scope for fly handling would work
Small paint brushes  for pushing flies
Porous Polyethylene, 12" x 12" Sheet Flystuff - Genesee 46-100 http://www.flystuff.com/ProductInfo.php?productID=46-100
Porous Plastic sheet for the cold anesthesia box
Mini-Alarm Timer/Stopwatch
Sharpie pens
Adhesive Tape
Mini vortex Fisher 14-955-151  http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail
For mechanical agitation of the flies - any vortex would work.
Corning Life Sciences DL No.:352017, Falcon test tube; round bottom; disposable; no closure, 14 ml; 17 x 100 mm Fisher 14-959-8    http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalogId=29104&productId=2771811&distype=0&highlightProductsItemsFlag=Y&fromSearch=1&searchType=PROD&hasPromo=0
These snap in place in the in-house made T-maze and counter-current apparatus (see text)
cotton balls to close the vials after the experiment.
trifold board and white bench cover to provide a white background, and a homogeneous light.
white bench cover
pounding pad any mouse pad works.
large black cloth to cover the counter-current apparatus in phototaxis response.
cool-white light  Home Depot 1000516563 http://www.homedepot.ca/product/illume-26-fluorescent-plug-in-linear/911423
any similar linear light with fluorescent light bulb cool-white at 13-15 W would work

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तंत्रिका विज्ञान अंक 94 सामाजिक व्यवहार सामाजिक परिहार, तनाव odorant - DSO टी भूलभुलैया तंत्र neurogenetics
सामाजिक परिहार की मात्रा में लिए सीधा परख<em&gt; ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर</em
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Fernandez, R. W., Nurilov, M., Feliciano, O., McDonald, I. S., Simon, A. F. Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (94), e52011, doi:10.3791/52011 (2014).

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