Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

الفحص مباشرة للالكمي لتجنب الاجتماعي في Published: December 13, 2014 doi: 10.3791/52011
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 3
1Department of Molecular Biophysics and Biochemistry, Yale University, 2Department of Biology, York College/CUNY, 3Department of Biology, Western Ontario University

Introduction

والهدف من هذه الطريقة هو لقياس بسهولة جانبا جديدا من السلوك الاجتماعي بسيط في البطن ذبابة الفاكهة، مستقلة عن الخطوبة والعدوان.

التفاعلات الاجتماعية هي الحاسمة في تنمية سليمة وصحة الأفراد داخل المجتمع، فضلا عن وظيفة لفئة اجتماعية ككل. تعقيد عالية من هذه التفاعلات يتطلب أحجام عينة كبيرة والنظام الذي يسمح لتبسيط السلوك كما أسس الوراثية والعصبية للسلوك الاجتماعي لا تزال غير مفهومة. ذبابة الفاكهة البطن هو نموذج الجيني القوية التي يمكن أن تستخدم لتحديد الجيني و قواعد العصبية من التفاعلات الاجتماعية. في الواقع، D. البطن لديه ذخيرة من السلوكيات الاجتماعية المعقدة وبعض القياسات المباشرة للتنشئة الاجتماعية وبالفعل تم القيام به 1-7. ومع ذلك، فإن معظم هذه الجهود قد ركزت على السلوكيات الاجتماعية المعقدة نسبيا، مثل aggresالتفاعلات SIVE 3،6، مختلف جوانب الخطوبة 3،8-12، وكيف تجربة اجتماعية تؤثر السلوكيات الأخرى مثل التعلم، أو إيقاع الساعة البيولوجية 13-17. وبالإضافة إلى ذلك، فإن العديد من هذه المقايسات تعتمد على تحليل أنماط التفاعل معقدة من مجموعات من الذباب، وذلك باستخدام التتبع وبرامج الكمبيوتر لتحليل وفرة الناتج من البيانات. مثل هذه التحليلات لا تقدر بثمن، وتؤدي إلى رؤى جديدة مهمة مثل ديناميكية التفاعلات ذبابة ذبابة في مجموعات 7. القيد واحد، ومع ذلك، هو عدم إمكانية الوصول إلى هذه المقايسات للمجتمع ككل، ومعرفة محدودة من الآليات الكامنة الاعتراف بالآخر. وبعبارة أخرى، فإن أساس انبعاث إشارة من قبل فرد واحد والاعتراف بها من جانب آخر لا تزال غير مفهومة 18.

في المقابل، الذباب أيضا يحمل سلوك بسيط، وتجنب الاجتماعي، حيث يتحرك الأفراد بعيدا عن إشارة المنبعثة من الذباب وشدد: على D. melanogaster الإجهاد الرائحة أو احة دبي للسيليكون 19. في مقايسة الإنتاجية العالية، يمكن قياسها كميا هذا السلوك كما تجنب إشارة التوتر المنبعث من الذباب أخرى، أو تجنب الاجتماعي 19. توضع الذباب في جهاز T-المتاهة، وإعطاء خيار لتجنب قارورة تحتوي على احة دبي للسيليكون. باستخدام هذا الاختبار، تبين CO 2 لتكون عنصرا من عناصر احة دبي للسيليكون، وجزء من الدوائر العصبية اللازمة للاستجابة إلى CO 2 تم تشريح 19.

الفحص تجنب الاجتماعي المقدمة هنا هو المفهوم مماثل لالمقايسات سلوكية بسيطة وضعت في مختبر سيمور بنزر أن تمكين أجيال من الباحثين لتشريح السلوكيات المعقدة 20. تحليل تجنب الاجتماعي يمكن أن تنفذ فعالية من حيث التكلفة باستخدام مقايسة T-متاهة، والسماح لدراسة أكثر انتشارا من السلوك الاجتماعي. على سبيل المثال، وذلك باستخدام هذا الاختبار أثبتنا مؤخرا أن مخاطر وراثية مختلفة لمرض التوحد لها آثار متباينة في ب الاجتماعيةالمقايسات ehavior. المسوخ لجين مرشح لمرض التوحد - neurobeachin 21،22 - أوجه القصور الحالية على حد سواء في الفضاء الاجتماعي (وصف مكان آخر 23) وتجنب الاجتماعي 24. ومن المقترح غير طبيعية إشارات الدوبامين أيضا للعب دور في مسببات مرض التوحد في البشر 25،26. وعلى النقيض من النتائج التي تم الحصول عليها مع neurobeachin، وجدنا أن الأداء تجنب الاجتماعي لم يتأثر زيادة أو انخفاض مستويات من ذبابة الفاكهة الحويصلي أحادي الأمين الناقل (VMAT) في خلايا الدوبامين، على الرغم من الفضاء الاجتماعي ترتبط مباشرة إلى هذه المستويات من VMAT 27. النتائج المتناقضة التي تم الحصول عليها مع neurobeachin وVMAT تؤكد إمكانية تحديد أشكال مختلفة من السلوك ااجتماعي، وبالتالي مختلفة circuitries العصبية الكامنة تحوير الاستجابة للآخرين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

المعدات والكواشف مكون في منزل 1. (راجع قائمة المواد لأخرى)

  1. إعداد ذبابة الفاكهة جهاز التخدير البارد لأداء العمل الطاير.
    1. قطع ورقة البولي ايثيلين التي يسهل اختراقها لتغطية مربع صغير من البلاستيك (12.7 سم طويلة، 10.2 سم)، وعادة الغطاء العلوي من مربع نصائح ماصة (12.7 سم طويلة، 10.2 سم، 3.8 سم عمق).
    2. ملء مربع مع الثلج المجروش، مع تغطية ورقة البولي ايثيلين التي يسهل اختراقها.
  2. إعداد جهاز T-متاهة. التكيف مع الجهاز سبق وصفها في التفاصيل 28-31.
  3. إعداد الشافطة ذبابة كما هو موضح 32.
  4. إعداد جهاز استجابة انجذاب ضوئي لتهجير الذباب ويخرجون من قارورة الاختبار دون إجهاد:
    1. استخدام جهاز المعاكس، كما وصفها 29،33.

ملاحظة: يمكن أيضا أن T-متاهة أن تستخدم لأغراض أخرى، كما وصفها 28.

  1. ضمان هومظروف الإضاءة ogeneous: أداء التجربة على مقعد مغطاة مقعد غطاء أبيض، وأمام لوحة بيضاء.
    ملاحظة: للحصول على هذه التجارب، وكانت سلالات ذبابة المستخدمة الدروسوفيلاميلانوجاستر أنواع البرية: كانتون-S، ولاية أوريغون وسمرقند الذباب من مخزونات المختبر لدينا 34؛ تم جمع الذباب إلوود في خريف عام 2011 في حي إلوود من هنتنغتون، في لونغ آيلاند، نيويورك، الولايات المتحدة الأمريكية.

2. إعداد الذباب قبل التجربة

1-2 أيام قبل تنفيذ التجربة:

  1. الحفاظ على الذباب على معيار متوسطة دقيق الذرة-أجار الدبس-الخميرة عند 25 درجة مئوية على 12 ساعة ضوء / دورة الظلام.
  2. جمع الذباب الرد تحت التخدير الباردة 1-2 أيام قبل تنفيذ التجربة
    1. نقل الذباب من الزجاجات التي أثيرت في 50 مل أنابيب الصقر، وذلك باستخدام قمع.
    2. وضع أنبوب الصقر مع الذباب تحت مستوى الجليد، إلىدلو الثلج معزول.
    3. وضع جهاز التخدير البارد مع الثلج المجروش في -4 ° C إلى البرد.
    4. الانتظار 5 دقائق لالذباب لدخول غيبوبة البرد.
    5. نقل الذباب على ورقة البولي ايثيلين التي يسهل اختراقها من جهاز التخدير البارد.
    6. جمع الذباب الرد على الجهاز التخدير البارد. في RT، تحت stereomicroscope، فصل الذكور 3-7 أيام القديم من الذباب الإناث والحفاظ على هذه الذباب في مجموعات من 40.
  3. جمع الذباب باعث 1-2 أيام قبل إجراء التجربة.
    1. جمع بلطف كانتون-S مختلط الجنس الذباب من الزجاجات، وذلك باستخدام الشافطة الفم، والسيطرة على لعددهم.
    2. الحفاظ على هذه الذباب في مجموعة من 60-100، لأنها سوف تكون بواعث.
    3. إعداد العديد من العينات من بواعث كنقاط البيانات اللازمة.
  4. تسمح على الأقل ليلة من الانتعاش بعد جمع من المستجيبين وبواعث، للحد من أي تأثير الخلط من التخدير الباردوجمع الفم الشافطة على السلوك.
  5. فتح الحقيبة من قارورة اختبار، للسماح للهواء رائحة البلاستيك التي لا معنى لها في الحقيبة لتحل محلها الهواء النقي، 1 في اليوم على الاقل قبل التجربة.

2 ساعة قبل تنفيذ التجربة:

  1. تأكد من أن درجة الحرارة في الغرفة التي يتم تنفيذ التجربة حوالي 23-25 ​​درجة مئوية، حتى مع الضوء، والرطوبة فوق 30٪.
  2. نقل المستجيبين والذباب بواعث الفاكهة في قوارير جديدة الغذائية للتأكد من أن هذه الذباب لا جوعا.
  3. السماح للذباب الفاكهة على التكيف مع البيئة لمدة 2 ساعة، على مقاعد البدلاء التي سيتم تنفيذ التجربة.

3. إجراء التجربة تجنب الاجتماعي

  1. أداء كل تجربة في نفس الوقت من اليوم، في مجموعة من 3-4 ساعة في فترة ما بعد الظهر بين الساعة Zeitgeber ZT5 وZT9.
  2. ضع T-متاهة على لوحة القصف، وتشديد كليب المسمار بحيث رفهو المصاعد مستقر.
  3. نقل الذباب الرد في اختبار قارورة جديدة. التقط هذه القارورة التي تحتوي على الذباب الرد على الجزء العلوي من T-المتاهة.
  4. مائل جهاز T-متاهة واضغط عليها على حصيرة بقصف حتى تسقط ذبابة الفاكهة في المصعد.
  5. تحريك الجزء العلوي من المصعد إلى أسفل حتى الذباب ما بين القسم العلوي والجزء السفلي من T-المتاهة، ولكن الالتفات للحفاظ على المصعد فوق نقطة الاختيار - لمنع الذباب من الهرب.
  6. الحصول على قارورة مع احة دبي للسيليكون (انظر القسم 5 لتوليد خالية احة دبي للسيليكون قارورة التي احتلت من قبل الذباب).
    1. في حين أن الذباب الرد على التكيف مع هذه البيئة الجديدة، ووضع الذباب باعث في قارورة الاختبار.
    2. ضع قطعة من القطن لإغلاق القارورة حتى ذبابة الفاكهة لا يهرب.
    3. ميكانيكيا تستنهض الهمم هذه قنينة على-دوامة صغيرة على النحو التالي: دوامة لمدة 15 ثانية، وإزالة القارورة من دوامة لمدة 5 ثانية. كرر 3 مرات ليصبح المجموع 55 ثانية.
    4. ريماوفه الذباب باعث من القارورة جديدة - من خلال نقل في قارورة الغذاء - وسرعان ما وضع هذا احة دبي للسيليكون ملأت قارورة في واحدة من الجانبين لجهاز T-المتاهة.
    5. بالتناوب جانب التنسيب للقارورة احة دبي للسيليكون شغلها في كل شوط جديد.
  7. وضع اختبار قارورة جديدة على الجانب الآخر من T-المتاهة.
  8. جلب المصعد أسفل تماما، وبالتالي فإن ذباب الفاكهة يمكن أن اختار بين قنينة اختبار الطازجة وقنينة اختبار مع احة دبي للسيليكون، وبدء الموقت.
  9. السماح للذباب تختار بين القارورة الطازجة والقارورة احة دبي للسيليكون، لمدة 1 دقيقة، ما لم يذكر خلاف ذلك.
  10. وبعد 1 دقيقة، نقل المصعد تصل للفصل بين الذباب في القارورة جديدة، DSO القارورة، وتلك عالقة في المصعد.
  11. حساب عدد الذباب في كل قارورة، وفي المصعد.
  12. ثم كرر ذلك لكل الوراثي / الشرط.

4. تحليل البيانات تجنب الاجتماعي

  1. حساب عدد من ذباب الفاكهة في كل قارورة لكل جينو[يب]، ونقل البيانات إلى جدول بيانات.
  2. باستخدام برنامج جداول البيانات، وحساب مؤشر الأداء (PI) لكل التركيب الوراثي من خلال طرح عدد من الذباب في القارورة احة دبي للسيليكون من عدد الذباب في القارورة المجانية احة دبي للسيليكون، ثم قسمة العدد الكلي للذباب.
  3. المقارنة الوسائل حزب القانون والعدالة "باستخدام برامج التحليل الإحصائي للتحليل لنتائج.
    1. ومن الناحية المثالية، وإعداد 2-3 يكرر الداخلية لكل تجربة، و 3 يكرر مستقلة، أجريت على أيام مختلفة، مع زجاجات مختلفة أو الصلبان 30.
    2. استخدام اختبارات توزيع جاوس الإحصائية، وتتبع البيانات التوزيع الطبيعي.
    3. عند اختبار تأثير واحد (أي كثافة - الشكل 2)، واستخدام ANOVA في اتجاه واحد، مع ما بعد اختبار للمقارنة متعددة (عمود بواسطة عمود)، أو بسيطة اختبار t لمقارنة كل نتيجة لعنصر تحكم.
    4. عندما يتم تنفيذ تجارب المجموعة، اختبار كل الظروف والأجناس (قارورة فارغة، وشدد علىالذباب من الامم المتحدة وأكد د. وتأثير بين الجنسين - الشكل 1)، وذلك باستخدام اتجاهين ANOVA.

5. توليد قوارير التي كانت تحتلها الذباب بهيج - تنفيذ وبدلا من 3،5-3،6

  1. استخدام انجذاب ضوئي لإعداد قارورة المحتلة عن طريق الذباب التي لم يتم شدد، كمجموعة تحكم.
  2. نقل الذباب في قارورة الاختبار، وثبتها في الجهاز المعاكس، مع قارورة فارغة جديدة في الموقع المعاكس.
  3. وضع الجهاز أفقيا مع القارورة البعيدة مباشرة أمام 15 W الفلورسنت ضوء بارد أبيض، وتغطي مع قطعة قماش سوداء.
  4. السماح للذباب تحرك بلطف في قارورة جديدة. قد يستغرق هذا عدة دقائق. مرة واحدة أكثر من الذباب يسيرون نحو الضوء في قارورة البعيدة، وبدء الموقت لمدة 1 دقيقة.
  5. بلطف إزالة قطعة قماش سوداء، تبديل مكان وجود الضوء، واستعادة مع القماش الأسود، والسماح للذباب لمغادرة اختبار القارورة.
  6. في ذلك الوقت، طnitiate التجربة الاختيار كما في 3،2-3،5. تخطي 3.6 و 3.7.
  7. حرك المنزلق للجهاز، للفصل بين الذباب الذي شغر قنينة اختبار من الجانب الآخر.
  8. استخدام قارورة الاختبار إخلاؤها في T-متاهة على الفور للتجربة الاختيار، كما هو الحال في 3.7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تجنب فحص الاجتماعي هو اختبار قوي قياس قدرة ذبابة الفاكهة على التعرف على إشارة الإجهاد (DSO) المنبعثة من الذباب أخرى، وبالتالي تقييم جانبا واحدا من التفاعلات الاجتماعية. يتم تنفيذ الفحص باستخدام جهاز يستخدم عادة في مختلف مقايسات السلوك المعروف باسم T-المتاهة، التي تمثل الذباب مع اختيار بين خيارين مختلفين - اليسار أو اليمين 19،28-31. في هذه الحالة، يتم كميا كفاءة التي الذباب تجنب احة دبي للسيليكون عن طريق حساب ومقارنة مؤشر أدائها (PI). A PI من الصفر يشير إلى توزيع 50-50 أو لا تجنب، في حين أن PI من 100 يشير إلى أن كل الذباب تجنبت احة دبي للسيليكون. وPI -100 يشير إلى أن كل الذباب ذهب داخل القارورة احة دبي للسيليكون.

وتعرض الذباب مع قارورة تحتوي على احة دبي للسيليكون المنبعثة من الذباب تحريكها ميكانيكيا، والطازجة واحد (خالية من DSO) القارورة. وقدم ممثل النتائج هنا تؤكد تزداد قوةح من هذا الاختبار، فضلا عن بعض الشروط المعروفة الضرورية للحصول على أفضل النتائج.

تجنب احة دبي للسيليكون هو ليس الجنس معين ولكن يعتمد على الذباب يجري التشديد. جنس الذباب الرد ليس له تأثير على تجنب بهم من DSO (الشكل 1). ومع ذلك، فإنه لا يكفي لالذباب قد احتل قنينة اختبار للحصول على تجنب تلك القارورة، والذباب يجب أن يكون قد أكد - في هذه الحالة تحريكها ميكانيكيا (الشكل 1). إذا لم يكن هناك الذباب قد احتلت اختبار قارورة، أو إذا دخلت الذباب وخرجت القارورة دون إجهاد باستخدام انجذاب ضوئي، والمستجيبين تثير أي تفضيل كما ذكرت سابقا 19.

على الرغم من أن الشكل 1 يستنسخ النتائج معروفة، بل هو أيضا مثال على هذا النوع من البيانات التي تم الحصول عليها مع ظروف دون المستوى الأمثل. مع فقط 2 إلى 5 يكرر الداخلية، ولا محاكمات مستقلة، وأشرطة الخطأ تمثل النطاق. ولكن، هناك تختلف عن أهميةسينعقد بين القنينات التي كانت تحتلها الذباب أكد والذباب غير شدد أو فارغة، كما ذكرت سابقا 19. في هذا السياق، فإن الذباب لا يزال يعرض PI قوي فسخ العقد. وهذا يؤكد متانة الفحص. بالإضافة إلى ذلك، PI لاختيار بين اثنين من قوارير جديدة سلبي (مختلفة من 0، للإناث ف <0.05، والمجمعة ص جنس <0.01). وهذا يدل على تفضيل جانب واحد من T-المتاهة، أو وجود تحيز بسبب صغر حجم العينة. هذا القيد يمكن مواجهتها بالتناوب الجانب الذي يتم وضع الاختبار قارورة على T-متاهة في مكررات الداخلية، كما حدث في تجارب لاحقة المقدمة.

وعلى الرغم من عدم وجود تأثير الجنس في الرد على احة دبي للسيليكون، تم فصل المستجيبين حسب الجنس لمنع آثار الخلط الممكنة. على سبيل المثال، في حالة من الطفرات التي يمكن أن يكون لها آثار الجنس محددة، مثل تلك التي تؤثر على الجينات المسؤولة عن حاسة الشم يشير 36. وrepresentati التالية لقد تركز النتائج على المستجيبين الذكور، وبواعث الجنس المختلطة.

تجنب احة دبي للسيليكون مستقلة عن عدد من الذباب الرد اختبارها.

التجارب السابقة 19 استخدمت في مستوى من 40 كانتون-S الذباب في اختبار تجنب الاجتماعي، والذي أظهر PI عالية، مشيرا إلى أن معظم الذباب يفضل القارورة المجانية احة دبي للسيليكون، الطازجة. لاختبار تأثير حجم المجموعة على PI من المستجيبين، وكان يعاير مجموعة من 10-80 الذباب، كما رأينا في الشكل 2. تم إجراء ما لا يقل عن اثنين من محاكمات مستقلة وثلاثة مكررات الداخلية في المحاكمة. وأظهر اختبار t لا دلالة إحصائية عند مقارنة PI كل من عدد مختلف من الذباب المستجيب لمؤشر أداء التحكم (أربعين الذباب المستجيب). وهكذا، وعدد من الذباب الرد ليس له أي تأثير على PI من DSO تجنب والأثر الذي الطفرات لها على تجنب يمكن اختبارها حتى لو هي المسوخ المتاحة في أعداد صغيرة.

والأنف والحنجرة "> عدد العالي للبواعث الذباب يؤدي إلى تجنب أعلى من احة دبي للسيليكون.

لتحديد إلى أي مدى أثرت على عدد من الذباب باعث على احة دبي للسيليكون وتجنب لها، ونحن أيضا اختبار تأثير كمية من الذباب وشدد. في التجارب الماضية 19، وهذا البروتوكول، قد استخدمت في مستوى من 70 الذباب كانتون-S. اختبرنا الآن 10-160 الذباب باعث (الشكل 3). أداء تجنب يرتبط مباشرة بعدد من بواعث، رغم عدم وجود زيادة في تجنب مع أكثر من 80 بواعث. ومن المثير للاهتمام، وقد لتجنب كبير لا يزال الكشف مع وأكد فقط 10 الذباب. مرة أخرى، وهذا من شأنه السماح لاختبار قدرات انبعاث قليلة الذباب في وقت واحد.

الخلفية الوراثية تؤثر على أداء تجنب احة دبي للسيليكون.

ذبابة الفاكهة البطن هو كائن نموذج قوي للدراسات الجينية. وبالتالي فإنه من المهم تحديد ما إذا كان فحص يمكن استخدامها لdiscriminate خلفيات وراثية مختلفة. تم قياس استجابة أربعة أنواع مختلفة البرية (كانتون-S، أوريغون-R، سمرقند وإلوود) فيما يتعلق بهم من تجنب احة دبي للسيليكون المنبعثة من كانتون-S (الشكل 4). كانتون-S وإلوود ديك PI أعلى بالمقارنة مع ولاية أوريغون وسمرقند (P <0.05). وتبين هذه النتائج أن هناك عنصر وراثي وراء فسخ احة دبي للسيليكون، وأن هذا الاختبار لديه القدرة على إجراء دراسة هذا التأثير الجيني.

طول الفترة الزمنية اختيار تؤثر على الأداء.

مجموعة من البيانات التمثيلية المعروضة في أرقام 1 و 2 و 3 و 4 أيضا توضيح تأثير طول الفترة الزمنية الممنوحة للالمستجيبين أن تقرر أي قارورة يتجنبون. عندما تعطى كانتون-S المستجيبين 30 إلى 45 ثانية لاختيار قارورة المفضلة لديهم، فإنهم عادة ما تصل العروض حول PI = 55 (الشكل 2، على التوالي الذكور PI= 57 ± 2. و 52 ± 11). عندما تعطى 60 ثانية، وأدائها هو أعلى، كما رأينا في الشكل 4 (PI = 77 ± 6.5).

الشكل (1)
الشكل 1. تجنب احة دبي للسيليكون هو ليس الجنس معين ولكن يعتمد على الذباب يجري التشديد. بار الرسوم البيانية تمثل المدى المتوسط ​​± من PI لتجنب قارورة رائحة التوتر عن طريق الذباب هياج (DSO) نقاط. تم اختبار الذكور (باللون الأحمر)، والإناث (برتقالي) معا (البني)، ثم عد بعد التجربة. الذباب أداء مماثل، بغض النظر عن جنسهم (في اتجاهين ANOVA). لكنهم تجنبها فقط قنينة DSO مليئة التي قد شدد الذباب من قبل (تحريكها ميكانيكيا)، وليس قنينة التي لم أكد الذباب (تدخل وتخرج القارورة التي كتبها انجذاب ضوئي، ف <0.05، توكي ومتعددة ما بعد المقارنة الاختبار)، أو قارورة جديدة (P <0.001، مقارنة متعددة ما بعد اختبار توكي). فيبالإضافة، لم يكن هناك فروق ذات دلالة إحصائية بين القارورة الطازجة والظروف غير شدد-الذباب، على الرغم من وجود تحيز التجربة قنينة جديدة - ن = 2-5 يعيد مع 40 الجنس المختلط الذباب لكل منهما، مع 45 ثانية الوقت اختيار (ن = 3 لطازجة قارورة، ن = 2 لقارورة مع الملفات غير الإجهاد، ن = 5 لقارورة مع الذباب أكد).

الشكل 2
الشكل 2. تجنب احة دبي للسيليكون مستقلة عن عدد من الذباب التي تم اختبارها. وتظهر بيانات الممثلين إلى أن عدد من كانتون-S الذباب المستجيب في T-متاهة ليس له تأثير على تجنب الاجتماعي للاحة دبي للسيليكون. أعطيت الذباب المستجيب 30 ثانية لاتخاذ قرار بين قارورة الطازجة وقارورة تحتوي على احة دبي للسيليكون (ن = 2-6 مكررات الداخلية في المحاكمة، 1-2 المحاكمات، والحد الأدنى من 5 نقاط البيانات في حالة، الرسوم البيانية وتمثل متوسط ​​± SEM)

الشكل (3)

الشكل (4)
الرقم 4. وقت الاختيار والخلفية الوراثية للذباب الفاكهة يؤثر على استجابة إلى احة دبي للسيليكون. كانتون-S والمورثات إلوود تعرض تجنب أقوى من احة دبي للسيليكون من ولاية أوريغون وسماrkand (ف <0.05 *، اختبار t المقارنة إلى كانتون-س). أعطيت الذباب الرد 1 دقيقة. أن تقرر بين قارورة الطازجة وقارورة تحتوي على احة دبي للسيليكون (ن = 4-5 مكررات الداخلية في المحاكمة، 2 محاكمات مستقلة، الرسوم البيانية وتمثل متوسط ​​± SEM)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يصف هذا البروتوكول إجراء مفصل لتجنب الفحص الاجتماعي. سوف كانتون-S تجنب فقط قارورة فيها الذباب قد سبق وأكد ميكانيكيا، وأن الجنس وعدد من المستجيبين لا يؤثر ذلك الأداء تجنب الاجتماعي. ومع ذلك، والخلفية الوراثية للالمستجيبين لديها تأثير كبير.

وفيما يلي عدة خطوات حاسمة لأداء هذه التجربة بنجاح: 1) نقل دائما الذباب 2 ساعة قبل التجربة والتأكد من عدم تعكير صفو بيئتهم. 2) إجراء التجربة دائما في الوقت نفسه من اليوم، من الناحية المثالية بين الوقت Zeitgeber بعد ZT5 (لساعات ظهور النور) وZT9 للحد من التباين في الأداء مرتبطة إيقاع الساعة البيولوجية والاختلاف وبالتالي من الممكن في مستويات تحرك والنشاط؛ 3) لاحظ درجة الحرارة والرطوبة الظروف عند تنفيذ التجربة. درجة حرارة حوالي 23-25 ​​درجة مئوية والرطوبة فوق 30٪ هي الأفضل. 4) تأكد من عدم دisturb جهاز T-متاهة خلال فترة قرار الذباب. 5) تأكد من الهواء خارج قارورة جديدة لا يقل عن 24 ساعة قبل استخدامها. و6) خلال التجربة أنه من المهم دائما تغيير موقع اختبار قارورة في جهاز T-متاهة لتجنب تفضيل لجانب واحد من T-المتاهة. على الرغم من أن اختبارات إضافية تحتاج إلى القيام به لتأكيد هذا، تجريبيا يبدو أن احة دبي للسيليكون يهرب من "الإجهاد" القارورة في أقل من 5 دقائق. في المقابل، يبدو أن الذباب هي قادرة على ينبعث احة دبي للسيليكون يصل إلى 1 ساعة بعد أن أكد.

هناك العديد من الاعتبارات التي يجب أن تؤخذ بعين الاعتبار في البروتوكول. العلاقة بين سن الطاير والاجتماعي تجنب غير معروف حاليا. لذلك، فمن المستحسن لأداء التجربة مع ما لا يزيد عن أسبوعين الذباب القديمة عند 25 ° C، والتغيرات السلوكية المرتبطة بالشيخوخة لا تظهر قبل هذا السن 37. الذباب تزاوج (الجنسين مختلطة إيواء) يتم جمعها للتجربة كماومن غير المعروف كيف يتأثر انبعاث احة دبي للسيليكون قبل وضع التزاوج من الذباب. على الرغم من أن المخرجات السلوكية من DSO تجنب لا يتأثر حسب الجنس، قد يكون دوائر الدماغ الكامنة ديمبرافيك جنسيا، ويستحسن عدم خلط الذكور والإناث الذباب. وأخيرا، انخفاض في عدد من باعث الذباب يؤدي إلى انخفاض في تجنب، وربما ترتبط إلى انخفاض في المجموع احة دبي للسيليكون المنبعثة. ولكن، ما يكفي DSO لا يزال حاضرا مع الذباب 10 فقط، مما يؤدي إلى تجنب قوي وقابلة للتكرار.

الحد من الوقت المقرر من الذباب المستجيب من 60 ثانية إلى 30 ثانية، والنتائج أيضا في الحد من PI لكانتون-S الذباب. ويمكن استخدام هذا كأداة للتمييز لشروط أو الطفرات التي الذباب أداء أفضل من كانتون-S. وهكذا، في حالته الراهنة، وتجنب فحص الاجتماعي يمكن أن تستخدم كنموذج السلوكي لاختبار تأثير الجينات والبيئة على احة دبي للسيليكون فسخ العقد. بعد إتقان هذه التقنية، والخطوات المستقبلية التي يمكن اتخاذهالإدراج القرار الوقت المثالي لتجنب واحة دبي للسيليكون العدد الدقيق للذباب باعث التي يجب أن تستخدم للحصول على تجنب فحص الاجتماعي للعمل على النحو الأمثل.

يمكن أن يحدث الحد الذي قد ينشأ في المسوخ اختبار إذا كان المستجيبين لها الفقراء تحرك. تحديد تجريبيا وقتا أطول لاختيار هذه المسوخ قد مواجهة هذا تنقل الفقراء. وبالمثل، والذباب مع أوجه القصور الحسية التي من شأنها منع الكشف عن CO 2 - أن عنصرا رئيسيا من احة دبي للسيليكون، أو المكون غير معروف الآخر من DSO لا تكون قادرة على أن تكون اختبارها في هذا الاختبار.

لا يوجد حاليا أي فحص آخر يسمح الكمي لهذا الرد. وعلى الرغم من أنه قد تبين أنه CO 2 هو مكون من 19 احة دبي للسيليكون، لم يتم بعد تحديد المكونات الأخرى للإشارة، وكذلك الناقلات العصبية تشارك في اختيار المبذولة لتجنب الأفراد وشدد الآخرين. وبالمثل، فإن الآلية التي يدفع flieالصورة لتنبعث منها غير معروفة احة دبي للسيليكون. ويمكن في هذا الفحص استخدامها بوصفها كبار الفحص التشخيصي مقاعد البدلاء إضافي لتحديد الشخصية السلوكي الاجتماعي والعام للمتحولة، أو المعاملة البيئة. على سبيل المثال، يمكن للمرء مقارنة والقياس الكمي للفضاء الاجتماعي، أي المسافة إلى أقرب جار 23، لتجنب الاجتماعي من الذباب وشدد. كلا السلوكيات تتطلب الاستجابة إلى وجود أشخاص آخرين، وصنع القرار من الاقتراب أو لتفاديها. وهذه هي طرق بسيطة للغاية لكنها قوية لتشريح الدوائر الدماغ والنواقل العصبية المعنية. يكون لهذه النماذج السلوكية أيضا إمكانية هائلة يمكن استخدامها لأغراض الفحص.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stereo Zoom Microscope  Nikon   SMZ-645 Any other standard scope for fly handling would work
Small paint brushes  for pushing flies
Porous Polyethylene, 12" x 12" Sheet Flystuff - Genesee 46-100 http://www.flystuff.com/ProductInfo.php?productID=46-100
Porous Plastic sheet for the cold anesthesia box
Mini-Alarm Timer/Stopwatch
Sharpie pens
Adhesive Tape
Mini vortex Fisher 14-955-151  http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail
For mechanical agitation of the flies - any vortex would work.
Corning Life Sciences DL No.:352017, Falcon test tube; round bottom; disposable; no closure, 14 ml; 17 x 100 mm Fisher 14-959-8    http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalogId=29104&productId=2771811&distype=0&highlightProductsItemsFlag=Y&fromSearch=1&searchType=PROD&hasPromo=0
These snap in place in the in-house made T-maze and counter-current apparatus (see text)
cotton balls to close the vials after the experiment.
trifold board and white bench cover to provide a white background, and a homogeneous light.
white bench cover
pounding pad any mouse pad works.
large black cloth to cover the counter-current apparatus in phototaxis response.
cool-white light  Home Depot 1000516563 http://www.homedepot.ca/product/illume-26-fluorescent-plug-in-linear/911423
any similar linear light with fluorescent light bulb cool-white at 13-15 W would work

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fry, S. N., Rohrseitz, N., Straw, A. D., Dickinson, M. H. TrackFly: virtual reality for a behavioral system analysis in free-flying fruit flies. J Neurosci Methods. 171, 110-117 (2008).
  2. Slawson, J. B., Kim, E. Z., Griffith, L. C. High-resolution video tracking of locomotion in adult Drosophila melanogaster. J Vis Exp. 24, 1096 (2009).
  3. Dankert, H., Wang, L., Hoopfer, E. D., Anderson, D. J., Perona, P. Automated monitoring and analysis of social behavior in Drosophila. Nat Methods. 6, 297-303 (2009).
  4. Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nat Methods. 6, 451-457 (2009).
  5. Simon, J. C., Dickinson, M. H. A new chamber for studying the behavior of Drosophila. PLoS One. 5, 8793 (2010).
  6. Wang, L., Dankert, H., Perona, P., Anderson, D. J. Inaugural Article: A common genetic target for environmental and heritable influences on aggressiveness. in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 5657-5663 (2008).
  7. Schneider, J., Dickinson, M. H., Levine, J. D. Social structures depend on innate determinants and chemosensory processing in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2, 17174-17179 (2012).
  8. Miyamoto, T., Amrein, H. Suppression of male courtship by a Drosophila pheromone receptor. Nat Neurosci. 11, 874-876 (2008).
  9. Villella, A., Hall, J. C., Jeffrey, C. H. Chapter 3 Neurogenetics of Courtship and Mating in Drosophila. Advances in Genetics. 62, 67-184 (2008).
  10. Ejima, A., Griffith, L. C. Courtship Initiation Is Stimulated by Acoustic Signals in Drosophila melanogaster. PLoS ONE. 3, 3246 (2008).
  11. Mery, F., et al. Public Versus Personal Information for Mate Copying in an Invertebrate. Current Biology. 19, 730-734 (2009).
  12. Montell, C. A taste of the Drosophila gustatory receptors. Curr. Opin. Neurobiol. 19, 345-353 (2009).
  13. Billeter, J. -C., Atallah, J., Krupp, J. J., Millar, J. G., Levine, J. D. Specialized cells tag sexual and species identity in Drosophila melanogaster. Nature. 461, 987-991 (2009).
  14. Krupp, J. J., et al. Social experience modifies pheromone expression and mating behavior in male Drosophila melanogaster. Curr Biol. 18, 1373-1383 (2008).
  15. Kent, C., Azanchi, R., Smith, B., Formosa, A., Levine, J. D. Social context influences chemical communication in D. melanogaster males. Curr Biol. 18, 1384-1389 (2008).
  16. Levine, J. D., Funes, P., Dowse, H. B., Hall, J. C. Resetting the Circadian Clock by Social Experience in Drosophila melanogaster. Science. 298, 2010-2012 (2002).
  17. Ganguly-Fitzgerald, I., Donlea, J., Shaw, P. J. Waking Experience Affects Sleep Need in Drosophila. Science. 313, 1775-1781 (2006).
  18. Billeter, J. -C., Levine, J. D. Who is he and what is he to you? Recognition in Drosophila melanogaster. Curr. Opin. Neurobiol. 23, 17-23 (2013).
  19. Suh, G. S., et al. A single population of olfactory sensory neurons mediates an innate avoidance behaviour in Drosophila. Nature. 431, 854-859 (2004).
  20. Bonini, N. A Tribute to Seymour Benzer 1921-2007. 180, 1265-1273 (2008).
  21. Castermans, D., et al. The neurobeachin gene is disrupted by a translocation in a patient with idiopathic autism. Journal of Medical Genetics. 40, 352-356 (2003).
  22. Medrihan, L., et al. Neurobeachin, a protein implicated in membrane protein traffic and autism, is required for the formation and functioning of central synapses. J Physiol. 587, 5095-5106 (2009).
  23. Simon, A. F., et al. A simple assay to study social behavior in Drosophila: measurement of social space within a group. Genes Brain Behav. 11, 243-252 (2012).
  24. Venkatesh, T., et al. Cold Spring Harbor Meeting: From Molecules to Circuit Behavior. , Cold Spring Harbor Laboratories. Cold Spring Harbor, NY. (2013).
  25. Hamilton, P. J., et al. De novo mutation in the dopamine transporter gene associates dopamine dysfunction with autism spectrum disorder. Mol Psychiatry. 18, 1315-1323 (2013).
  26. Gadow, K. D., et al. Association of dopamine gene variants, emotion dysregulation and ADHD in autism spectrum disorder. Research in Developmental Disabilities. 35, 1658-1665 (2014).
  27. Fernandez, R. W., Akinleye, A. A., Nurilov, M., Rouzyi, Z., Simon, A. F. 54th Annual Drosophila Research Conference, , (2014).
  28. Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration. J Vis Exp. , 2504 (2011).
  29. Connolly, J. B., Tully, T. Drosophila: A Practical Approach. Roberts, D. B. 1, IRL. New York, NY. 265-317 (1998).
  30. Tully, T., Quinn, W. G. Classical-conditioning and retention in normal and mutant Drosophila melanogaster. J Comp Physiol [A]. 157, 263-277 (1985).
  31. Krashes, M. J., Waddell, S. Drosophila Aversive Olfactory Conditioning. Cold Spring Harbor Protocols. 2011, (2011).
  32. Ejima, A., Griffith, L. C. Ch. 30. Drosophila Neurobiology, A Laboratory Manual. Zhang, B., Freeman, M. R., Waddell, S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring, NY. 475-481 (2010).
  33. Benzer, S. Behavioral mutants of Drosophila melanogaster isolated by countercurrent distribution. PNAS. 58, 1112-1119 (1967).
  34. Simon, A. F., Shih, C., Mack, A., Benzer, S. Steroid control of longevity in Drosophila melanogaster. Science. 299, 1407-1410 (2003).
  35. Vaux, D. L. Research methods: Know when your numbers are significant. Nature. 492, 180-181 (2012).
  36. Stowers, L., Logan, D. W. Sexual dimorphism in olfactory signaling. Curr. Opin. Neurobiol. 20, 770-775 (2010).
  37. Simon, A. F., Liang, D. T., Krantz, D. E. Differential decline in behavioral performance of Drosophila melanogaster with age. Mechanisms of Ageing and Development. , 127-647 (2006).

Tags

علم الأعصاب، العدد 94، والسلوك الاجتماعي، وتجنب الاجتماعي،
الفحص مباشرة للالكمي لتجنب الاجتماعي في<em&gt; ذبابة الفاكهة السوداء</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fernandez, R. W., Nurilov, M.,… More

Fernandez, R. W., Nurilov, M., Feliciano, O., McDonald, I. S., Simon, A. F. Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (94), e52011, doi:10.3791/52011 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter