Summary
DNA og proteiner sekvens-specifikt mærket med affinitet eller fluorescerende reportergrupper hjælp af DNA eller protein methyltransferaser og syntetiske cofaktor analoger. Afhængigt af cofaktor specificitet enzymer, aziridinen eller dobbelt aktiverede cofaktor analoger er ansat for en- eller to-trins mærkning.
Abstract
S -Adenosyl-L-methionin (AdoMet eller SAM) -afhængig methyltransferaser (MTase) katalyserer overførsel af den aktiverede methylgruppe fra AdoMet til bestemte positioner i DNA, RNA, proteiner og små biomolekyler. Denne naturlige methyleringsreaktion kan udvides til en bred vifte af alkyleringsreaktioner anvendelse af syntetiske cofaktor analoger. Udskiftning af den reaktive sulfonium centrum af AdoMet med en aziridinring fører til cofaktorer, som kan kobles med DNA ved forskellige DNA MTases. Disse aziridinforbindelser cofaktorer kan udstyres med reportergrupper ved forskellige positioner af adeningruppen og anvendt til S Equence-specifikke M ethyltransferase- jeg nduced L abel ning af DNA (SMILING DNA). Som et typisk eksempel giver vi en protokol til biotinylering af pBR322 plasmid-DNA i 5'-ATCG A T-3'-sekvensen med DNA MTase M.BseCI og aziridin cofaktor 6BAz iet trin. Forlængelse af den aktiverede methylgruppe med umættede alkylgrupper resulterer i en anden klasse af AdoMet analoger, som anvendes til m ethyltransferase-rettet T ransfer af A ctivated G roups (mTAG). Da de udvidede sidekæder aktiveres ved sulfonium centrum og umættet binding, er disse cofaktorer kaldes dobbelt aktiverede AdoMet analoger. Disse analoger ikke kun fungerer som cofaktorer for DNA MTases, ligesom aziridin cofaktorer, men også til RNA, protein og små molekyler MTases. De anvendes typisk til enzymatisk modifikation af MTase substrater med unikke funktionelle grupper, der er mærket med reportergrupper i en anden kemisk trin. Dette er eksemplificeret i en protokol til fluorescens mærkning af histon H3 protein. En lille propargylgruppe overføres fra cofaktor analog SeAdoYn til proteinet af histon H3 lysin 4 (H3K4) MTase set7 / 9 efterfulgt af klik mærkningalkynylated histon H3 med TAMRA azid. MTase-medieret mærkning med cofaktor analoger er en nødvendig teknologi for mange spændende applikationer, herunder identifikation og funktionel undersøgelse af MTase substrater samt DNA genotypebestemmelse og methylering detektion.
Introduction
Særlig mærkning af nukleinsyrer 1,2 og proteiner 3,4 er af stor interesse for funktionelle karakteriseringer, medicinsk diagnose og (nano) bioteknologi. Her præsenterer vi en enzymatisk mærkning metode til disse biopolymerer som er baseret på S -adenosyl-L-methionin (AdoMet eller SAM) -afhængig methyltransferaser (MTases). Denne klasse af enzymer (EF 2.1.1.) Er rettet mod individuelle nukleofile positioner (nitrogen, oxygen, svovl og carbonatomer) inden for specifikke rester af nukleinsyrer og proteiner og naturligt overfører det aktiverede methylgruppe af cofaktor AdoMet (figur 1A) 5. Desuden kan MTases udnytte syntetiske cofaktor analoger til særlig mærkning med affinitetsmærker, fluorophorer eller andre mærker (Figur 1B) 6. To klasser af AdoMet analoger er blevet udviklet: aziridinen cofaktorer for S Equence-specifikke M ethyltransferase- I L abel ing (smiler) 7 og dobbelt aktiverede AdoMet analoger til m ethyltransferase-rettet T ransfer af A ctivated G roups (mTAG) 8.
Figur 1: Reaktioner katalyseret af methyltransferaser (MTases) A. Methyl gruppe overførsel fra den naturlige cofaktor AdoMet (SAM) til forskellige substrater, herunder DNA, RNA, proteiner og små biomolekyler B. Mærkning / funktionalisering af nukleinsyrer og proteiner (NNNNN =.. basepar til DNA, nukleotider for RNA og aminosyrer til proteiner; XXXXX = genkendelsessekvens af MTase med målresten i grøn) med syntetiske cofaktor analoger. Aziridinen cofaktorer indeholdende en reportergruppe (blå kugle)fastgjort til adeninringen er sekvens specifikt koblet med målresten (til venstre) og dobbelt-aktiveret AdoMet analoger føre overføre udvidede alkylkæder bærer en kemisk reporter Y (højre), som kan mærkes ved bioorthogonal Click-reaktion i et andet trin. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Aziridinen cofaktorer fungerer bedst med DNA MTases. De indeholder en tre-leddet ring med et nitrogenatom 9 (eller et N -mustard 10,11) i stedet for sulfonium center som reaktiv gruppe. Protonering af dette nitrogenatom aktiverer aziridinringen for nukleofilt angreb af targetnukleotidsekvensen som fører til kovalent kobling af hele cofaktor med DNA. Ved at binde reportergrupper til adeninringen aziridinen cofaktorer kan anvendes i kombination med DNA MTases at mærke DNA i et trin (
Figur 2:. Sekvensspecifikke ettrins-biotinylering af DNA med M.BseCI og 6BAz DNA MTase M.BseCI genkender den dobbeltstrengede DNA-sekvens 5'-ATCG A T-3 'og naturligt methylerer aminogruppen i den anden adenin Resten (grøn) ved hjælp af AdoMet. Med aziridinen cofaktor 6BAz løbet af reaktionen ændres og M.BseCI fører til sekventere specifik DNA biotinylering ved at koble hele cofaktor herunder biotin (blå) med mål adenin. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Dobbelte aktiverede AdoMet analoger indeholder udvidet umættede sidekæder i stedet for en methylgruppe på sulfonium centrum (figur 1B 20. Den umættede dobbelt eller tredobbelt binding i β-holdning til sulfonium center elektronisk kompenserer ugunstige steriske virkninger inden overgangstilstanden via konjugering stabilisering. Da både sulfonium centrum og umættet binding aktivere sidekæden til enzymatisk overførsel, blev disse cofaktorer navngivet dobbelt aktiverede AdoMet analoger. Typisk bliver de brugt til at overføre sidekæder med unikke kemiske grupper (kemiske reportere), ligesom amino, alkyn og azidgrupper, for kemo-selektiv mærkning i et andet trin 8,21. Generelt kan dobbeltklikke aktiveret AdoMet analoger ikke blot fungerer som cofaktorer til DNA MTases 8,20,21, men også for RNA MTases 22,23 og proteinafgrøder MTases 24-28 muliggør supplerende mærkning af RNA og proteiner. Men de udvidede sidekæder er sterisk mere krævende end en methylgruppe og udvide MTase aktive steder af protein engineering er ofteDA kræves for at opnå effektive overførselshastigheder. En anden løsning på dette problem er at anvende en AdoMet analog med en lille propargylgruppe (tre carbonatomer), hvor den terminale alkyn tjener to funktioner: 1. Stabilisering af overgangen tilstand under enzymatisk overførsel og 2. reaktiv håndtag til følgende kemiske modifikationer af kobber- katalyseret azid-alkyn cycloaddition (CuAAC) klik kemi. Det viste sig, at den resulterende propargylic AdoMet analog 29 er ganske ustabil under neutrale eller let basiske betingelser og kun af begrænset nytte. Denne ulempe kan fastsættes ved at erstatte svovlatomet med selen. Den resulterende cofaktor 5 '- [(Se) [(3 S) -3-amino-3-carboxypropyl] prop-2-ynylselenonio] -5'-deoxyadenosin (SeAdoYn, figur 3) er accepteret af vildtype-DNA, RNA og protein MTases 30-32 som ophæver behovet for protein engineering i mange tilfælde. Dette er eksemplificeret ved fluorescens pro tein mærkning med histon H3 lysin 4 (H3K4) MTase set7 / 9 33 (figur 3, se protokol afsnit 3: To skridt protein mærkning via dobbelte aktiverede cofaktorer).
Figur 3:. Sekvens-specifikke totrins fluorescens mærkning af histon H3 med set7 / 9 SeAdoYn og TAMRA azid protein MTase set7 / 9 naturligt methylerer aminogruppen i lysin 4 i histon H3 (H3K4, grøn) ved hjælp af AdoMet. Med dobbelt-aktiverede cofaktor SeAdoYn den MTase overfører en lille propargylgruppe (rød) til lysinresten. Vedlagte terminal trippelbinding derefter selektivt modificeret på en bioorthogonal klik reaktion (kobber-katalyseret azid-alkyn cycloaddition, CuAAC) med azid-derivatiseret TAMRA (tetramethylrhodamin, blå) fluorophor.load / 52014 / 52014fig3highres.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Generelle instruktioner
- Store aziridin cofaktor 6BAz (i DMSO) og protein MTase set7 / 9 ved -80 ° C, og alle andre reagenser, herunder dobbelt-aktiveret cofaktor SeAdoYn og DNA MTase M.BseCI (i 50% glycerol) ved -20 ° C.
- Bestem koncentrationen af 6BAz og SeAdoYn via UV / Vis-spektroskopi hjælp extinktionskoefficienterne ε 269 nm (6BAz) = 16.000 cm -1 M -1 og ε 260 nm (SeAdoYn) = 15400 cm-1 M-1 i deioniseret vand. Bestemme koncentrationen af MTases ved Bradford assay eller, hvis ekstinktionskoefficienten er tilgængelig, via direkte absorption ved 280 nm.
- Prøv at undgå at skabe bobler af intensiv pipettering eller vortex for at forhindre tab af enzymaktivitet. I stedet blandes ved forsigtigt at pipettere op og ned.
- Når du tilføjer aziridinforbindelser cofaktorer fra stamopløsninger i DMSO sørge for, at den endelige DMSO-koncentration i assayet er mindreend 5%. Altid omfatte 10 mM magnesiumioner i assaypuffer for at forhindre ikke-specifikke reaktioner med DNA.
- Når du tilføjer dobbelt aktiverede cofaktorer fra sure stamopløsninger bruge små volumener (stærkt koncentrerede stamopløsninger) for at undgå pH-ændringer, og sørg for, at pH-værdien af testoploesningen ikke ændres væsentligt. Undgå thioler, f.eks β-mercaptoethanol eller dithiothreitol (DTT), i assaypuffer, fordi de kan forstyrre Click-reaktion ved kompleksdannelse af de krævede kobberioner.
2. Et-trins Mærkning af DNA via aziridinen Cofaktorer
- Sekvens-specifikke Methyltransferase-induceret Label ING (smiler) af plasmid-DNA med M.BseCI DNA MTase og aziridinen cofaktor 6BAz.
- Optøs cofaktor opløsning ved 20 ° C og forberede reaktionsblandingerne på is.
- Ud over assayet udføre en "cofaktor" kontrol, for at visualisere eventuelle ikke specifikke modifikationer, og en & #8220; enzym "kontrol, for at sikre, at MTase præparatet er fri for den naturlige cofaktor AdoMet.
- For assay mix 2 pi 10x modifikation puffer (indeholdende 100 mM Tris-HCI, 100 mM MgCl2, 20 mM β-mercaptoethanol, pH 7,4), 2 pi pBR322 (0,5 ug / ul), 10 ækv. M.BseCI pr genkendelsessekvens på DNA (1-genkendelsessekvens i pBR322) og aziridin cofaktor 6BAz til en slutkoncentration på 60 uM i et totalt volumen på 20 pi. Tilføj cofaktor og DNA MTase sidste.
BEMÆRK: β-mercaptoethanol er giftigt, ætsende og miljøskadelige. - For "cofaktor" kontrol tilføje deioniseret vand i stedet for M.BseCI og til "enzym" kontrol tilføje deioniseret vand i stedet for 6BAz.
- Bland løsninger ved forsigtigt at pipettere op og ned.
- Inkuber rørene ved 55 ° C i 1 time.
- Centrifuge kort for at samle al væske i bunden af rørene.
- Restriction-modifikation assay til at verificere DNA modifikation.
- Der fremstilles en opløsning ved at blande 10 pi 10x R.TaqI puffer (indeholdende 100 mM Tris-HCI, 50 mM MgCl2, 1 M NaCl, 1 mg / ml bovint serumalbumin, pH 8,0), 80 pi deioniseret vand og 3,3 pi af restriktionsendonuklease (REase) fra Thermus aquaticus (R.TaqI, 10 U / ul). Sørg for at tilføje REase i det sidste trin.
- Til hvert rør fra 2.1.7 tilsættes 2 pi 10x R. Taql-puffer og 28 pi af opløsning fra ovenfor (2.2.1).
- Bland løsninger ved forsigtigt at pipettere op og ned.
- Inkuber rørene ved 65 ° C i 30 minutter.
- Centrifuge kort for at samle al væske i bunden af rørene.
- Eltrafik shift assay (EMSA) med streptavidin til verificering af den funktionelle modifikation.
- Fjern 25 pi fra hvert rør (2.2.5) og tilsæt 2,4 pi af en streptavidin-opløsning (1 mM med hensyn til streptavidin monomer i streptavidin buffer indeholdende 100 mM Na 2 HPO 4, 100 mM NaCl, pH 7,5; 4 ækvivalenter af den samlede biotin). Tilføj 2.4 pi streptavidin buffer til de resterende rør.
- Inkuber alle rør ved 37 ° C i 1 time.
- Analyse via agarosegelelektroforese.
- Tilsæt 5 pi 6x loading buffer (0,25% bromphenolblåt, 30% glycerol) til hvert rør.
- Bland de løsninger forsigtigt.
- Load 10 pi af hver prøve i brøndene på en agarosegel (1% agarose i 0,5x TBE puffer indeholdende 1x GelRed fra en 10.000 x stamopløsning).
- Kør gel i 0,5x TBE buffer med 80 V i ca. 1 time.
- Visualisere DNA-bånd på en UV-tabel (312 nm) med et CCD-kamera udstyret med et filter (540 ± 50 nm).
BEMÆRK: UV-lys er skadeligt for øjnene og huden.
3. To-trins Protein Mærkning via dobbelte Aktiveret Cofaktorer
- Methyltransfslette-Instrueret Overførsel af aktiverede grupper (mTAG) med set7 / 9 og dobbeltklik aktiveret cofaktor SeAdoYn for histon H3 lysin 4 mærkning (modifikation trin).
- Optø komponenterne og forberede reaktionsblandingerne på is. BEMÆRK: Hold altid SeAdoYn afkølet for at undgå nedbrydning.
- Ud over assayet udføre en "cofaktor" kontrol, for at visualisere eventuelle ikke specifikke modifikationer, og en "enzym" kontrol, for at udelukke ikke-specifikke reaktioner fluorescerende probe.
- Forbered et assay-opløsning (20 pl) indeholdende modifikation buffer (50 mM Tris-HCI, 5% glycerol, pH 8,5), 10 uM histon H3, 10 uM set7 / 9 og 600 pM SeAdoYn (blanding af begge epimerer på selen). I de sidste trin tilføje cofaktor og derefter MTase.
- For "cofaktor" kontrol forberede et assay opløsning som i 3.1.3 og tilsættes 60 mM AdoMet til at konkurrere med den syntetiske cofaktor. For "enzym" kontrol tilføje deioniseret vand i stedet for SeAdoYn.
- Bland løsninger ved langsomt at pipettere op og ned. PH kontrolleres ved tilsætning af 1 pi af hver opløsning til det øverste felt af en pH-strimler (pH fra 5 - 10).
- Der inkuberes ved 37 ° C i 2 timer.
- I mellemtiden fremstille en 12% SDS polyacrylamidgel (kører gel: 357 mM Bis-Tris pH 6,5-6,8, 0,1% (w / v) APS, 0,04% (v / v) TEMED og 12% acrylamid / bisacrylamid 37,5: 1 ; loading gel: 357 mM Bis-Tris pH 6,5-6,8, 0,1% (w / v) APS, 0,04% (v / v) TEMED og 5% acrylamid / bisacrylamid 37,5: 1).
BEMÆRK: acrylamid / bisacrylamid er giftigt og sundhedsskadelige. Brug handsker under denne procedure.
- Kemisk mærkning af alkinylated lysin 4 i histon H3 via kobber-katalyseret azid-alkyn cycloaddition (CuAAC) (mærkning trin).
- Lige før slutningen af modifikationsreaktion udarbejde en 5x klik blanding indeholdende 3 mM CuSO4, 3 mM tris (3-hydroxypropyl-triazolylmethyl) amin (THPTA), 250 mM natriumascorbat og 6 mM TAMRA azid med ensamlet volumen på 20 pi.
- Tilsæt 5 pi af frisk fremstillet 5x klik blanding til hvert rør for at starte CuAAC og stands modificeringsreaktionen.
- Bland forsigtigt ved pipettering op og ned.
- Beskyttelse af alle rør med aluminiumsfolie fra lys for at undgå foto-blegning af fluoroforen.
- Inkuber ved 20 ° C i 1 time.
- Protein udfældning at fjerne overskud af fri TAMRA fluorofor.
- For at undgå outshining af det fluorescerende mærkede histon H3 ved intensiv in-gel fluorescens af gratis TAMRA fluorophor, fjerne overskydende fluorofor ved udfældning af proteiner (3.3.2 - 3.3.4) 34.
- Tilføj 75 pi methanol, 18,8 pi chloroform og 50 pi deioniseret vand til hvert rør og vortex kortvarigt efter hver tilsætning. Centrifuger ved 16.000 xg i 5 min. Fjern den øvre fase uden at forstyrre grænsefladen lag, som indeholder proteinet.
- Tilføj 56,3 pi methanol til den resterende fase In hvert rør, vortex og centrifugeres ved 16.000 xg i 5 min for at pelletere proteinet. Fjern supernatanten. Gentag dette trin for at vaske pillen.
- Dæk de åbne rør med en fnugfri væv og lad dem tørre i 15-30 min.
- Analyse via SDS PAGE.
- Opløses de udfældede proteiner fra 3.3.4 i 20 pi SDS loading buffer (50 mM Tris-HCI, 2,5% (w / v) SDS, 10% (v / v) glycerol, 320 mM β-mercaptoethanol og 0,05% (vægt / v) bromphenolblåt, pH 6,8). Sørg for at opløse pellet ved skylning af væggene i rørene med en pipette.
- Inkuber prøverne ved 95 ° C i 10 min, og lad dem afkøle til 20 ° C.
- Centrifuge kort for at samle al væske i bunden af rørene.
- Læg hele beløbet for hver prøve i brøndene på en SDS polyacrylamidgel (3.1.7). Brug 50 mM MOPS, 50 mM Tris-X (Tris-base), 5 mM EDTA, 0,1% (w / v) SDS som løbebuffer til elektroforese.
- Kør gelen med 120 V i ca. 90 min.
- Visualisere i-gel fluorescens på en UV tabel (312 nm) med et CCD-kamera udstyret med et filter (540 nm ± 50 nm).
BEMÆRK: UV-lys er skadeligt for øjnene og huden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et-trins Mærkning af DNA via aziridinen Cofaktorer
Dette eksempel reaktion udføres med DNA MTase M.BseCI, som ændrer den anden adeninrest inden den dobbeltstrengede 5'-ATCG A T-3'-sekvensen og har en genkendelsessted på pBR322 plasmid (figur 4A). For at teste plasmid mærkning er pBR322 udfordret med restriktionsendonukleasen (REase) R.TaqI (5'-TCGA-3 '). R.TaqI har syv steder på pBR322, hvoraf den ene er inkluderet i M.BseCI site. Hvis der opstår mærkning vil M.BseCI stedet være beskyttet mod spaltning og et nyt fragment med 683 basepar (bp) vil danne mens to andre fragmenter vil forsvinde (315 og 368 bp). Selvfølgelig bør, når man analyserer DNA-mærkning med andre DNA MTases forskellige REases med tilsvarende genkendelsessekvenser anvendes.
Den agarosegel i figur 4B viser klart visesstemmelse af et nyt fragment med 683 bp (bane 3). Dette viser, at mærkningen af M.BseCI stedet opstod. Kun assay (bane 3) viser, at dette fragment. Den "cofaktor" kontrol (bane 5) samt "enzym" kontrol (bane 7) mangler dette bånd. Især "enzym" kontrol er vigtig, fordi den viser, at den naturlige cofaktor AdoMet er ikke til stede i enzympræparatet. Specificitet af mærkningen reaktionen påvises ved eltrafik shift assay (EMSA) ved tilsætning af streptavidin (figur 4B og detaljer i 4C). Eltrafik af 683 bp er retarderet, mens mobiliteten af alle andre fragmenter uden M.BseCI websted er uændret i forhold til kontrollerne (sammenlign bane 4 med bane 6 og 8).
Figur 4: Sekvensspecifik biotinylering af pBR322 plasmid-DNA med M.BseCI og 6BAz. A. Plasmid kort over pBR322 viser genkendelsessteder for M.BseCI (rød) og R.TaqI (grøn) samt længden af de forventede DNA-fragmenter i basepar (bp) efter restriktion med R.TaqI. B. Analyse af DNA opsplitning og EMSA ved agarosegelelektroforese. M = Marker, bane 1 og 2: plasmid DNA kun, bane 3 og 4: assay, bane 5 og 6: cofaktor "kontrol, bane 7 og 8:" enzym kontrol. Banerne 2, 4, 6 og 8 yderligere indeholde streptavidin. C. Forstørret indsat fra B. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
To-trins Mærkning af proteiner via dobbelte Aktiveret Cofaktorer
Som et eksempel til to-trins mærkning af MTase substrater med dobbelt-aktiveret AdoMet analoger vi valgte histonH3 lysin 4 (H3K4) MTase set7 / 9 og den lille SeAdoYn cofaktor. Efter enzymatisk overførsel af den aktiverede propargylgruppe til histon H3 substrat (første trin), er den terminale alkyn kemisk mærket med et azid-modificerede TAMRA fluorophor ved CuAAC klik kemi (andet trin) (sammenlign figur 3). Analyse af mærkning reaktionen udføres ved SDS-PAGE og i-gel fluorescenspåvisning (figur 5A). Assayet (bane 1) viser en fluorescerende bånd svarende til histon H3 indikerer, at sidekæden af cofaktor held blev overført og det modificerede protein mærket med TAMRA fluoroforen. Ingen bånd er synlige i "cofaktor" og "enzym" kontroller (bane 2 og 3) viser, at mærkning af histon H3 medieres af MTase. Derfor uspecifik kemisk mærkning enten af cofaktor alene (første trin) eller under CuAAC (andet trin) kan udelukkes. Den "cofaktor" kontrol udføres differently end i protokollen for et-trins DNA-mærkning. Dette skyldes udfældning af histon H3 er mere effektiv i nærvær af set7 / 9 og udelade protein MTase kan føre til reducerede mængder af histon H3 i loading kontrol. Således har vi tilføjet en høj koncentration af den naturlige cofaktor AdoMet at konkurrere med SeAdoYn. Loading af histon H3 kan let kontrolleres ved farvning af gelen med Coomassie Blue efter fluorescens detektion.
MTase substrater kan også mærkes med biotin i stedet for fluoroforer ved hjælp azid-derivatiseret biotin i den anden kemiske trin 30. Biotinylering af proteiner er bekvemt analyseret ved Western blotting med peberrodsperoxidase-konjugeret avidin. Dette er vist i figur 5B til biotinylering af histon H3 med set7 / 9 SeAdoYn og azid-modificeret biotin. Analysen i bane 1 viser en klar bånd for den mærkede histon H3. Fraværet af bånd i "enzym" (bane 2)og "co-faktor" kontrol (bane 3) viser igen, at mærkning er specifik for MTase. Den "cofaktor" kontrol er simpelthen udføres i fravær af protein MTase fordi Western blot analyse ikke kræver fjernelse af overskud af biotin ved proteinudfældning.
Figur 5: Mærkning af histon H3 med proteinet MTase set7 / 9 og SeAdoYn efterfulgt af klik reaktioner med azid-derivatiserede etiketter. A. In-gel fluorescens af TAMRA-mærket histon H3 og kontroller samt farvning med Coomassie Blue for lastning kontrol. B. Western blot-analyse af biotinyleret histon H3 og kontrol ved hjælp af avidin-peberrodsperoxidase (HRP) konjugat. Eksperimentelle betingelser var meget lig dem for fluorescens mærkning i A (enzymatisk modifikation: 6.581 M histon H3, 10 uM set7 / 9, 600 uM SeAdoYn, i 50 mM Tris-HCI, 5 mM MgCl2, 5% glycerol, pH 9,0, 30 ° C, 3 timer; kemisk mærkning:. 0,6 mM CuSO4, 0,6 mM THPTA, 50 mM natriumascorbat, 1,2 mM biotin-azid, 37 ° C, 1 time) Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Et-trins mærkning af DNA med DNA MTases og aziridinforbindelser cofaktorer (smiler DNA) er en robust metode, men nogle aspekter bør overvejes, når planlægningen af forsøget.
Aziridinen cofaktor: The 6BAz koncentration for DNA-mærkning med M.BseCI var 60 pm. Ved brug af andre DNA MTases cofaktoren koncentrationen bør optimeres, f.eks koncentrationer så lave som 20 uM har været ansat med DNA MTase M.TaqI 19. Lave 6BAz koncentrationer har den fordel, at en firedobbelt overskud af streptavidin (bindingssteder med hensyn til hele mængden af biotin i assayet) kan tilsættes direkte efter inkubation med REase uden at interferere med analysen af EMSA. Ellers biotinyleret DNA bør renses for at fjerne overskydende cofaktor og undgå udtværing af DNA'et under agarosegelelektroforese. Når du tilføjer aziridinforbindelser cofaktorer fra stamopløsninger i DMSO sørge for, at den endelige DMSO-koncentration i the assay er mindre end 5%. For meget DMSO kan inaktivere enzymer. Opbevar aziridinforbindelser cofaktorer ved -80 ° C for at undgå nedbrydning.
DNA MTase: enzymatisk kobling af aziridinforbindelser cofaktorer med DNA kan føre til stærke produkt- hæmmere og DNA MTases skal anvendes i støkiometriske mængder. Derfor altid bruge mere end 1 ækvivalent DNA MTase. De fleste DNA MTases copurify med bundet AdoMet som skal fjernes ved omfattende dialyse eller vask enzymerne på en kolonne med store volumener puffer. Den "enzym" kontrol vil vise, om AdoMet er stadig til stede i enzympræparatet. Mærkning med M.BseCI kan også ske ved inkubation natten over ved 37 ° C.
Ændring buffer: med 10 mM magnesiumioner i bufferen for at forhindre ikke-specifikke reaktioner aziridinforbindelser cofaktorer med DNA. Hvis magnesiumioner føre til aktivering af kontaminerende nukleaser kan bariumioner tilsættes i stedet.
For sekvensen specifik mærkning af DNA ikke kun SMILING DNA, men også mTAG kan anvendes. Her dobbelt aktiverede cofaktorer anvendes til enzymatisk overførsel af sidekæder med unikke funktionelle grupper til DNA. Disse funktionelle grupper, f.eks primære aminer, kan ændres med en bred vifte af reportergrupper, herunder biotin eller fluoroforer, som NHS-ester kemi i et andet trin 8,35,36. Alternativt er vi begyndt at syntetisere dobbelt aktiverede AdoMet analoger med store sidekæder allerede indeholder reportergruppen og brugt dem til DNA-mærkning i én arbejdsgang.
De to-trins mTAG procedure for proteiner med dobbelt aktiverede cofaktor SeAdoYn mærkning held har været anvendt med en række protein MTases 30,31. Imidlertid bør følgende bemærkninger overvejes, før du udfører forsøget.
Double aktiveret cofaktor: Disse cofaktorer, herunder sø-doYn, opbevares under sure betingelser og skal man være omhyggelig, at pH-værdien af ændringen løsning ikke væsentligt ændrer ved cofaktor tilsætning. Vi altid kontrollere pH ved tilsætning af 1 pi af modifikation opløsningen til en pH strimmel, og hvis pH er for lav, tilsættes små mængder af natriumhydroxidopløsning (50 mM) for at justere pH. Desuden bør tilføjes cofaktor analoger i en lav volumen for at undgå pH-ændringer. Således bør minimale cofaktor koncentrationer nødvendige for fuld modifikation bestemmes for andre MTases og meget koncentreret cofaktor stamopløsninger foretrækkes. Cofaktor koncentrationer typisk varieres mellem 10 um og 600 uM. Den kemiske syntese af dobbelt-aktiverede cofaktorer typisk giver en ca. 1: 1 blanding af epimerer ved svovl eller selen og separation af det biologisk aktive epimer, der svarer til S -epimer af AdoMet, fra den inaktive epimer er ofte vanskeligt at opnå. Således cofaktor koncentrationertypisk gives til en blanding af isomerer. Dobbelte aktiverede cofaktor analoger er ganske ustabile ved stuetemperatur og skal opbevares ved -20 ° C. Sørg også for at tø stamopløsningerne på is og holde dem kolde under pipettering. De kan fryses igen, men for at sikre reproducerbar aktivitet anbefaler vi at lave portioner.
Protein MTase: For transformationer med dobbelt aktiverede cofaktorer de MTases kan anvendes i katalytiske mængder. Men MTases ofte langsomme enzymer med omsætningen tal i min -1 rækkevidde med den naturlige cofaktor AdoMet. Af praktiske grunde bruger vi ofte MTases i støkiometriske mængder og minimere inkubationstid og temperatur (typisk 10 minutter til 2 timer og 20 ° C til 37 ° C). Den "cofaktor" kontrol varierer, afhængigt af typen af reportergruppe og detektion. For biotin mærkning af MTase simpelthen udelades, og analysen kan udføres ved hjælp af Western blotting (figur 5B (figur 5A). Men hvis udfældning af histon H3 fører til tab af protein, SDS-PAGE kan udvides, og overskud af fri TAMRA fluorofor vil løbe ud af gelen med bromphenolblåt front.
Ændring buffer: Den optimale enzym buffer kan anvendes, men thioler, som dithiothreitol (DTT) og β-mercaptoethanol, bør undgås. De binder til kobberioner og B følgende CuAAC klik reaktion låse.
CuAAC Click-reaktion: Den endelige koncentration af TAMRA azid skal være dobbelt så høj som den alkyn koncentration. Ved brug af biologiske ekstrakter kobber og ligandkoncentration bør øges op til 5 mm hver. TAMRA azid er bedre opløseligt i DMSO end i vand. Kontroller, at den endelige koncentration af DMSO er mindre end 12%. Extended inkubationstider kan føre til protein skader og udtværing på SDS-polyacrylamidgel. Således bør mærkningsreaktionen enten stoppet af proteinudfældning eller tilføjelse af thioler.
Denne to-trins mærkning procedure kan også anvendes til at mærke protein MTase substrater med biotin enten til Western blot-påvisning (figur 5B) eller isolering med streptavidin-coatede magnetiske perler. Desuden kan dobbelt aktiverede AdoMet analoger anvendes til at mærke DNA, RNA og små naturlige produkter med tilsvarende MTases.
ve_content "> Sammenlignet med de fleste andre mærkningsmetoder for nukleinsyrer og proteiner, MTase-medieret mærkning har den fordel, at native substrater kan anvendes direkte og uden yderligere modifikation er påkrævet. Selvfølgelig skal der drages omsorg for, at de naturlige substrater ikke er blokeret ved methylering ved en tilsvarende MTase in vivo. Desuden MTase-medieret mærkning er meget fleksibel både i form af reporter-grupper, som omfatter biotin, fluorophorer eller andre molekylære mærker, samt mål for MTases. Rebase, en database for begrænsning endonucleaser og DNA MTases opregner mere end 700 eksperimentelt karakteriserede DNA MTases med hundredvis af forskellige genkendelsessekvenser spænder 2-8 bp 37 og det forventes, at mere end 200 forskellige MTases af alle typer er produceret i humane celle 38. En vigtig determinant for MTase aktivitet er om AdoMet analog passer ind i enzymets aktive sted. Selv om de fremlagte cofaktorer 6Baz og SeAdoYn er designet til at have små reaktive grupper, nogle MTases måske ikke umiddelbart acceptere dem. I disse tilfælde de aktive steder kunne udvides ved protein engineering som er påvist i DNA 35, RNA 23 og protein MTases 25-28 med sterisk mere krævende dobbelt aktiverede AdoMet analoger. Sekvens specifik mærkning af DNA og RNA med AdoMet analoger er af stor interesse for genotypebestemmelse (DNA kortlægning) 36 og methylering detektion 39, funktionelle studier af DNA / RNA og DNA / RNA-modificerende enzymer 15 samt for (nano) bioteknologi 13, 14 og genafgivelse 19. Andre metoder til sekvens specifik kovalente DNA-mærkning afhængige syntetiske triple helix-dannende oligodeoxynukleotider, peptidnukleinsyrer eller hårnål polyamider som målrettet apparaterne og sekvensspecifikke nicking endonukleaser (NEases) efterfulgt af nick translation mærkning.
Særlig mærkning af proteiner med dobbelt aktiverede AdoMet analoger er hovedsageligt rettet mod applikationer inden proteomiske forskning, fx identifikation af nye substrater for protein MTases i komplekse biologiske blandinger 27,28, men andre programmer, ligesom funktionelle undersøgelser, bør også være mulig. Selvom MTase-medieret mærkningen hovedsageligt udført med oprensede MTases in vitro, kan også opnås mærkning i levende celler, som er blevet rapporteret for nylig 40. Naturligvis mange andre metoder til specifikt protein mærkning er tilgængelige 3,4. Udover inkorporering af unaturlige aminosyrer ved hjælp af manipulerede celler kræver de typisk genetiske fusioner af proteinet af interesse med self-mærkning tags / PRoteins eller tags for enzym-medieret mærkning. I denne henseende korte peptidsekvenser, der tjener som substrater for protein MTases, fx N-terminale histon haler, kan fusioneres til et protein af interesse og specifikt mærket med AdoMet analoger og tilsvarende protein MTases.
Endelig kan den biokatalytiske repertoire af små molekyler MTases udvides med syntetisk AdoMet analoger 41-44. Dette udgør en ny tilgang til at indføre strukturelle diversitet i naturlige produkter, f.eks antibiotika eller polyketider, som bør finde interessante applikationer i screening for nye biologiske aktiviteter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6BAz | Synthesized according to Weinhold et al., Patent number US 8,129,106, published March 6, 2012. | ||
| β-Mercaptoethanol | Serva | 28625 | |
| Acetic acid | Fisher Scientific | 10304980 | |
| Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 | Serva | 10688 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500100 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Serva | 13375 | |
| Bis-Tris | Gerbu | 1304 | |
| Boric acid | Gerbu | 1115 | |
| Bromophenol blue Na salt | Serva | 15375 | |
| Copper(II) sulfate | Aldrich | C1297 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | 10020090 | |
| Coomassie Brilliant Blue | Serva | 17525 | |
| EDTA disodium salt | Gerbu | 1034 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| GelRed (10,000x in water) | Biotium | 41003 | |
| Glycerol (99.5%) | Gerbu | 2006 | |
| FastRuler Low Range DNA Ladder | Thermo Scientific | SM1103 | |
| Histone H3 | Expression plasmid obtained from Dr. Philipp Voigt and Prof. Danny Reinberg; expression and isolation according to T. J. Richmond et al., J. Mol. Biol. 1997, 272, 301-311. | ||
| M.BseCI | Expression plasmid obtained from Dr. Michael Kokkinidis; expression and isolation according to Kapetaniou et al., Acta Cryst. 2006, F63, 12-14. | ||
| Methanol | Fisher Scientific | 10675112 | |
| Magnesiumchloride hexahydrate | J.T. Baker | 4003 | |
| MOPS | Gerbu | 1081 | |
| Sodium chloride | Gerbu | 1112 | |
| pH strip (Neutralit) | Merck | 1,095,330,001 | |
| pBR322 | Thermo Scientific | SD0041 | |
| R.TaqI (10 u/µl) | Thermo Scientific | ER0671 | |
| SeAdoYn | Synthesized according to Willnow et al., ChemBioChem 2012, 13, 1167-1173. | ||
| Set7/9 | Expression plasmid obtained from Prof. Danny Reinberg, expression and isolation according to D. Reinberg et al., Genes Dev.2002, 16, 479-489. | ||
| Streptavidin | Gerbu | 3058 | |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma Life Science | A7631 | |
| SDS Granular | Gerbu | 1833 | |
| di-Sodium hydrogenphosphate | Merck | 106,586 | |
| TAMRA azide | Synthesized according to reference 30: Willnow et al., ChemBioChem 2012, 13, 1167-1173. | ||
| TaqI buffer (10x) | Thermo Scientific | B28 | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Acros Organics | 42058 | |
| Tris-HCl | Gerbu | 1028 | |
| Tris-X (TRIS-base) | Gerbu | 1018 | |
| Tris(3-hydroxypropyltriazolyl-methyl)amine (THPTA) | Sigma-Aldrich | 762342 |
References
- Gottfried, A., Weinhold, E.
- Zohar, H., Muller, S. J. Labeling DNA for single-molecule experiments: methods of labeling internal specific sequences on double-stranded DNA. Nanoscale. 3, 3027-3039 (2011).
- Hinner, M. J., Johnsson, K. How to obtain labeled proteins and what to do with them. Curr. Opin. Biotechnol. 21, 766-776 (2010).
- Wua, Y. -W., Goody, R. S. Probing protein function by chemical modification. J. Pept. Sci. 16, 514-523 (2010).
- Struck, A. -W., Thompson, M. L., Wong, L. S., Micklefield, J. S-Adenosyl-methionine-dependent methyltransferases: Highly versatile enzymes in biocatalysis, biosynthesis and other biotechnological applications. ChemBioChem. 13, 2642-2655 (2012).
- Klimasauskas, S., Weinhold, E. A new tool for biotechnology: AdoMet-dependent methyltransferases. Trends Biotechnol. 25, 99-104 (2007).
- Pljevaljcic, G., Schmidt, F., Weinhold, E. Sequence-specific Methyltransferase-Induced Labeling of DNA (SMILing DNA). ChemBioChem. 5, 265-269 (2004).
- Lukinavicius, G., Lapiene, V., Stasevskij, Z., Dalhoff, C., Weinhold, E., Klimasauskas, S. Targeted labeling of DNA by methyltransferase-directed Transfer of Activated Groups (mTAG). J. Am. Chem. Soc. 129, 2758-2759 (1021).
- Pignot, M., Siethoff, C., Linscheid, M., Weinhold, E. Coupling of a nucleoside with DNA by a methyltransferase. Angew. Chem. Int. Ed. 37, 2888-2891 (1998).
- Weller, R. L., Rajski, S. R. Design, synthesis, and preliminary biological evaluation of a DNA methyltransferase-directed alkylating agent. ChemBioChem. 7, 243-245 (2006).
- Du, Y., Hendrick, C. E., Frye, K. S., Comstock, L. R. Fluorescent DNA Labeling by N-Mustard Analogues of S-adenosyl-l-methionine. ChemBioChem. 13, 2225-2233 (2012).
- Pljevaljcic, G., Schmidt, F., Scheidig, A. J., Lurz, R., Weinhold, E. Quantitative labeling of long plasmid DNA with nanometer precision. ChemBioChem. 8, 1516-1519 (1002).
- Wilkinson, S., et al. Molecular scale architecture: engineered three- and four-way junctions. Bioconjugate Chem. 19, 470-475 (2008).
- Braun, G., et al. Enzyme-directed positioning of nanoparticles on large DNA templates. Bioconjugate Chem. 19, 476-479 (2008).
- Kim, S., et al. Enzymatically incorporated genomic tags for optical mapping of DNA binding proteins. Chem. Int. Ed. 51, 3578-3581 (2012).
- Rina, M., Bouriotis, V. Cloning purification and characterization of the BseCI DNA methyltransferase from Bacillus stearothermophilus. Gene. 133, 91-94 (1993).
- Sequence-specific detection of methylation in biomolecules. US Patent. Weinhold, E., Meier, T., Düfel, H., Markert-Hahn, C., Schmuck, R. , 8,129,106 (2012).
- Pljevaljcic, G., Pignot, M., Weinhold, E. Design of a new fluorescent cofactor for DNA methyltransferases and sequence-specific labeling of DNA. J. Am. Chem. Soc. 125, 3492-3410 (2003).
- Schmidt, F. H. -G., Hüben, M., Gider, B., Renault, F., Teulade-Fichou, M. -P., Weinhold, E. Sequence-specific Methyltransferase-Induced Labelling (SMILing) of plasmid DNA for studying cell transfection. Bioorg. Med. Chem. 16, 40-48 (2008).
- Dalhoff, C., Lukinavicius, G., Klimasauskas, S., Weinhold, E. Direct transfer of extended groups from synthetic cofactors by DNA methyltransferases. Nat. Chem. Biol. 2, 31-32 (2006).
- Lukinavicius, G., Tomkuviene, M., Masevicius, V., Klimasauskas, S. Enhanced chemical stability of AdoMet analogues for improved methyltransferase-directed labeling of DNA. ACS Chem. Biol. 8, 1134-1139 (2013).
- Motorin, Y., et al. Expanding the chemical scope of RNA:methyltransferases to site-specific alkynylation of RNA for click labeling. Nucleic Acids Res. 39, 1943-1952 (1943).
- Schulz, D., Holstein, J. M., Rentmeister, A. A chemo-enzymatic approach for site-specific modification of the RNA cap. Angew. Chem. Int. Ed. 52, 7874-7878 (2013).
- Peters, W., et al. Enzymatic site-specific functionalization of protein methyltransferase substrates with alkynes for click labeling. Angew. Chem. Int. Ed. 49, 5170-5173 (2010).
- Islam, K., Zheng, W., Yu, H., Deng, H., Luo, M. Expanding cofactor repertoire of protein lysine methyltransferase for substrate labeling. ACS Chem. Biol. 6, 679-684 (2011).
- Wang, R., Zheng, W., Yu, H., Deng, H., Luo, M. Labeling substrates of protein arginine methyltransferase with engineered enzymes and matched S-adenosyl-l-methionine analogues. J. Am. Chem. Soc. 133, 7648-7651 (2011).
- Islam, K., et al. Bioorthogonal profiling of protein methylation using azido derivative of S-adenosyl-l-methionine. J. Am. Chem. Soc. 134, 5909-5915 (2012).
- Islam, K., et al. Defining efficient enzyme-cofactor pairs for bioorthogonal profiling of protein methylation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 16778-16783 (2013).
- Binda, O., Boyce, M., Rush, J. S., Palaniappan, K. K., Bertozzi, C. R., Gozani, O. A chemical method for labeling lysine methyltransferase substrates. ChemBioChem. 12, 330-334 (2011).
- Willnow, S., Martin, M., Lüscher, B., Weinhold, E. A selenium-based click AdoMet analogue for versatile substrate labeling with wild-type protein methyltransferases. ChemBioChem. 13, 1167-1173 (2012).
- Bothwell, I. R., et al. Se-Adenosyl-l-selenomethionine cofactor analogue as a reporter of protein methylation. J. Am. Chem. Soc. 134, 14905-14912 (2012).
- Tomkuviene, M., Clouet-d’Orval, B., Cerniauskas, I., Weinhold, E., Klimasauskas, S. Programmable sequence-specific click-labeling of RNA using archaeal box C/D RNP methyltransferases. Nucleic Acids Res. 40, 6765-6773 (2012).
- Nishioka, K., et al. Set9, a novel histone H3 methyltransferase that facilitates transcription by precluding histone tail modifications required for heterochromatin formation. Genes Dev. 16, 479-489 (2002).
- Clark, P. M., et al. Direct in-gel fluorescence detection and cellular imaging of O-GlcNAc-modified proteins. J. Am. Chem. Soc. 130, (2008).
- Lukinavicius, G., Lapinaite, A., Urbanaviciute, G., Gerasimaite, R., Klimasauskas, S. Engineering the DNA cytosine-5 methyltransferase reaction for sequence-specific labeling of DNA. Nucleic Acids Res. 40, 11594-11602 (2012).
- Neely, R. K., Dedecker, P., Hotta, J., Urbanaviciute, G., Klimasauskas, S., Hofkens, J. DNA fluorocode: A single molecule, optical map of DNA with nanometre resolution. Chem. Sci. 1, 453-460 (2010).
- Roberts, R. J., Vincze, T., Posfai, J., Macelis, D. REBASE-a database for DNA restriction and modification: enzymes, genes and genomes. Nucleic Acids Res. 38, 234-236 (2010).
- Petrossian, T. C., Clarke, S. G.
- Kriukiene, E., et al. DNA unmethylome profiling by covalent capture of CpG sites. Nat. Commun. 4, 2190 (2013).
- Wang, R., et al. Profiling genome-wide chromatin methylation with engineered posttranslation apparatus within living cells. J. Am. Chem. Soc. 135, 1048-1056 (2013).
- Zhang, C., Weller, R. L., Thorson, J. S., Rajski, S. R. Natural product diversification using a non-natural cofactor analogue of S-adenosyl-l-methionine. J. Am. Chem. Soc. 128, 2760-2761 (2006).
- Stecher, H., et al. Biocatalytic Fiedel-Crafts alkylation using non-natural cofactors. Angew. Chem. Int. Ed. 48, 9546-9548 (2009).
- Lee, B. W. K., Sun, H. G., Zang, T., Kim, B. J., Alfaro, J. F., Zhou, Z. S. Enzyme-catalyzed transfer of a ketone group from an S-adenosylmethionine analogue: A tool for the functional analysis of methyltransferases. J. Am. Chem. Soc. 132, 3642-3643 (2010).
- Winter, J. M., et al. Expanding the structural diversity of polyketides by exploring the cofactor tolerance of an inline methyltransferase domain. Org. Lett. 15, 3774-3777 (2013).
