Summary
DNA ve proteinler dizi-spesifik afinite ya da DNA ya da protein Methyltransferases sentetik kofaktör analogları kullanılarak flüoresan raportör grup ile etiketlenir. Enzimler, aziridin veya çift aktif kofaktör benzerlerinin kofaktör özelliğine göre bir veya iki adım etiketleme için kullanılmaktadır.
Abstract
S -Adenosyl-L-metionin (AdoMet veya SAM) bağlı metiltransferaz (MTase) DNA, RNA, proteinler ve küçük biyomoleküller belirli konumlara AdoMet aktive metil grubu transferini katalize eder. Bu doğal metilasyon reaksiyonu sentetik kofaktör analoglarını kullanarak alkilasyon reaksiyonları de çok çeşitli genişletilebilir. Bir aziridin halkası ile AdoMet reaktif sülfonyum merkezi değiştirilmesi çeşitli DNA MTases ile DNA ile birleştirilebilir kofaktörler yol açar. Bu aziridin kofaktörler adenin parçasının farklı pozisyonlarda raportör grup ile donatılmıştır ve DNA (Smiling DNA) L Abel ing nduced ethyltransferase- S Sequence özgü M kullanılabilir. Tipik bir örnek olarak, DNA MTase M.BseCI ve aziridin kofaktör 6BAz içinde olan 5'-ATCG T-3 'dizisi bir pBR322 plazmid DNA biyotinilasyon için bir protokol eldebir adım. Bir ctivated G grupların aldığı (Mtag) m ethyltransferase-yönettiği T ransfer için kullanılan AdoMet benzerlerinin başka bir sınıf doymamış alkil grupları sonuçları ile aktive edilmiş bir metil grubunun çıkarılması. Uzun yan zincirler sülfonyum merkezi ve doymamış bağ ile aktive olduğundan, bu kofaktörler çift aktif AdoMet analogları olarak adlandırılır. Bu analoglar aziridin kofaktörlerinin gibi DNA MTases için kofaktör olarak işlev, aynı zamanda RNA, protein ve küçük molekül MTases için değil sadece. Bunlar tipik olarak ikinci bir kimyasal aşama raportör grup ile etiketlenmiş olan eşsiz fonksiyonel gruplarla MTase substratların enzimatik modifikasyonu için kullanılır. Bu histon H3 proteinin floresan etiketlemesi için bir protokol örneklenmiştir. Küçük bir propargil grubu tıklama etiketleme ardından histon H3 lizin 4 (H3K4) MTase Set7 / 9 ile proteine kofaktör analog SeAdoYn aktarılırTAMRA azit ile alkynylated histon H3. Kofaktör analoglarıyla MTase aracılı etiketleme tanımlanması ve fonksiyonel çalışma MTase alt tabakalar hem de DNA genotiplemesi ve metilasyon tespiti de dahil olmak üzere pek çok verici uygulama için elverişli bir teknolojidir.
Introduction
Nükleik asitler ve proteinlerin 1,2 3,4 Özgül etiketleme fonksiyonel karakterizasyonlar, tıbbi teşhis ve (nano) biyoteknoloji için önemli ilgi alanıdır. Burada S -adenosyl-L-metionin (AdoMet veya SAM) bağlı metiltransferaz (MTases) dayanır, bu biyopolimerler için enzimatik bir etiketleme yöntemi sunulmaktadır. Bu enzim sınıfının (EC 2.1.1.), Nükleik asitlerin ve proteinlerin belirli artıkların tek tek nükleofilik pozisyonlar (nitrojen, oksijen, kükürt ve karbon atomu) yönelik olarak ve doğal olarak kofaktör AdoMet (Şekil 1A) 5 aktive metil grubunu aktarır. Buna ek olarak, MTases afinite etiketleri, floroforlar veya diğer etiketler (Şekil 1B) 6 belirli etiketleme için sentetik kofaktör analoglarını kullanabilir. AdoMet analoglarının iki sınıfı geliştirilmiştir: S Sequence özgü M ethyltransferase- I Aziridin kofaktörleri L abel ing (gülümseyerek) 7 ve A ctivated G grupların aldığı m ethyltransferase-yönettiği T ransfer çift aktive AdoMet analogları (Mtag) 8.
Şekil 1.:. Metiltransferaz (MTases), DNA, RNA, proteinler ve küçük biyomoleküller dahil olmak üzere çeşitli yüzeyler için doğal kofaktör AdoMet (SAM) A. Metil grup transfer nükleik asitlerin ve proteinlerin B. Etiketleme / işlevselleştirme (NNNNN = katalize reaksiyonlar proteinler için RNA, ve amino asitler için temel DNA çiftleri, nükleotitler sentetik kofaktör analogları ile yeşil hedef tortu) ile MTase xxxxx = tanıma sekansı. Bir raportör grubu içeren Aziridin kofaktör (mavi küre)özellikle de hedef tortu (sol) ve iki aktif AdoMet analogları ile birlikte dizi adenin halkası olan bağlı bir ikinci aşamada bioorthogonal Click reaksiyonu ile etiketlenebilir, bir kimyasal raportör Y (sağ) taşıyan uzatılmış alkil zincirlerinin aktarmak yol açar. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Aziridin kofaktör DNA MTases en iyi çalışır. Bir azot atomu 9 (veya bunun bir N 10,11 -mustard) yerine, sülfonyum merkezi olarak bir reaktif grup ile üç unsurlu bir halka ihtiva etmektedir. Bu nitrojen atomu protonlanma DNA ile bütün kofaktör bağlanması kovalent neden hedef nükleotid nükleofilik saldırı aziridin halkası aktive eder. Adenin halkasına raportör grupları takılarak aziridin kofaktörler (bir aşamada DNA etiket DNA MTases ile kombinasyon halinde de kullanılabilir
Şekil 2:. M.BseCI ve 6BAz ile DNA sekansa özel tek-aşamalı biyotinilasyon DNA MTase M.BseCI çift bükümlü DNA dizisi 5'-ATCG T-3 'tanır ve doğal olarak, ikinci adenin amino grubunun metile Kalıntı (yeşil) AdoMet kullanarak. Aziridin kofaktör 6BAz ile reaksiyona ders değiştirilir ve M.BseCI hedef adenin ile biyotin (mavi) dahil olmak üzere tüm kofaktör birleştirilmesi ile spesifik DNA biyotinilasyonunu sırası yol açar. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Çift aktif AdoMet analogları doymamış yan zincirleri yerine sülfonyum merkezinde bir metil grubunu (Şekil 1B genişletilmiş içeren 20. sülfonyum merkezine β-konumunda doymamış çift veya üçlü bağ elektronik konjugatif istikrar ile geçiş devlet içinde olumsuz etkileri sterik dengeler. Sülfonyum merkezi ve doymamış bağ hem de enzimatik transferi için yan zinciri etkinleştirmek için, bu kofaktör çift aktive AdoMet analogları adlandırılmıştır. Tipik haliyle, bir ikinci aşamada 8,21 olarak kemo-seçici etiketleme, amino, alkin ve asit grupları gibi benzersiz kimyasal grupların (kimyasal muhabir) ile yan zincirleri aktarmak için kullanılır. RNA ve protein ek etiketleme sağlayan 28 - Genel olarak, iki aktif AdoMet analogları RNA MTases 22,23 DNA MTases 8,20,21 için değil, aynı zamanda yardımcı faktörler ve protein MTases 24 gibi yalnızca işlev görebilir. Ancak, genişletilmiş yan zincirler sterik daha bir metil grubu daha zorlu ve mühendislik sık sık bir protein MTase aktif siteleri büyütme vardırtr verimli aktarım hızları elde etmek için gerekli. Bakır kimyasal değişiklikler aşağıdaki için enzimatik transferi sırasında geçiş devletin 1. Sabitleme ve 2. reaktif kolu: Bu sorunun başka bir çözüm, küçük bir propargil terminali alkin iki fonksiyonu vardır grup (üç karbon) ile bir AdoMet analog kullanmak için katalize azid-alkin sikloadisyonu (CuAAC) kimyasını tıklayın. Bu Oluşan proparjilik AdoMet analog 29 nötr veya hafif bazik koşullar altında ve sadece sınırlı kullanımı oldukça kararsız olduğu ortaya çıktı. Bu dezavantajı selenyum ile kükürt atomu yerine sabit olabilir. Elde edilen kofaktör 5 '- [(Se) [(3 S) -3-amino-3-karboksipropil] prop-2-ynylselenonio] -5'-deoksiadenozin (SeAdoYn, Şekil 3) ile, vahşi tip DNA tarafından kabul edilir, RNA, ve protein MTases 30 - birçok durumda protein mühendisliği ihtiyacını ortadan kaldırmaz 32. Bu floresan pro ile tarif edilmektedir histon H3 lizin ile tein etiketleme 4 (H3K4) MTase Set7 / 9 33 (: çift aktif kofaktör aracılığıyla İki aşamalı protein etiketleme Şekil 3, protokol bölümüne 3).
Şekil 3:. Set7 / 9 histon H3 diziye özel iki-aşamalı floresan etiketleme, SeAdoYn ve TAMRA azid proteini MTase Set7 / 9 doğal AdoMet ile histon H3 lizin 4 amino grubunun (H3K4, yeşil) bileşi. Çift aktif kofaktör ile SeAdoYn MTase lisin kalıntıya küçük bir propargil grubu (kırmızı) aktarır. bağlı uç üçlü bağ daha sonra seçici azid türevlendirilmemiş TAMRA (tetrametilrodamin, mavi) florofor ile bioorthogonal click reaksiyonunun (bakır ile katalize edilen azit-alkin siklo, CuAAC) değiştirilir.yük / 52.014 / 52014fig3highres.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Genel Talimatlar
- Mağaza aziridin kofaktör (DMSO içinde) 6BAz ve protein MTase -80 ° C'de Set7 / 9 ve çift aktif kofaktör SeAdoYn ve DNA MTase M.BseCI -20 ° C'de (% 50 gliserol) da dahil olmak üzere diğer tüm reaktif maddeler.
- Iyonu giderilmiş su içinde söndürme katsayısına ε 269nm (6BAz) = 16,000 cm -1 M 1 ve 260 nm ε (SeAdoYn) = 15.400 cm -1 M-1 kullanılarak UV / Vis spektroskopisi yoluyla 6BAz ve SeAdoYn konsantrasyonunu belirlemek. Tükenme katsayısı varsa 280 nm'de absorpsiyon yoluyla doğrudan, Bradford tahlili ile MTases konsantrasyonunu belirlemek veya.
- Enzim aktivitesinin kaybını önlemek için yoğun pipetle veya vorteks kabarcıkları oluşturarak önlemek için deneyin. Bunun yerine, yavaşça yukarı ve aşağı pipetleme karıştırın.
- DMSO içindeki stok solüsyonlarından aziridin kofaktörleri eklerken deneyde nihai DMSO konsantrasyonu daha az olduğundan emin olmak% 5 daha. Her DNA ile spesifik olmayan reaksiyonları önlemek için, deney tamponu içerisinde 10 mM magnezyum tuzlarıdır.
- Asidik stok çözümleri çift aktif kofaktörlerine eklerken pH değişiklikleri önlemek ve tahlil çözeltinin pH değeri önemli bir değişiklik olmadığından emin olmak için küçük hacimli (yüksek konsantre stok çözümleri) kullanın. , Gerekli bakır iyonu kompleks ile click reaksiyonunun etkilediği için bu deney tamponu içinde tioller, örneğin β-merkaptoetanol veya ditiyotreitol (DTT), kaçının.
Aziridin kofaktörlerinin yoluyla DNA'nın 2. Bir adım Etiketleme
- Sekans spesifik Metiltransferaz Bağlı Etiket ing M.BseCI DNA MTase ve aziridin kofaktör 6BAz ile plazmid DNA (gülümser).
- 20 ° C'de kofaktör çözeltisi çözülme ve buz üzerinde tepkime karışımları hazırlamak.
- Denemesine ek olarak herhangi bir spesifik olmayan modifikasyonlar ve An ve # görselleştirmek için bir "Kofaktör" kontrolünü gerçekleştirmek8220; Enzim "kontrol, MTase hazırlık, doğal kofaktör AdoMet serbest olduğundan emin olmak için.
- 10x değişiklik tamponu deney karışımı 2 ul için (100 mM Tris-HCl, içeren 100 mM MgCl2, 20 mM β-merkaptoetanol, pH 7.4) içinde, pBR322 (0.5 ug / ul), 10 eq 2 ul. DNA tanıma sekansı (pBR322 1 tanıma sekansı) ve 20 ul toplam hacim içinde 60 uM nihai konsantrasyona kadar aziridin kofaktör 6BAz başına M.BseCI. Kofaktör ve DNA MTase son ekleyin.
NOT: β-merkaptoetanol, toksik korozif ve çevreye zarar vermektedir. - "Kofaktör" kontrol için yerine 6BAz deiyonize su ekleyin yerine M.BseCI ve "enzim" kontrolü için deiyonize su ekleyin.
- Yavaşça yukarı ve aşağı pipetleme çözüm karıştırın.
- 1 saat boyunca 55 ° C'de inkübe edin.
- Santrifüj kısaca tüplerinin altındaki tüm sıvıyı toplamak için.
- Kısıtlama-modifikasyon tahlil DNA modifikasyonu doğrulamak için.
- 80 ul deiyonize su ve 3.3 ul (100 mM Tris-HCl, 50 mM MgCl2, 1 M NaCl, 1 mg / ml sığır serumu albümini, pH 8.0 ihtiva eder) 10 ul 10x R.TaqI tampon karıştırılmasıyla bir çözelti hazırlayın kısıtlama endonükleaz Thermus aquaticus (artma) (R.TaqI, 10 U / ul). Son adımda artma eklemek için emin olun.
- 2.1.7 Her tüpe R Taql tampon 10x 2 ul ve yukarıdaki (2.2.1) çözelti 28 ul ekle.
- Yavaşça yukarı ve aşağı pipetleme çözüm karıştırın.
- 30 dakika boyunca 65 ° C'de inkübe edin.
- Santrifüj kısaca tüplerinin altındaki tüm sıvıyı toplamak için.
- Streptavidin ile Elektromobilite kayma deneyi (EMSA) fonksiyonel değişiklik doğrulamak için.
- Her bir tüp (2.2.5) 25 ul çıkarın ve streptavidin m göre bir streptavidin çözeltisi (1 mM, 2.4 ulonomer 100 mM Na 2 HPO 4 içeren streptavidin tamponu, 100 mM NaCI, pH 7.5; Toplam biyotin 4 eşdeğer). Kalan tüpler streptavidin tamponu 2.4 ul ekleyin.
- 1 saat boyunca 37 ° C'de tüm tüpler inkübe edin.
- Agaroz jel elektroforez ile analizi.
- Her tüpe 6x yükleme tamponu (% 0.25 bromofenol mavisi,% 30 gliserol) içinde 5 ul ekle.
- Yavaşça çözüm karıştırın.
- Yük (bir 10,000X stok çözeltisinden 1x GelRed içeren 0.5x TBE tamponu içinde% 1 agaroz), bir agaroz jeli, kuyu içine her bir numune için 10 ul.
- Yaklaşık 80 V ile 0.5x TBE tamponu jel çalıştırın. 1 saat.
- Bir filtre (540 ± 50 nm) ile donatılmış bir CCD kamera ile UV tablosu (312 nm) DNA bantları gözünüzde canlandırın.
NOT: UV ışık Gözleri ve cildi zarar vermektedir.
Çift Aktif kofaktörlerinin aracılığıyla 3. İki aşamalı Protein Etiketleme
- Methyltransfhiston H3 lizin 4 etiketleme (modifikasyon adım) için Set7 / 9 ve çift-aktif kofaktör SeAdoYn ile Aktif Gruplar (Mtag) Devri silmek-yöneltti.
- Bileşenleri çözülme ve buz üzerinde reaksiyon karışımları hazırlayın. NOT: Her zaman SeAdoYn bozulmasını önlemek için soğutulmuş tutun.
- Denemesine ek olarak herhangi bir spesifik olmayan değişiklikler görselleştirmek için bir "Kofaktör" kontrol gerçekleştirmek ve bir "enzim" kontrol, flüoresan probun spesifik olmayan reaksiyonlar ortaya çıkarmaktır.
- Bir deney çözeltisi (20 ul) modifikasyon tamponu (50 mM Tris-HCl,% 5 gliserol, pH 8.5), 10 uM histon H3, uM Set7 / 9 10 ve 600 uM SeAdoYn (selenyum hem de epimerler karışımı) ihtiva eden hazırlayın. Son adımda daha sonra maddeyi ve MTase ekleyin.
- "Kofaktör" kontrol için 3.1.3 gibi bir tahlil çözelti hazırlamak ve sentetik kofaktör ile rekabet etmek 60 mM AdoMet ekleyin. "Enzim" kontrol için yerine SeAdoYn deiyonize su ekleyin.
- Yavaşça yukarı ve aşağı pipetleme çözüm karıştırın. PH şerit (- 10 pH aralığı 5) üst alanında her solüsyonun 1 ul ekleyerek pH değerini kontrol edin.
- 2 saat süre ile 37 ° C'de inkübe edilir.
- Bu arada, bir% 12 SDS-poliakrilamid jel hazırlamak (çalışma jelde: 357 mM Bis-Tris pH 6,5-6,8,% 0.1 (a / h) APS ağırlık,% 0.04 (h / h) TEMED ve% 12 akrilamid / bisakrilamid 37.5: 1 ; yükleme jel: 357 mM Bis-Tris 6,5-6,8 pH,% 0.1 APS (w / v),% 0.04 (h / h) TEMED,% 5 akrilamid / bisakrilamid 37.5: 1).
NOT: Akrilamid / bisakrilamid tehlikeli toksik ve sağlıktır. Bu işlem sırasında eldiven giyin.
- Bakır-katalize azid-alkin sikloadisyonu (CuAAC) (etiketleme adım) üzerinden histon H3 alkinylated lizin 4 Kimyasal etiketleme.
- Sadece modifikasyonu tepkime sonuna kadar 3 mM CuSO 4, 3 mM tris (3-hidroksipropil-triazolilmetil) amin (THPTA), 250 mM sodyum askorbat ve 6 mM TAMRA azit içeren 5x tıklama karışımı hazırlamak20 ul toplam hacim.
- CuAAC başlatmak ve değiştirme reaksiyonu durdurmak için her bir tüpe, taze hazırlanmış 5x tıklama karışımı 5 ul ekle.
- Yukarı ve aşağı pipetleme hafifçe karıştırın.
- Floroforun fotoğraf beyazlatma önlemek için ışık alüminyum folyo ile tüm tüpleri koruyun.
- 1 saat boyunca 20 ° C'de inkübe edilir.
- Protein yağış ücretsiz TAMRA floroforun fazlalığını ortadan kaldırmak için.
- 34 - bedava TAMRA floroforun yoğun olarak-jel floresan floresan etiketli histon H3 outshining önlemek için, proteinler (3.3.4 3.3.2) yağış fazlalığı floroforu çıkarın.
- 75 ul metanol, 18.8 ul kloroform ve kısa bir süre için her eklemeden sonra her tüp ve vorteks deiyonize su 50 ul ekle. 5 dakika boyunca 16,000 x g'de santrifüjleyin. Protein içeren arayüz katmanı, bozmadan üst faz çıkarın.
- Kalan faz 56.3 ul Metanol In 5 dakika boyunca 16.000 xg'de her tüp, girdap ve santrifüj protein pelet. Süpernatantı. Pelet yıkamak için bu adımı tekrarlayın.
- Tüy bırakmayan bir doku ile açık tüpler Kapak ve 15 saat kurumaya bırakın - 30 dakika.
- SDS PAGE yoluyla analizi.
- (20 ul SDS yükleme tamponu (50 mM Tris-HCI,% 2.5 (ağ / hac) SDS,% 10 (h / h) gliserol, 320 mM β-merkaptoetanol ve% 0.05 3.3.4 çökeltilir proteinleri çözülür w / V) bromfenol mavisi, pH 6.8). Tamamen bir pipet ile tüplerin duvarları durulama pelet çözmek için emin olun.
- 10 dakika boyunca 95 ° C'de inkübe edin ve bunları 20 ° C'ye kadar soğumaya bırakın.
- Santrifüj kısaca tüplerinin altındaki tüm sıvıyı toplamak için.
- Bir SDS poliakrilamid jeli (3.1.7) oyuklarına Her numunenin bütün miktarı yerleştirin. 50 mM MOPS, 50 mM Tris-X (Tris-bazlı), 5 mM EDTA,% 0.1 kullanarak (a / h) elektroforez için tampon olarak SDS aktarıldı.
- Yaklaşık 120 V ile jel çalıştırın. 90 dakika.
- Bir filtre (50 nm ± nm 540) ile donatılmış bir CCD kamera ile UV tablosu (312 nm) üzerinde-jel floresan gözünüzde canlandırın.
NOT: UV ışık Gözleri ve cildi zarar vermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Aziridin kofaktörlerinin yoluyla DNA'nın Bir adım Etiketleme
Bu örnek, reaksiyon, çift kollu bir 5'-ATCG T-3 'dizisi içindeki ikinci adenin kalıntısı değiştirir ve pBR322 plazmidi (Şekil 4A) ilgili bir tanıma sitesi vardır DNA MTase M.BseCI ile gerçekleştirilir. Plazmid etiketleme test etmek için, pBR322 kısıtlama endonükleaz (artma) R.TaqI (5'-TCGA-3 ') ile tehdit edildi. R.TaqI M.BseCI sitede yer alan bunlardan biri pBR322 yedi yerlere sahiptir. Etiketleme oluşursa, M.BseCI sitesi bölünme karşı korunacak ve diğer iki fragmanlar (315 ve 368 bp) kaybolur ise 683 baz çifti (bp) ile yeni bir fragmanı oluşturacak. Tabii ki, ilgili tanıma sekansları ile başka DNA MTases farklı REases DNA etiketleme analiz sırasında kullanılması gerekmektedir.
Şekil 4B agaroz jel açıkça görünür gösterir683 bp (şerit 3) yeni bir fragmanının ance. Bu M.BseCI site etiketleme meydana göstermektedir. Sadece deney (yol 3) kısmını göstermektedir. "Kofaktör" kontrol (satır 5) ve aynı zamanda "enzim" kontrol (şerit 7), bu grubu eksiktir. Doğal kofaktör AdoMet enzim preparatı içinde mevcut olmadığını göstermektedir çünkü, özellikle "enzim" kontrol önemlidir. Labelling reaksiyonu Özelliği (4C Şekil 4B ve detay) streptavidin ilave edilmesi üzerine elektro-hareketlilik değişim deneyi (EMSA) ile gösterilmiştir. M.BseCI sitede olmadan diğer tüm parçalarının hareketlilik kontrolleri (şerit 6 ve 8 ile şeritli 4 karşılaştırmak) için değişmeden karşılaştırıldığında ise 683 bp Elektromobilite geriliği olduğunu.
Şekil 4: DiziM.BseCI ve 6BAz ile pBR322 plazmid DNA 'nın spesifik biyotinilasyon. Tanıma M.BseCI (kırmızı) ve R.TaqI (yeşil) için siteler olarak DNA R.TaqI. B Analizi ile sınırlama sonra baz çifti (bp) 'de beklenen DNA parçalarının uzunluğunu gösteren pBR322 A. plazmid haritası agaroz jel elektroforezi ile parçalanma ve EMSA. M = İşaretleyici, kulvarlar 1 ve 2: Plazmid DNA, yalnız, kuşak 3 ve 4: Deney, kuşak 5 ve 6 'kofaktör kontrolü, sütun 7 ve 8' enzim kontrol eden. Geçitler 2, 4, 6 ve 8 ek streptavidin içerir. B'den ilave C. Genişleyen bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.
Çift Aktif kofaktörlerinin yoluyla Proteinlerin İki aşamalı Etiketleme
Çift aktive AdoMet analogları ile yüzeylerde MTase iki aşamalı etiketleme için bir örnek olarak histon seçtikH3 lizin 4 (H3K4) MTase Set7 / 9 ve küçük SeAdoYn kofaktör. Histon H3 alt-tabaka (birinci aşama) için aktive propargil grubunun enzimatik transferi sonra, terminal alkin, kimyasal CuAAC tıklama kimyasalları (ikinci aşama) ile bir azid ile modifiye edilmiş TAMRA florofor ile etiketlenmiştir (Şekil 3 ile karşılaştırınız). Labelling reaksiyonu analizi, SDS-PAGE ile yapılır ve jel floresans saptama (Şekil 5A) edilir. Deney (kulvar 1), histon kofaktör yan zinciri başarılı bir şekilde transfer edildiğini gösteren H3 ve TAMRA florofor ile işaretlenmiş bulunan değiştirilmiş proteine tekabül eden bir floresan bant görülebilir. Resim grupları MTase aracılık eder "kofaktör" ve histon H3 bu etiketleme gösteren "enzim" kontrol (kulvarlar 2 ve 3) 'de görebilir. Bu nedenle, non-spesifik kimyasal etiketleme ya tek başına kofaktör (ilk adım) veya CuAAC (ikinci aşama) sırasında ekarte edilebilir. "Kofaktör" kontrol d yapılırifferently tek aşamalı bir DNA etiketlemesi için protokol daha fazladır. Histon H3 çökelmesi Set7 / 9 varlığı ve MTase yükleme kontrolü histon H3 azaltılmış miktarlarının yol açabilir protein atlama daha verimli olmasıdır. Böylece, SeAdoYn ile rekabet doğal kofaktör AdoMet yüksek bir konsantrasyon ilave edildi. Histon H3 yüklenmesi kolayca floresans algılama sonra Coomassie Mavisi ile lekelenmesinden ile kontrol edilebilir.
MTase alt-tabakalar, aynı zamanda ikinci bir kimyasal aşama 30'da azid türevlendirilmemiş biyotin kullanılarak biyotin yerine florofor ile etiketlenebilir. Proteinlerin Biyotinilasyon uygun bir yaban turbu peroksidaz-konjuge avidin ile Western blot ile analiz edilir. Bu Set7 / 9 SeAdoYn ve azid ile modifiye edilmiş biotin ile histon H3 biyotinilasyon için Şekil 5B 'de gösterilmiştir. şeritte 1 tahlil etiketli histon H3 için açık bir bant gösterir. "enzim" bantlar olmaması (şerit 2)ve "Kofaktör" kontrol (yol 3) olup, etiketleme MTase için spesifik olan yeniden ortaya koymaktadır. Western blot analizi, protein çöktürmesi ile aşırı biyotin kaldırılmasını gerektirmez, çünkü "Kofaktör" kontrol sadece protein MTase yokluğunda gerçekleştirilir.
Şekil 5: azid-türetilmiş etiketlerle tıklama reaksiyonlar takip protein MTase Set7 / 9 ve SeAdoYn ile histon H3 Etiketleme. Biyotinile histon H3 ve Avidin-yaban turpu peroksidaz (HRP) konjuge kullanarak kontrol yükleme kontrolü için Coomassie Mavisi ile histon H3 ve kontroller olarak boyama TAMRA etiketli. B. Western blot analizi A. In-jel ışık vermiştir. Deneysel Koşullar a (enzimatik modifikasyonu floresan etiketlemesi için çok benzer olmuştur: 6.581 M histon H3 Set7 / 9 10 uM, 50 mM, 600 uM SeAdoYn, Tris-HCI, 5 mM MgCl2,% 5 gliserol, pH 9.0, 30 ° C, 3 saat; Kimyasal etiketleme:. 0.6 mM CuSO 4, 0.6 mM THPTA, 50 mM sodyum askorbat, 1.2 mM biyotin-azid, 37 ° C, 1 saat) , bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
DNA MTases ve aziridin cofactors (gülümseyen DNA) ile DNA Bir adım etiketleme sağlam bir yöntemdir, ancak deney planlarken bazı yönleri dikkate alınmalıdır.
Aziridin kofaktör: M.BseCI DNA etiketleme için 6BAz konsantrasyonu 60 uM idi. Diğer DNA MTases kullanırken kofaktör konsantrasyonu düşük 20 gibi uM DNA MTase M.TaqI 19 kullanılmıştır, örneğin konsantrasyonları optimize edilmelidir. Düşük 6BAz konsantrasyonları streptavidin (tahlilde biyotin tüm miktarı ile ilgili bağlanma yerleri) 'in bir dört kat fazla doğrudan EMSA ile analiz karışmadan artma ile inkübasyondan sonra ilave edilebilir avantajına sahiptir. Aksi takdirde, biyotinile edilmiş bir DNA fazla kofaktör kaldırmak ve agaroz jel elektroforez sırasında DNA bulaşmasını önlemek için arındırılmalıdır. DMSO içindeki stok solüsyonlarından aziridin kofaktörleri eklerken emin olun th son DMSO konsantrasyonuE deney, 5% 'den daha azdır. Çok fazla DMSO enzimleri inaktive olabilir. Her bozulmasını önlemek için -80 ° C'de aziridin kofaktörleri saklayın.
DNA, MTase: DNA ile aziridin kofaktörler enzimatik bağlanma güçlü ürün önleyicileri ve DNA MTases stoikiometrik miktarlarda kullanılması gereken yol açabilir. Bu nedenle her zaman DNA MTase fazla 1 eşdeğer kullanın. En çok DNA MTases ekstensif diyaliz ya da tampon büyük hacimli bir sütun üzerinde enzimler yıkanarak çıkarılması gereken bağlı AdoMet ile copurify. "Enzim" kontrol AdoMet hala enzim hazırlık mevcut olup olmadığını söyleyecektir. M.BseCI ile etiketlenmesi de 37 ° C 'de bir gece boyunca inkübe etmek suretiyle yapılabilir.
Modifikasyon tamponu: DNA ile aziridin kofaktörler spesifik olmayan reaksiyonları önlemek için tampon maddesi içinde 10 mM magnezyum iyonları içerir. Magnezyum iyonları, kirletici nükleazlara aktivasyonuna yol ise, baryum iyonları yerine eklenebilir.
DNA dizisi, belirli bir işaretleme için sadece DNA Smiling de Mtag kullanılabilecektir. Burada çift Etkinleştirilmiş eşfaktörler DNA'ya özgü fonksiyonel grup ile yan zincirlerin enzimsel transferi için kullanılır. Bu işlevsel gruplar, örneğin, primer aminler, ikinci bir aşamada 8,35,36 NHS esteri kimyası ile biyotin ya da florofor da dahil olmak üzere raportör grup, bir çok çeşitli modifiye edilebilir. Alternatif biz zaten raportör grubu içeren büyük yan zincirleri ile çift aktive AdoMet analogları sentez başladı ve tek adımda DNA etiketleme için onları kullandık.
iki aktif kofaktör SeAdoYn proteinlerin iki aşamalı Mtag etiketleme prosedürü başarılı bir şekilde, protein MTases 30,31 bir dizi kullanılmıştır. Ancak, aşağıdaki yorum deney gerçekleştirmeden önce düşünülmelidir.
Çift aktif kofaktör: Bu eşfaktörler, deniz dahildoYn, asidik koşullar ve bakımı altında depolanır değişiklik çözeltinin pH'ı, belirgin bir kofaktör eklenmesi üzerine değişmediği dikkat edilmelidir. Her zaman pH değeri çok düşükse, pH değerini ayarlamak için, sodyum hidroksit çözeltisi (50 mM) küçük miktarlarda ilave, bir pH şerit değiştirme çözeltisi 1 ul ekleyerek pH'ı kontrol edin ve. Buna ek olarak kofaktör analoglan pH değişikliklerini önlemek için düşük bir hacim içinde ilave edilmelidir. Böylece, tam modifikasyon için gerekli minimum kofaktör konsantrasyonları diğer MTases için belirlenmeli ve yüksek konsantre kofaktör stok çözeltileri tercih edilir. Kofaktör konsantrasyonları tipik olarak 10 uM ve 600 uM arasında çeşitlidir. aktif epimeri genellikle elde etmek zordur gelen, AdoMet S epimer tekabül eden, kükürt ya da selenyum ve biyolojik olarak aktif epimer ayrılması epimerlerin: 1 karışımı çift aktif kofaktörler kimyasal sentezi, tipik olarak yaklaşık 1 elde edilir. Bu nedenle, kofaktör konsantrasyonlardırtipik olarak izomerlerin bir karışımı ile verilen. Çift aktif kofaktör analoglan oda sıcaklığında oldukça kararsızdır ve -20 ° C'de saklanmalıdır. Ayrıca buz üzerinde stok çözümleri çözülme ve pipetleme sırasında soğuk tutmak için emin olun. Onlar tekrar dondurulabilir ama biz bölüntülerin yapmanızı öneririz tekrarlanabilir aktivite sağlamak için.
Protein MTase: MTases katalitik miktarlarda kullanılabilir çift aktif yardımcı faktörler ile dönüşümleri için. Ancak, MTases doğal kofaktör AdoMet dak -1 aralığında ciro numaralarına sahip yavaş enzimler genellikle. Pratik nedenlerden ötürü çoğu zaman (tipik olarak 10 dakika, 2 saat ve 20 ° C'de 37 ° C) kuluçka süresi ve sıcaklığı stoikiometrik miktarlarda MTases kullanmak en aza indirir. "Kofaktör" kontrol raportör grubu ve algılama türüne bağlı olarak değişir. MTase etiketleme biyotin atlanmaktadır ve analiz Batı lekeleme (Şekil 5B ile yapılabilir için (Şekil 5A) enzimatik transferini engellemek için eklenir doğal kofaktör yüksek bir konsantrasyonda uygulanır. Histon H3 yağış protein kaybına yol açar Ancak, SDS-PAGE uzatılabilir ve ücretsiz TAMRA floroforun aşırı bromfenol mavi ön jel tükeneceğini.
Modifikasyon tamponu: optimum enzim tamponu kullanılabilir, ancak tiyoller, ditiyotreitol (DTT) ve β-merkaptoetanol gibi kaçınılmalıdır. Onlar, bakır iyonları ve b bağlamak Aşağıdaki CuAAC tıklayın reaksiyonu kilitleyin.
CuAAC click reaksiyonu: TAMRA azid nihai konsantrasyon alkin konsantrasyon olarak iki kat daha büyük olmalıdır. Biyolojik özleri kullanıldığında bakır ve ligand konsantrasyonu 5 mM her biri kadar arttırılmalıdır. TAMRA azid suya göre DMSO içinde daha çözünürdür. Nihai DMSO konsantrasyonu,% 12'den daha az olduğundan emin olun. Genişletilmiş inkübasyon süreleri, SDS poliakrilamid jeli üzerinde protein hasarı ve mürekkep bulaşması neden olabilir. Böylece etiketleme reaksiyonu ya da protein, çöktürme veya tioller eklenerek durdurulması gerekir.
Bu, iki aşamalı bir etiketleme prosedürü biotin protein MTase substratlar etiketlemek için kullanılabilir ya da streptavidin kaplı manyetik boncuklar ile, Western blot algılama (Şekil 5B) ve yalıtımı için kullanılabilecektir. Buna ek olarak, iki aktif AdoMet analoglan tekabül eden MTases ile DNA, RNA ve küçük doğal ürünleri etiketlemek için kullanılabilir.
nükleik asitlerin ve proteinlerin çoğu diğer etiketleme yöntemleri ile karşılaştırıldığında ve_content "> MTase aracılı etiketleme doğal alt-tabakalar doğrudan kullanılabilir avantajına sahiptir ve daha fazla bir değişiklik. Tabii ki, bakım, doğal alt-tabakalar engellenmediğini alınmalıdır gereklidir in vivo olarak uygun bir MTase ile metilasyonu ile. Buna ek olarak, MTase aracılı etiketleme MTases biyotin, florofor ya da diğer moleküler etiketler, aynı zamanda hedefleri içerir raportör grupları, açısından hem de çok esnektir. Rebase, sınırlama için bir veri tabanı endonükleazlar, DNA MTases, iki ila sekiz bp 37 kadar farklı tanıma sekansları yüzlerce 700'den deneysel özelliği, DNA MTases listeler ve her türlü 200'den fazla farklı MTases insan hücresinde 38 üretildiği tahmin edilmektedir. önemli bir belirleyicisi MTase aktivitesi için AdoMet analog enzim aktif site sığar olup olmadığıdır. kofaktör sunulan 6 rağmenBAZ ve SeAdoYn bazı MTases kolayca onları kabul etmeyebilir, küçük reaktif grupları için tasarlanmıştır. Sterik daha talepkar çift aktif AdoMet analogları ile 28 - 35 DNA, RNA, 23 ve protein MTases 25 gösterilmiştir Bu durumlarda aktif siteler, protein mühendisliği ile genişletilebilir. AdoMet analogları ile DNA ve RNA dizisi özel etiketleme genotiplemesi (DNA eşlemesi) için önemli ilgi 36 ve metilasyon algılama 39 olduğunu, DNA / RNA ve DNA / RNA-modifiye enzimler 15 de (nano) biyoteknoloji 13 gibi fonksiyonel çalışmalar, 14 ve gen verici 19. Diziye özgü kovalent DNA etiketlemesi için diğer yöntemler, bir hedefleme sistemi veya nick translation etiketleme ve ardından diziye özgü çentikleme endonükleazlar (NEases) sentetik üçlü helis oluşturan oligodeoksinükleotidler, peptit nükleik asitler veya firkete poliamitler dayanmaktadır.
Iki aktif AdoMet analogları ile proteinlerin spesifik etiketleme esas proteomik araştırma, karmaşık biyolojik karışımların 27,28 protein MTases yeni alt tabakaların örneğin kimlik uygulamalar yönelik olarak, ancak diğer uygulamalar, fonksiyonel çalışmalarda olduğu gibi, aynı zamanda uygun olması gerekmektedir. MTase aracılı etiketleme esas olarak, in vitro olarak, saflaştırılmış MTases ile yapılmış olsa da, son zamanlarda, 40 bildirilmiştir olarak, etiketleme de canlı hücrelerde elde edilebilir. Tabii ki, belirli bir proteinin etiketlenmesi için pek çok yöntem 3,4 mevcuttur. Işlenmiş hücreler kullanılarak doğal olmayan amino asitlerin dahil edilmesi yanı sıra, tipik olarak kendi kendini etiketleme etiketleri ile ilgili proteinin genetik füzyon gerektirir / PRenzim aracılığıyla etiketleme oteins veya etiketler. Bu bağlamda, protein MTases için substratlar olarak hizmet eden kısa peptid dizileri, örneğin, N-terminal histon kuyrukları, ilgi konusu bir protein oluşturacak şekilde olabilir ve özellikle de AdoMet analogları ve buna tekabül eden bir protein MTases ile etiketlenmiş.
44 - Nihayet, küçük molekül MTases bir biyokatalitik repertuarı sentetik AdoMet ile 41 analogları genişletilebilir. Bu yeni biyolojik faaliyetler için tarama ilginç uygulamaları bulmak gerekir doğal ürünler, örneğin antibiyotikler veya poliketidlerin, içine yapısal çeşitliliği tanıtmak için yeni bir yaklaşımı temsil ediyor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6BAz | Synthesized according to Weinhold et al., Patent number US 8,129,106, published March 6, 2012. | ||
| β-Mercaptoethanol | Serva | 28625 | |
| Acetic acid | Fisher Scientific | 10304980 | |
| Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 | Serva | 10688 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500100 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Serva | 13375 | |
| Bis-Tris | Gerbu | 1304 | |
| Boric acid | Gerbu | 1115 | |
| Bromophenol blue Na salt | Serva | 15375 | |
| Copper(II) sulfate | Aldrich | C1297 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | 10020090 | |
| Coomassie Brilliant Blue | Serva | 17525 | |
| EDTA disodium salt | Gerbu | 1034 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| GelRed (10,000x in water) | Biotium | 41003 | |
| Glycerol (99.5%) | Gerbu | 2006 | |
| FastRuler Low Range DNA Ladder | Thermo Scientific | SM1103 | |
| Histone H3 | Expression plasmid obtained from Dr. Philipp Voigt and Prof. Danny Reinberg; expression and isolation according to T. J. Richmond et al., J. Mol. Biol. 1997, 272, 301-311. | ||
| M.BseCI | Expression plasmid obtained from Dr. Michael Kokkinidis; expression and isolation according to Kapetaniou et al., Acta Cryst. 2006, F63, 12-14. | ||
| Methanol | Fisher Scientific | 10675112 | |
| Magnesiumchloride hexahydrate | J.T. Baker | 4003 | |
| MOPS | Gerbu | 1081 | |
| Sodium chloride | Gerbu | 1112 | |
| pH strip (Neutralit) | Merck | 1,095,330,001 | |
| pBR322 | Thermo Scientific | SD0041 | |
| R.TaqI (10 u/µl) | Thermo Scientific | ER0671 | |
| SeAdoYn | Synthesized according to Willnow et al., ChemBioChem 2012, 13, 1167-1173. | ||
| Set7/9 | Expression plasmid obtained from Prof. Danny Reinberg, expression and isolation according to D. Reinberg et al., Genes Dev.2002, 16, 479-489. | ||
| Streptavidin | Gerbu | 3058 | |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma Life Science | A7631 | |
| SDS Granular | Gerbu | 1833 | |
| di-Sodium hydrogenphosphate | Merck | 106,586 | |
| TAMRA azide | Synthesized according to reference 30: Willnow et al., ChemBioChem 2012, 13, 1167-1173. | ||
| TaqI buffer (10x) | Thermo Scientific | B28 | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Acros Organics | 42058 | |
| Tris-HCl | Gerbu | 1028 | |
| Tris-X (TRIS-base) | Gerbu | 1018 | |
| Tris(3-hydroxypropyltriazolyl-methyl)amine (THPTA) | Sigma-Aldrich | 762342 |
References
- Gottfried, A., Weinhold, E.
- Zohar, H., Muller, S. J. Labeling DNA for single-molecule experiments: methods of labeling internal specific sequences on double-stranded DNA. Nanoscale. 3, 3027-3039 (2011).
- Hinner, M. J., Johnsson, K. How to obtain labeled proteins and what to do with them. Curr. Opin. Biotechnol. 21, 766-776 (2010).
- Wua, Y. -W., Goody, R. S. Probing protein function by chemical modification. J. Pept. Sci. 16, 514-523 (2010).
- Struck, A. -W., Thompson, M. L., Wong, L. S., Micklefield, J. S-Adenosyl-methionine-dependent methyltransferases: Highly versatile enzymes in biocatalysis, biosynthesis and other biotechnological applications. ChemBioChem. 13, 2642-2655 (2012).
- Klimasauskas, S., Weinhold, E. A new tool for biotechnology: AdoMet-dependent methyltransferases. Trends Biotechnol. 25, 99-104 (2007).
- Pljevaljcic, G., Schmidt, F., Weinhold, E. Sequence-specific Methyltransferase-Induced Labeling of DNA (SMILing DNA). ChemBioChem. 5, 265-269 (2004).
- Lukinavicius, G., Lapiene, V., Stasevskij, Z., Dalhoff, C., Weinhold, E., Klimasauskas, S. Targeted labeling of DNA by methyltransferase-directed Transfer of Activated Groups (mTAG). J. Am. Chem. Soc. 129, 2758-2759 (1021).
- Pignot, M., Siethoff, C., Linscheid, M., Weinhold, E. Coupling of a nucleoside with DNA by a methyltransferase. Angew. Chem. Int. Ed. 37, 2888-2891 (1998).
- Weller, R. L., Rajski, S. R. Design, synthesis, and preliminary biological evaluation of a DNA methyltransferase-directed alkylating agent. ChemBioChem. 7, 243-245 (2006).
- Du, Y., Hendrick, C. E., Frye, K. S., Comstock, L. R. Fluorescent DNA Labeling by N-Mustard Analogues of S-adenosyl-l-methionine. ChemBioChem. 13, 2225-2233 (2012).
- Pljevaljcic, G., Schmidt, F., Scheidig, A. J., Lurz, R., Weinhold, E. Quantitative labeling of long plasmid DNA with nanometer precision. ChemBioChem. 8, 1516-1519 (1002).
- Wilkinson, S., et al. Molecular scale architecture: engineered three- and four-way junctions. Bioconjugate Chem. 19, 470-475 (2008).
- Braun, G., et al. Enzyme-directed positioning of nanoparticles on large DNA templates. Bioconjugate Chem. 19, 476-479 (2008).
- Kim, S., et al. Enzymatically incorporated genomic tags for optical mapping of DNA binding proteins. Chem. Int. Ed. 51, 3578-3581 (2012).
- Rina, M., Bouriotis, V. Cloning purification and characterization of the BseCI DNA methyltransferase from Bacillus stearothermophilus. Gene. 133, 91-94 (1993).
- Sequence-specific detection of methylation in biomolecules. US Patent. Weinhold, E., Meier, T., Düfel, H., Markert-Hahn, C., Schmuck, R. , 8,129,106 (2012).
- Pljevaljcic, G., Pignot, M., Weinhold, E. Design of a new fluorescent cofactor for DNA methyltransferases and sequence-specific labeling of DNA. J. Am. Chem. Soc. 125, 3492-3410 (2003).
- Schmidt, F. H. -G., Hüben, M., Gider, B., Renault, F., Teulade-Fichou, M. -P., Weinhold, E. Sequence-specific Methyltransferase-Induced Labelling (SMILing) of plasmid DNA for studying cell transfection. Bioorg. Med. Chem. 16, 40-48 (2008).
- Dalhoff, C., Lukinavicius, G., Klimasauskas, S., Weinhold, E. Direct transfer of extended groups from synthetic cofactors by DNA methyltransferases. Nat. Chem. Biol. 2, 31-32 (2006).
- Lukinavicius, G., Tomkuviene, M., Masevicius, V., Klimasauskas, S. Enhanced chemical stability of AdoMet analogues for improved methyltransferase-directed labeling of DNA. ACS Chem. Biol. 8, 1134-1139 (2013).
- Motorin, Y., et al. Expanding the chemical scope of RNA:methyltransferases to site-specific alkynylation of RNA for click labeling. Nucleic Acids Res. 39, 1943-1952 (1943).
- Schulz, D., Holstein, J. M., Rentmeister, A. A chemo-enzymatic approach for site-specific modification of the RNA cap. Angew. Chem. Int. Ed. 52, 7874-7878 (2013).
- Peters, W., et al. Enzymatic site-specific functionalization of protein methyltransferase substrates with alkynes for click labeling. Angew. Chem. Int. Ed. 49, 5170-5173 (2010).
- Islam, K., Zheng, W., Yu, H., Deng, H., Luo, M. Expanding cofactor repertoire of protein lysine methyltransferase for substrate labeling. ACS Chem. Biol. 6, 679-684 (2011).
- Wang, R., Zheng, W., Yu, H., Deng, H., Luo, M. Labeling substrates of protein arginine methyltransferase with engineered enzymes and matched S-adenosyl-l-methionine analogues. J. Am. Chem. Soc. 133, 7648-7651 (2011).
- Islam, K., et al. Bioorthogonal profiling of protein methylation using azido derivative of S-adenosyl-l-methionine. J. Am. Chem. Soc. 134, 5909-5915 (2012).
- Islam, K., et al. Defining efficient enzyme-cofactor pairs for bioorthogonal profiling of protein methylation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 16778-16783 (2013).
- Binda, O., Boyce, M., Rush, J. S., Palaniappan, K. K., Bertozzi, C. R., Gozani, O. A chemical method for labeling lysine methyltransferase substrates. ChemBioChem. 12, 330-334 (2011).
- Willnow, S., Martin, M., Lüscher, B., Weinhold, E. A selenium-based click AdoMet analogue for versatile substrate labeling with wild-type protein methyltransferases. ChemBioChem. 13, 1167-1173 (2012).
- Bothwell, I. R., et al. Se-Adenosyl-l-selenomethionine cofactor analogue as a reporter of protein methylation. J. Am. Chem. Soc. 134, 14905-14912 (2012).
- Tomkuviene, M., Clouet-d’Orval, B., Cerniauskas, I., Weinhold, E., Klimasauskas, S. Programmable sequence-specific click-labeling of RNA using archaeal box C/D RNP methyltransferases. Nucleic Acids Res. 40, 6765-6773 (2012).
- Nishioka, K., et al. Set9, a novel histone H3 methyltransferase that facilitates transcription by precluding histone tail modifications required for heterochromatin formation. Genes Dev. 16, 479-489 (2002).
- Clark, P. M., et al. Direct in-gel fluorescence detection and cellular imaging of O-GlcNAc-modified proteins. J. Am. Chem. Soc. 130, (2008).
- Lukinavicius, G., Lapinaite, A., Urbanaviciute, G., Gerasimaite, R., Klimasauskas, S. Engineering the DNA cytosine-5 methyltransferase reaction for sequence-specific labeling of DNA. Nucleic Acids Res. 40, 11594-11602 (2012).
- Neely, R. K., Dedecker, P., Hotta, J., Urbanaviciute, G., Klimasauskas, S., Hofkens, J. DNA fluorocode: A single molecule, optical map of DNA with nanometre resolution. Chem. Sci. 1, 453-460 (2010).
- Roberts, R. J., Vincze, T., Posfai, J., Macelis, D. REBASE-a database for DNA restriction and modification: enzymes, genes and genomes. Nucleic Acids Res. 38, 234-236 (2010).
- Petrossian, T. C., Clarke, S. G.
- Kriukiene, E., et al. DNA unmethylome profiling by covalent capture of CpG sites. Nat. Commun. 4, 2190 (2013).
- Wang, R., et al. Profiling genome-wide chromatin methylation with engineered posttranslation apparatus within living cells. J. Am. Chem. Soc. 135, 1048-1056 (2013).
- Zhang, C., Weller, R. L., Thorson, J. S., Rajski, S. R. Natural product diversification using a non-natural cofactor analogue of S-adenosyl-l-methionine. J. Am. Chem. Soc. 128, 2760-2761 (2006).
- Stecher, H., et al. Biocatalytic Fiedel-Crafts alkylation using non-natural cofactors. Angew. Chem. Int. Ed. 48, 9546-9548 (2009).
- Lee, B. W. K., Sun, H. G., Zang, T., Kim, B. J., Alfaro, J. F., Zhou, Z. S. Enzyme-catalyzed transfer of a ketone group from an S-adenosylmethionine analogue: A tool for the functional analysis of methyltransferases. J. Am. Chem. Soc. 132, 3642-3643 (2010).
- Winter, J. M., et al. Expanding the structural diversity of polyketides by exploring the cofactor tolerance of an inline methyltransferase domain. Org. Lett. 15, 3774-3777 (2013).
