Summary
DNA och proteiner sekvens specifikt märkt med affinitet eller fluorescerande reportergrupper som använder DNA- eller protein metyltransferaser och syntetiska kofaktor analoger. Beroende på kofaktor specificiteten av enzymer, aziridin eller dubbla aktiverade kofaktor analoger används för en eller två steg märkning.
Abstract
S -Adenosyl-l-metionin (AdoMet eller SAM) -beroende metyltransferaser (MTAse) katalyserar överföringen av den aktiverade metylgrupp från AdoMet till särskilda positioner i DNA, RNA, proteiner och små biomolekyler. Denna naturliga metyleringsreaktion kan expanderas till en bred variation av alkyleringsreaktioner som använder syntetiska kofaktor analoger. Ersättning av det reaktiva sulfonium centrum AdoMet med en aziridinring leder till kofaktorer som kan kopplas med DNA genom olika DNA MTases. Dessa aziridin kofaktorer kan utrustas med reportergrupper vid olika positioner av adenin molekyldel och användas för S equence specifik M ethyltransferase- jag nduced L abel ning av DNA (ler-DNA). Som ett typiskt exempel ger vi ett protokoll för biotinylering av pBR322 plasmid-DNA vid 5'-ATCG En T-3 'sekvensen med DNA MTAse M.BseCI och aziridin cofaktor 6BAz iett steg. Förlängning av den aktiverade metylgruppen med omättade alkylgrupper resulterar i en annan klass av AdoMet-analoger, vilka används för m ethyltransferase riktad T verföring av A ctivated G roups (mtag). Eftersom de förlängda sidokedjor aktiveras av sulfonium centrum och den omättade bindningen, dessa kofaktorer kallas dubbel aktiverade AdoMet analoger. Dessa analoger inte bara funktion som kofaktorer för DNA MTases, som aziridinen kofaktorer, utan också för RNA, protein och småmolekylära MTases. De används vanligtvis för enzymatisk modifiering av MTAse substrat med unika funktionella grupper som är märkta med reportergrupper i ett andra kemiskt steg. Detta exemplifieras i ett protokoll för fluorescensmärkning av histon H3 protein. En liten propargylgrupp överförs från kofaktorn analoga SeAdoYn till proteinet av histon H3 lysin 4 (H3K4) MTAse Set7 / 9 följt av klick märkning avalkynylated histon H3 med TAMRA azid. MTAse-medierad märkning med kofaktor analoger är en möjliggörande teknik för många spännande tillämpningar inklusive identifiering och funktionell studie av MTAse substrat samt DNA genotypning och metylering upptäckt.
Introduction
Specifik märkning av nukleinsyror 1,2 och proteiner 3,4 är av stort intresse för funktionella karakteriseringar, medicinsk diagnos och (nano) bioteknik. Här presenterar vi en enzymatisk märkningsmetod för dessa biopolymerer som är baserad på S -adenosyl-l-metionin (AdoMet eller SAM) -beroende metyltransferaser (MTases). Denna klass av enzymer (EG 2.1.1.) Riktar enskilda nukleofila positioner (kväve, syre, svavel och kolatomer) inom specifika rester av nukleinsyror och proteiner och naturligt överför den aktiverade metylgruppen i kofaktorn AdoMet (Figur 1A) 5. Dessutom kan MTases använda syntetiska kofaktor analoger för särskild märkning med affinitetstaggar, fluoroforer eller andra etiketter (Figur 1B) 6. Två klasser av AdoMet analoger har utvecklats: Aziridine kofaktorer för S equence specifika M ethyltransferase- I L abel ing (ler) 7 och dubbla aktiverade AdoMet analoger för m ethyltransferase styrd T verföring av A ctivated G roups (mtag) 8.
Figur 1: Reaktioner som katalyseras av metyltransferaser (MTases) A. Metyl gruppöverföring från den naturliga kofaktorn AdoMet (SAM) till olika substrat inklusive DNA, RNA, proteiner och små biomolekyler B. Märkning / funktionalisering av nukleinsyror och proteiner (NNNNN =.. baspar för DNA, nukleotider för RNA och aminosyror för proteiner; XXXXX = igenkänningssekvensen för MTAse med målresten i grönt) med syntetiska kofaktor analoger. Aziridinen kofaktorer som innehåller en reportergrupp (blå sfär)fäst till adeninringen är sekvens specifikt kopplad med målresten (vänster) och dubbels aktiverad AdoMet analoger leder till överföring av utökade alkylkedjor som bär en kemisk reporter Y (till höger), som kan märkas genom bioorthogonal klick reaktion i ett andra steg. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Aziridin kofaktorer fungerar bäst med DNA MTases. De innehåller en tre-ledad ring med en kväveatom 9 (eller en N -mustard 10,11) i stället för den sulfonium mitten som reaktiv grupp. Protonering av denna kväveatom aktiverar aziridinringen för nukleofil attack av målnukleotidsekvensen som leder till kovalent koppling av hela kofaktorn med DNA. Genom att fästa reportergrupper till adeninringen aziridinen kofaktorer kan användas i kombination med DNA MTases att märka DNA i ett steg (
Figur 2:. Sekvens specifik ett-steg biotinylering av DNA med M.BseCI och 6BAz DNA MTAse M.BseCI erkänner den dubbelsträngade DNA-sekvensen 5'-ATCG En T-3 'och naturligt metylerar aminogruppen hos den andra adenin rester (grön) med hjälp av AdoMet. Med aziridin kofaktor 6BAz loppet av reaktionen förändras och M.BseCI leder till sekvensspecifik DNA biotinylation genom att koppla hela kofaktor inklusive biotin (blå) med målet adenin. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Dubbla aktiverade AdoMet analoger innehåller förlängt omättade sidokedjor i stället för en metylgrupp vid sulfonium centret (Figur 1B 20. Den omättade dubbel- eller trippelbindning i β-position till sulfoniumsalt centret kompenserar elektroniskt ogynnsamma steriska effekter inom övergångstillståndet genom konjugativ stabilisering. Eftersom både sulfonium centrum och den omättade bindningen aktiverar sidokedjan för enzymatisk överföring, var dessa kofaktorer som heter dubbel aktiverade AdoMet analoger. Vanligtvis används de för att överföra sidokedjor med unika kemiska grupper (kemiska reportrar), som amino, alkyn- och azid grupper, för kemo-selektiv märkning i ett andra steg 8,21. I allmänhet, dubbel aktiverade AdoMet analoger kan inte bara fungera som kofaktorer för DNA MTases 8,20,21 utan också för RNA MTases 22,23 och protein MTases 24-28 möjliggör ytterligare märkning av RNA och proteiner. Men de förlängda sidokedjor är steriskt mer krävande än en metylgrupp och utvidga de MTAse aktiva webbplatser genom proteinteknik är oftsv krävs för att få effektiva överföringshastigheter. En annan lösning på detta problem är att använda en AdoMet analog med en liten propargylgrupp (tre kolatomer) där den terminala alkynen tjänar två funktioner: 1. Stabilisering av övergångstillståndet under enzymatisk överföring och 2. reaktivt handtag för följande kemiska modifikationer av koppar- katalyserad azid-alkyn cykloaddition (CuAAC) klicka kemi. Det visade sig att den resulte propargylic AdoMet analog 29 är ganska instabil under neutrala eller svagt basiska förhållanden och endast begränsad användning. Denna nackdel kan åtgärdas genom att ersätta svavelatomen med selen. Den resulte cofaktor 5 '- [(Se) [(3S) -3-amino-3-karboxipropyl] prop-2-ynylselenonio] -5'-deoxiadenosin (SeAdoYn, fig 3) accepteras av vildtyp-DNA, RNA och protein MTases 30-32 vilka upphäva behovet av proteinkonstruktion i många fall. Detta exemplifieras genom fluorescens pro protein märkning med histon H3 lysin 4 (H3K4) MTAse Set7 / 9 33 (Figur 3, se protokoll avsnitt 3: Två-stegs proteinmärkning via dubbla aktiverade kofaktorer).
Figur 3:. Sekvensspecifik två-steg fluorescens märkning av histon H3 med Set7 / 9, SeAdoYn och TAMRA azid Proteinet MTAse Set7 / 9 metylerar naturligt aminogruppen hos lysin 4 i histon H3 (H3K4, grön) använder AdoMet. Med dubbel aktiverade kofaktor SeAdoYn den MTAse överför en liten propargylgrupp (röd) till lysinrest. Den bifogade terminalen trippelbindning sedan selektivt modifieras i ett bioorthogonal klick reaktion (kopparkatalyse azid-alkyn cykloaddition, CuAAC) med azid-derivatiserat TAMRA (tetrametylrodamin, blå) fluoroforen.belastning / 52014 / 52014fig3highres.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Allmänna Instruktioner
- Butiks aziridin kofaktor 6BAz (i DMSO) och protein MTAse Set7 / 9 vid -80 ° C och alla andra reagens inklusive dubbla aktiverad kofaktor SeAdoYn och DNA MTAse M.BseCI (i 50% glycerol) vid -20 ° C.
- Bestäm koncentrationen av 6BAz och SeAdoYn via UV / Vis-spektroskopi med hjälp utsläckningskoefficienterna ε 269nm (6BAz) = 16.000 cm -1 M -1 och ε 260 nm (SeAdoYn) = 15.400 cm -1 M -1 i avjoniserat vatten. Bestäm koncentrationen av MTases genom Bradford-analysen eller, om extinktionskoefficienten är tillgänglig, via direkt absorption vid 280 nm.
- Försök att undvika att skapa bubblor genom intensiv pipettering eller vortex för att förhindra förlust av enzymaktivitet. Istället, blanda genom att försiktigt pipettera upp och ned.
- När man lägger aziridin kofaktorer från förrådslösningar i DMSO kontrollera att slutlig DMSO-koncentration i analysen är mindreän 5%. Inkludera alltid 10 mM magnesiumjoner i analysbuffert för att förhindra icke-specifika reaktioner med DNA.
- När du lägger till dubbla aktiverade kofaktorer från sura stamlösningar använder små volymer (högkoncentrerade stamlösningar) för att undvika pH-förändringar och se till att pH-värdet i analyslösningen inte ändras väsentligt. Undvik tioler, t.ex. β-merkaptoetanol eller ditiotreitol (DTT), i analysbufferten eftersom de kan störa klick reaktionen genom komplex av erforderliga kopparjoner.
2. Ett steg Märkning av DNA via aziridin kofaktorer
- Sekvensspecifika Methyltransferase-Induced Label ing (ler) av plasmid DNA med M.BseCI DNA MTAse och aziridin cofaktor 6BAz.
- Tina kofaktorn lösningen vid 20 ° C och bereda reaktionsblandningarna på is.
- Utöver analysen utföra en "kofaktor" kontroll, för att visualisera alla icke specifika modifikationer, och en & #8220; enzym "kontroll, för att se till att MTAse beredningen är fri från den naturliga kofaktor AdoMet.
- För analysblandningen 2 il 10x modifiering buffert (innehållande 100 mM Tris-HCl, 100 mM MgCl2, 20 mM β-merkaptoetanol, pH 7,4), 2 | il av pBR322 (0,5 ug / ul), 10 ekv. M.BseCI per igenkänningssekvens på DNA (en igenkänningssekvens i pBR322) och aziridin cofaktor 6BAz till en slutlig koncentration av 60 pM inom en total volym av 20 | il. Lägg kofaktor och DNA MTAse sist.
OBS: β-Mercaptoethanol är giftigt, frätande och miljöfarliga. - För "kofaktor" kontroll till avjoniserat vatten i stället för M.BseCI och för "enzymet" kontroll till avjoniserat vatten i stället för 6BAz.
- Blanda lösningarna genom att försiktigt pipettera upp och ned.
- Inkubera rören vid 55 ° C under 1 h.
- Centrifugera kort att samla all vätska i botten av rören.
- Begränsning-modifiering analys för att verifiera DNA-modifiering.
- Bered en lösning genom blandning av 10 pl 10x R.TaqI buffert (innehållande 100 mM Tris-HCl, 50 mM MgCl2, 1 M NaCl, 1 mg / ml bovint serumalbumin, pH 8,0), 80 | il avjoniserat vatten och 3,3 ^ il av restriktionsendonukleas (REase) från Thermus aquaticus (R.TaqI, 10 U / l). Se till att lägga till REase i det sista steget.
- Till varje rör från 2.1.7 lägg 2 il 10x R. Taql-buffert och 28 | il av lösningen från ovan (2.2.1).
- Blanda lösningarna genom att försiktigt pipettera upp och ned.
- Inkubera rören vid 65 ° C under 30 minuter.
- Centrifugera kort att samla all vätska i botten av rören.
- Elektro shift assay (EMSA) med streptavidin att verifiera funktionell modifikation.
- Ta 25 ^ från varje rör (2.2.5) och tillsätt 2.4 il av en streptavidinlösning (1 mM med avseende på streptavidin monomer i streptavidin-buffert innehållande 100 mM Na 2 HPO 4, 100 mM NaCl, pH 7,5; 4 ekvivalenter totalt biotin). Lägg 2.4 pl streptavidin buffert till de återstående rören.
- Inkubera alla rör vid 37 ° C under 1 h.
- Analys via agarosgelelektroföres.
- Lägg 5 il 6x laddningsbuffert (0,25% bromfenolblått, 30% glycerol) till varje rör.
- Blanda lösningarna försiktigt.
- Belastning 10 pl av varje prov i brunnar på en agarosgel (1% agaros i 0,5 x TBE-buffert innehållande 1x GelRed från en 10000 stamlösning).
- Kör gelen i 0,5x TBE-buffert med 80 V för ca.. 1 tim.
- Visualisera DNA-banden på en UV-tabell (312 nm) med en CCD-kamera utrustad med ett filter (540 ± 50 nm).
OBS: UV-ljus är skadlig för ögonen och huden.
3. Två-stegs protein Märkning via Double Aktiverade kofaktorer
- Methyltransfradera-Riktad Överföring av aktiverade grupper (mtag) med Set7 / 9 och dubbel aktiverade kofaktor SeAdoYn för histon H3 lysin 4 märkning (modifikation steg).
- Tina komponenterna och förbereda reaktionsblandningarna på is. OBS: Ha alltid SeAdoYn kyls för att undvika degradering.
- Utöver analysen utför en "kofaktör" kontroll, för att visualisera eventuella icke-specifika modifieringar, och en "enzym" kontroll, för att utesluta icke-specifika reaktioner av den fluorescerande proben.
- Bered en analyslösning (20 | il) innehållande modifiering buffert (50 mM Tris-HCl, 5% glycerol, pH 8,5), 10 pM histon H3, 10 pM Set7 / 9 och 600 pM SeAdoYn (blandning av båda epimererna vid selen). I de sista stegen lägga kofaktor och sedan MTAse.
- För "kofaktor" kontroll förbereda en analyslösning som i 3.1.3 och lägga 60 mM AdoMet att konkurrera med den syntetiska kofaktor. För "enzymet" kontroll till avjoniserat vatten i stället för SeAdoYn.
- Blanda lösningarna genom att långsamt pipettera upp och ned. Kontrollera pH-värdet genom tillsats av 1 | il av varje lösning på det övre fältet av en pH-remsa (pH-område 5-10).
- Inkubera vid 37 ° C under 2 h.
- Under tiden framställa en 12% SDS-polyakrylamidgel (kör gel: 357 mM Bis-Tris pH 6,5 till 6,8, 0,1% (vikt / volym) APS, 0,04% (vol / vol) TEMED och 12% akrylamid / bisakrylamid 37,5: 1 ; lastning gel: 357 mM Bis-Tris pH 6,5 till 6,8, 0,1% (vikt / volym) APS, 0,04% (vol / vol) TEMED och 5% akrylamid / bisakrylamid 37,5: 1).
OBS: Akrylamid / bisakrylamid är giftigt och hälsofarliga. Använd handskar under denna procedur.
- Kemisk märkning av alkinylated lysin 4 i histon H3 via kopparkatalyse azid-alkyn cykloaddition (CuAAC) (märkning steg).
- Strax före slutet av modifieringsreaktionen förbereda en 5x klick blandning innehållande 3 mM CUSO4, 3 mM tris (3-hydroxipropyl-triazolylmetyl) amin (THPTA), 250 mM natriumaskorbat och 6 mM TAMRA azid med entotal volym av 20 | il.
- Tillsätt 5 ìl av nyberedd 5x klick mix till varje rör för att starta CuAAC och släcka modifieringsreaktionen.
- Blanda försiktigt genom att pipettera upp och ned.
- Skydda alla rör med aluminiumfolie från ljus för att undvika fotoblekning av fluoroforen.
- Inkubera vid 20 ° C under 1 h.
- Protein nederbörd för att avlägsna överskott av fri TAMRA fluoroforen.
- För att undvika överglänser av fluorescerande märkt histon H3 av intensiv i-gel fluorescens av fri TAMRA fluorofor, ta bort överflödig fluoroforen genom utfällning av proteiner (3.3.2 - 3.3.4) 34.
- Lägg 75 l metanol, 18,8 l kloroform och 50 pl avjoniserat vatten till varje rör och skaka en kort stund efter varje tillsats. Centrifugera vid 16000 xg under 5 minuter. Avlägsna den övre fasen utan att störa gränsskiktet, som innehåller proteinet.
- Lägg 56,3 l metanol till den återstående etappen in varje rör, vortexa och centrifugera vid 16.000 xg under 5 minuter för att pelle proteinet. Avlägsna supernatanten. Upprepa detta steg för att tvätta pelleten.
- Täck de öppna rör med en luddfri vävnad och låt dem torka i 15-30 min.
- Analys via SDS-PAGE.
- Lös de utfällda proteinerna från 3.3.4 i 20 | il SDS-laddningsbuffert (50 mM Tris-HCl, 2,5% (vikt / volym) SDS, 10% (volym / volym) glycerol, 320 mM β-merkaptoetanol och 0,05% (vikt / v) bromfenolblått, pH 6,8). Se till att fullständigt upplösa pelleten genom sköljning väggarna i rören med en pipett.
- Inkubera proverna vid 95 ° C under 10 minuter och låt dem svalna till 20 ° C.
- Centrifugera kort att samla all vätska i botten av rören.
- Fyll på hela mängden av varje prov i brunnar på en SDS-polyakrylamidgel (3.1.7). Använd 50 mM MOPS, 50 mM Tris-X (Tris-bas), 5 mM EDTA, 0,1% (vikt / vol) SDS som rinnande buffert för elektrofores.
- Kör gelen med 120 V för ca.. 90 min.
- Visualisera i-gel-fluorescens på en UV-tabell (312 nm) med en CCD-kamera utrustad med ett filter (540 nm ± 50 nm).
OBS: UV-ljus är skadlig för ögonen och huden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ett steg Märkning av DNA via aziridin kofaktorer
Detta exempel reaktion utförs med DNA MTAse M.BseCI, som modifierar den andra adeninrest inom den dubbelsträngade 5'-ATCG En T-3 'sekvens och har en igenkänningsställe på pBR322-plasmiden (Figur 4A). För att testa plasmiden märkning, är pBR322 utmanas med restriktionsendonukleaset (REase) R.TaqI (5'-TCGA-3 '). R.TaqI har sju platser på pBR322, en av vilka ingår i M.BseCI platsen. Om märkningen sker kommer M.BseCI platsen skyddas mot klyvning och ett nytt fragment med 683 baspar (bp) kommer att bilda medan två andra fragment kommer att försvinna (315 och 368 bp). Naturligtvis när man analyserar DNA märkning med andra DNA MTases olika REases med motsvarande igenkänningssekvenser bör användas.
Den agarosgel i Figur 4B visar tydligt visasning av ett nytt fragment med 683 bp (spår 3). Detta visar att märkningen av M.BseCI platsen inträffade. Endast analysen (spår 3) visar detta fragment. Den "kofaktor" kontroll (spår 5) samt "enzym" kontroll (spår 7) saknas detta band. Speciellt "enzymet" kontroll är viktigt eftersom det visar att den naturliga kofaktorn AdoMet finns inte i enzympreparatet. Specificitet av märkningsreaktionen visas genom elektro shift assay (EMSA) vid tillsats av streptavidin (figur 4B och i detalj i 4C). Elektro av 683 bp bromsas medan rörligheten för alla andra fragment utan M.BseCI webbplats är oförändrat jämfört med kontrollerna (jämför bana 4 med spår 6 och 8).
Figur 4: Sekvensspecifik biotinylering av pBR322 plasmid-DNA med M.BseCI och 6BAz. A. Plasmid karta över pBR322 visar igenkänningsställen för M.BseCI (röd) och R.TaqI (grön) samt längden av förväntade DNA-fragment i baspar (bp) efter restriktion med R.TaqI. B. Analys av DNA fragmentering och EMSA med agarosgelelektrofores. M = Marker, körfält 1 och 2: plasmid-DNA bara, spår 3 och 4: analys, spår 5 och 6: "kofaktor" kontroll, spår 7 och 8: "enzym" kontroll. Banorna 2, 4, 6 och 8 innehåller dessutom streptavidin. C. Förstorad infälld från B. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Två steg Märkning av proteiner via Double Aktiverade kofaktorer
Som ett exempel för två steg märkning av MTAse substrat med dubbelaktiverade AdoMet analoger vi valde histonH3 lysin 4 (H3K4) MTAse Set7 / 9 och den lilla SeAdoYn kofaktor. Efter enzymatisk överföring av den aktiverade propargylgrupp till histon H3 substratet (första steget), är den terminala alkynen kemiskt märkt med en azid-modifierat TAMRA fluoroforen genom CuAAC klick kemi (andra steget) (jämför figur 3). Analys av märkningsreaktionen sker genom SDS-PAGE och i-gel-fluorescensdetektion (figur 5A). Analysen (spår 1) visar ett fluorescerande band motsvarande histon H3 indikerar att sidokedjan i kofaktorn lyckades överförts och det modifierade proteinet märkt med TAMRA-fluoroforen. Inga band är synliga i "kofaktor" och "enzym" kontroller (spår 2 och 3) som visar att märkningen av histon H3 förmedlas av MTAse. Därför är icke-specifik kemisk märkning antingen av kofaktorn enbart (första steget) eller under CuAAC (andra steget) kan uteslutas. Den "kofaktor" kontroll utförs differently än i protokollet för ett steg DNA märkning. Detta beror på utfällning av histon H3 är effektivare i närvaro av Set7 / 9 och utelämna proteinet MTAse kan leda till minskade mängder av histon H3 i laddningskontroll. Således har vi lagt en hög koncentration av naturliga kofaktor AdoMet att konkurrera med SeAdoYn. Lastning av histon H3 kan enkelt kontrolleras genom färgning av gelén med Coomassie Blue efter fluorescensdetektion.
MTAse substrat kan också märkas med biotin istället för fluoroforer genom användning azid-derivatiserat biotin i den andra kemiska steget 30. Biotinylering av proteiner lämpligen analyseras genom Western blotting med pepparrotsperoxidas-konjugerat avidin. Detta visas i figur 5B för biotinylering av histon H3 med Set7 / 9, SeAdoYn och azid-modifierad biotin. Analysen i spår 1 visar en tydlig bandet för den märkta histon H3. Frånvaron av band i "enzym" (spår 2)och "kofaktor" kontroll (spår 3) visar återigen att märkningen är specifik för MTAse. Den "kofaktor" kontroll helt enkelt utförs i frånvaro av protein MTAse eftersom Western blot-analys inte kräver avlägsnande av överskott biotin genom proteinutfällning.
Figur 5: Märkning av histon H3 med proteinet MTAse Set7 / 9 och SeAdoYn följt av klickreaktioner med azid-derivatiserade etiketter. A.-gel fluorescens av TAMRA-märkt histon H3 och kontroller samt färgning med Coomassie Blue för lastning kontroll. B. Western blot-analys av biotinylerat histon H3 och kontroller med hjälp avidin-pepparrotsperoxidas (HRP) konjugat. Experimentella Förhållandena var mycket lika de för fluorescens märkning A (enzymatisk modifiering: 6,581; M histon H3, 10 pM Set7 / 9, 600 pM SeAdoYn, i 50 mM Tris-HCl, 5 mM MgCl2, 5% glycerol, pH 9,0, 30 ° C, 3 h; kemisk märkning:. 0,6 mM CUSO4, 0,6 mM THPTA, 50 mM natriumaskorbat, 1,2 mM biotin-azid, 37 ° C, 1 timme) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ett steg märkning av DNA med DNA MTases och aziridin kofaktorer (ler DNA) är en robust metod men vissa aspekter bör beaktas vid planeringen av experimentet.
Aziridin kofaktör: The 6BAz koncentration för DNA-märkning med M.BseCI var 60 pM. Vid användning av andra DNA MTases cofaktorn koncentrationen bör optimeras, t.ex. om koncentrationerna så lite som 20 ^ M har använts med DNA MTAse M.TaqI 19. Låga 6BAz koncentrationer har den fördelen att en fyrfaldigt överskott av streptavidin (bindningsställen med avseende på hela mängden biotin i analysen) kan direkt läggas till efter inkubation med REase utan att störa analysen av EMSA. Annars den biotinylerade DNA ska renas för att avlägsna överskott kofaktor och undvika utsmetning av DNA under agarosgelelektrofores. När du lägger aziridin kofaktorer från stamlösningar i DMSO se till att den slutliga DMSO-koncentrationen i the-analysen är mindre än 5%. För mycket DMSO kan inaktivera enzymer. Förvara alltid aziridin kofaktorer vid -80 ° C för att undvika nedbrytning.
DNA-MTAse: Enzymatisk koppling av aziridin kofaktorer med DNA kan leda till starka hämmare produkt och DNA MTases måste användas i stökiometriska mängder. Använd därför alltid mer än 1 ekvivalent av DNA MTAse. De flesta DNA MTases samrena med bunden AdoMet som måste avlägsnas genom omfattande dialys eller tvätta enzymerna på en kolonn med stora volymer buffert. Den "enzym" kontroll får utvisa om AdoMet är fortfarande närvarande i enzymberedningen. Märkning med M.BseCI kan också göras genom inkubation över natten vid 37 ° C.
Ändring buffert: Inkludera 10 mM magnesiumjoner i bufferten för att förhindra ospecifika reaktioner av aziridin kofaktorer med DNA. Om magnesiumjoner leder till aktivering av förorenande nukleaser, kanske bariumjoner läggas i stället.
För sekvensspecifik märkning av DNA som inte bara ler DNA men även mtag kan användas. Dubbel Här aktiverade kofaktorer används för enzymatisk överföring av sidokedjor med unika funktionella grupper till DNA. Dessa funktionella grupper, t ex primära aminer, kan modifieras med en mängd olika reportergrupper, inklusive biotin eller fluoroforer, genom NHS-ester kemi i ett andra steg 8,35,36. Alternativt har vi börjat att syntetisera dubbla aktiverade AdoMet analoger med stora sidokedjor som redan innehåller reportergruppen och använde dem för DNA märkning i ett steg.
Den två steg mtag märkningsförfarande för proteiner med dubbla aktiverade kofaktor SeAdoYn har framgångsrikt använts med ett antal protein MTases 30,31. Dock bör följande kommentarer beaktas innan du utför experimentet.
Dubbel aktiverad kofaktor: Dessa kofaktorer, inklusive havsdoYn, lagras under sura förhållanden och man måste vara försiktig att pH ändringen lösningen inte väsentligt förändras på kofaktor tillsats. Vi kontrollerar alltid pH genom att tillsätta 1 | il av modifieringen lösningen till ett pH remsan och, om pH-värdet är för lågt, tillsätt små mängder natriumhydroxid-lösning (50 mM) för att justera pH. Dessutom kofaktor analoger bör tillsättas i en låg volym för att undvika pH-förändringar. Därför bör minimala kofaktor koncentrationer som behövs för full modifikation bestämmas för andra MTases och högkoncentrerade kofaktor stamlösningar är att föredra. Kofaktor koncentrationer vanligtvis varierade mellan 10 iM och 600 ^ M. Den kemiska syntesen av dubbelaktiverade kofaktorer ger typiskt en ca 1: 1 blandning av epimerer vid svavel eller selen och separation av det biologiskt aktiva epimeren, motsvarande S -epimer av AdoMet, från det inaktiva epimeren är ofta svårt att uppnå. Sålunda kofaktor koncentrationernavanligtvis ges för en blandning av isomerer. Dubbla aktiverade kofaktor analoger är ganska instabila i rumstemperatur och bör förvaras vid -20 ° C. Se också till att tina stamlösningarna på is och hålla dem kalla under pipettering. De kan frysas igen men för att säkerställa reproducerbar aktivitet rekommenderar vi att göra portioner.
Protein MTAse: För transformationer med dubbel aktiverade kofaktorer de MTases kan användas i katalytiska mängder. Men MTases är ofta långsamma enzymer med omsättnings nummer i min -1 sortimentet med den naturliga kofaktorn AdoMet. Av praktiska skäl använder vi ofta MTases i stökiometriska mängder och minimera inkubationstid och temperatur (typiskt 10 min till 2 h och 20 ° C till 37 ° C). Den "kofaktor" kontroll varierar beroende på vilken typ av reportergruppen och upptäckt. För biotinmärkning av MTAse är helt utelämnat och analys kan göras genom Western blotting (figur 5B (figur 5A). Men om utfällning av histon H3 leder till förlust av protein, SDS-PAGE kan utökas och överskott av fri TAMRA fluoroforen kommer att köras av gelen med bromfenolblå fronten.
Modifiering buffert: Den optimala enzym buffert kan användas, men tioler, såsom ditiotreitol (DTT) och β-merkaptoetanol, bör undvikas. De binder till kopparjoner och b låsa följande CuAAC klick reaktion.
CuAAC klicka reaktion: Den slutliga koncentrationen av TAMRA azid ska vara dubbelt så hög som alkynen koncentration. Vid användning av biologiska extrakt av koppar och ligandkoncentrationen bör ökas upp till 5 mM vardera. TAMRA azid är bättre löslig i DMSO än i vatten. Se till att den slutliga koncentrationen av DMSO är mindre än 12%. Utökade inkubationstider kan leda till proteinskador och smetning på SDS polyakrylamidgel. Således bör märkningsreaktionen vara antingen stoppas av proteinutfällning eller tillägg av tioler.
Detta förfarande i två steg märkning kan också användas för att märka protein MTAse substrat med biotin antingen för Western blot upptäckt (Figur 5B) eller isolering med streptavidinbelagda magnetiska kulor. Dessutom kan dubbla aktiverade AdoMet analoger användas för att märka DNA, RNA och små naturliga produkter med motsvarande MTases.
ve_content "> Jämfört med de flesta andra metoder för märkning av nukleinsyror och proteiner, har MTAse-medierad märkning fördelen att infödda substrat kan användas direkt och ingen ytterligare modifiering krävs. Naturligtvis måste man se till att de naturliga substrat inte är blockerade genom metylering genom ett motsvarande MTAse in vivo. Dessutom är MTAse-medierad märkning mycket flexibel både i termer av reportergrupper, som inkluderar biotin, fluoroforer eller andra molekylära markörer, såväl som mål för MTases. ombasera, en databas för restriktions endonukleaser och DNA MTases, listar mer än 700 experimentellt karaktäriserade DNA MTases med hundratals olika sekvenser erkännande spänner från två till åtta bp 37 och det förväntas att mer än 200 olika MTases av alla typer produceras i den mänskliga cellen 38. En viktig faktor för MTAse-aktivitet är om AdoMet analoga passar in i enzymet aktiva säte. Även de presenterade kofaktorer 6Baz och SeAdoYn är utformade för att ha små reaktiva grupper, vissa MTases kanske inte gärna accepterar dem. I dessa fall de aktiva platserna skulle kunna förstoras genom proteinteknik som har visats för DNA 35, RNA 23 och protein MTases 25-28 med steriskt mer krävande dubbla aktiverade AdoMet analoger. Sekvensspecifik märkning av DNA och RNA med AdoMet analoger är av stort intresse för genotypning (DNA-kartläggning) 36 och metylering upptäckt 39, funktionella studier av DNA / RNA och DNA / RNA-modifierande enzymer 15 samt för (nano) bioteknik 13, 14 och genavgivning 19. Andra metoder för sekvensspecifik kovalent DNA märkning beroende syntetiska triple helix-bildande oligodeoxynukleotider, peptidnukleinsyror eller hårnål polyamider som riktar enheter eller sekvensspecifika nicking endonukleaser (NEases) följt av nick translation märkning.
Specifik märkning av proteiner med dubbla aktiverade AdoMet analoger har främst riktat mot tillämpningar inom proteomik forskning, t.ex. identifiering av nya substrat för protein MTases i komplexa biologiska blandningar 27,28, men andra applikationer, som funktionella studier, bör också vara genomförbart. Även MTAse-medierad märkningen har huvudsakligen utförts med renade MTases in vitro, kan märkningen även uppnås i levande celler som har rapporterats nyligen 40. Naturligtvis många andra metoder för specifikt protein märkning finns 3,4. Förutom inkorporering av onaturliga aminosyror som använder modifierade celler som de brukar kräva genetiska fusioner av proteinet av intresse med själv märkning taggar / proteins eller taggar för enzymmedierad märkning. I detta avseende korta peptidsekvenser som tjänstgör som substrat för protein MTases, t.ex. N-terminala histon svansar, skulle kunna fuseras till ett protein av intresse och specifikt märkt med AdoMet analoger och motsvarande protein MTases.
Slutligen kan biokatalytisk repertoar av småmolekylära MTases utökas med syntetiskt AdoMet analoger 41-44. Detta utgör en ny metod för att införa strukturell mångfald i naturliga produkter, t.ex. antibiotika eller polyketider, vilket bör finna intressanta applikationer i screening för nya biologiska aktiviteter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6BAz | Synthesized according to Weinhold et al., Patent number US 8,129,106, published March 6, 2012. | ||
| β-Mercaptoethanol | Serva | 28625 | |
| Acetic acid | Fisher Scientific | 10304980 | |
| Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 | Serva | 10688 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500100 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Serva | 13375 | |
| Bis-Tris | Gerbu | 1304 | |
| Boric acid | Gerbu | 1115 | |
| Bromophenol blue Na salt | Serva | 15375 | |
| Copper(II) sulfate | Aldrich | C1297 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | 10020090 | |
| Coomassie Brilliant Blue | Serva | 17525 | |
| EDTA disodium salt | Gerbu | 1034 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| GelRed (10,000x in water) | Biotium | 41003 | |
| Glycerol (99.5%) | Gerbu | 2006 | |
| FastRuler Low Range DNA Ladder | Thermo Scientific | SM1103 | |
| Histone H3 | Expression plasmid obtained from Dr. Philipp Voigt and Prof. Danny Reinberg; expression and isolation according to T. J. Richmond et al., J. Mol. Biol. 1997, 272, 301-311. | ||
| M.BseCI | Expression plasmid obtained from Dr. Michael Kokkinidis; expression and isolation according to Kapetaniou et al., Acta Cryst. 2006, F63, 12-14. | ||
| Methanol | Fisher Scientific | 10675112 | |
| Magnesiumchloride hexahydrate | J.T. Baker | 4003 | |
| MOPS | Gerbu | 1081 | |
| Sodium chloride | Gerbu | 1112 | |
| pH strip (Neutralit) | Merck | 1,095,330,001 | |
| pBR322 | Thermo Scientific | SD0041 | |
| R.TaqI (10 u/µl) | Thermo Scientific | ER0671 | |
| SeAdoYn | Synthesized according to Willnow et al., ChemBioChem 2012, 13, 1167-1173. | ||
| Set7/9 | Expression plasmid obtained from Prof. Danny Reinberg, expression and isolation according to D. Reinberg et al., Genes Dev.2002, 16, 479-489. | ||
| Streptavidin | Gerbu | 3058 | |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma Life Science | A7631 | |
| SDS Granular | Gerbu | 1833 | |
| di-Sodium hydrogenphosphate | Merck | 106,586 | |
| TAMRA azide | Synthesized according to reference 30: Willnow et al., ChemBioChem 2012, 13, 1167-1173. | ||
| TaqI buffer (10x) | Thermo Scientific | B28 | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Acros Organics | 42058 | |
| Tris-HCl | Gerbu | 1028 | |
| Tris-X (TRIS-base) | Gerbu | 1018 | |
| Tris(3-hydroxypropyltriazolyl-methyl)amine (THPTA) | Sigma-Aldrich | 762342 |
References
- Gottfried, A., Weinhold, E. Sequence-specific covalent labelling of DNA. Biochem. Soc. Trans. 39, 623-628 (2011).
- Zohar, H., Muller, S. J. Labeling DNA for single-molecule experiments: methods of labeling internal specific sequences on double-stranded DNA. Nanoscale. 3, 3027-3039 (2011).
- Hinner, M. J., Johnsson, K. How to obtain labeled proteins and what to do with them. Curr. Opin. Biotechnol. 21, 766-776 (2010).
- Wua, Y. -W., Goody, R. S. Probing protein function by chemical modification. J. Pept. Sci. 16, 514-523 (2010).
- Struck, A. -W., Thompson, M. L., Wong, L. S., Micklefield, J. S-Adenosyl-methionine-dependent methyltransferases: Highly versatile enzymes in biocatalysis, biosynthesis and other biotechnological applications. ChemBioChem. 13, 2642-2655 (2012).
- Klimasauskas, S., Weinhold, E. A new tool for biotechnology: AdoMet-dependent methyltransferases. Trends Biotechnol. 25, 99-104 (2007).
- Pljevaljcic, G., Schmidt, F., Weinhold, E. Sequence-specific Methyltransferase-Induced Labeling of DNA (SMILing DNA). ChemBioChem. 5, 265-269 (2004).
- Lukinavicius, G., Lapiene, V., Stasevskij, Z., Dalhoff, C., Weinhold, E., Klimasauskas, S. Targeted labeling of DNA by methyltransferase-directed Transfer of Activated Groups (mTAG). J. Am. Chem. Soc. 129, 2758-2759 (1021).
- Pignot, M., Siethoff, C., Linscheid, M., Weinhold, E. Coupling of a nucleoside with DNA by a methyltransferase. Angew. Chem. Int. Ed. 37, 2888-2891 (1998).
- Weller, R. L., Rajski, S. R. Design, synthesis, and preliminary biological evaluation of a DNA methyltransferase-directed alkylating agent. ChemBioChem. 7, 243-245 (2006).
- Du, Y., Hendrick, C. E., Frye, K. S., Comstock, L. R. Fluorescent DNA Labeling by N-Mustard Analogues of S-adenosyl-l-methionine. ChemBioChem. 13, 2225-2233 (2012).
- Pljevaljcic, G., Schmidt, F., Scheidig, A. J., Lurz, R., Weinhold, E. Quantitative labeling of long plasmid DNA with nanometer precision. ChemBioChem. 8, 1516-1519 (1002).
- Wilkinson, S., et al. Molecular scale architecture: engineered three- and four-way junctions. Bioconjugate Chem. 19, 470-475 (2008).
- Braun, G., et al. Enzyme-directed positioning of nanoparticles on large DNA templates. Bioconjugate Chem. 19, 476-479 (2008).
- Kim, S., et al. Enzymatically incorporated genomic tags for optical mapping of DNA binding proteins. Chem. Int. Ed. 51, 3578-3581 (2012).
- Rina, M., Bouriotis, V. Cloning purification and characterization of the BseCI DNA methyltransferase from Bacillus stearothermophilus. Gene. 133, 91-94 (1993).
- Sequence-specific detection of methylation in biomolecules. US Patent. Weinhold, E., Meier, T., Düfel, H., Markert-Hahn, C., Schmuck, R. , 8,129,106 (2012).
- Pljevaljcic, G., Pignot, M., Weinhold, E. Design of a new fluorescent cofactor for DNA methyltransferases and sequence-specific labeling of DNA. J. Am. Chem. Soc. 125, 3492-3410 (2003).
- Schmidt, F. H. -G., Hüben, M., Gider, B., Renault, F., Teulade-Fichou, M. -P., Weinhold, E. Sequence-specific Methyltransferase-Induced Labelling (SMILing) of plasmid DNA for studying cell transfection. Bioorg. Med. Chem. 16, 40-48 (2008).
- Dalhoff, C., Lukinavicius, G., Klimasauskas, S., Weinhold, E. Direct transfer of extended groups from synthetic cofactors by DNA methyltransferases. Nat. Chem. Biol. 2, 31-32 (2006).
- Lukinavicius, G., Tomkuviene, M., Masevicius, V., Klimasauskas, S. Enhanced chemical stability of AdoMet analogues for improved methyltransferase-directed labeling of DNA. ACS Chem. Biol. 8, 1134-1139 (2013).
- Motorin, Y., et al. Expanding the chemical scope of RNA:methyltransferases to site-specific alkynylation of RNA for click labeling. Nucleic Acids Res. 39, 1943-1952 (1943).
- Schulz, D., Holstein, J. M., Rentmeister, A. A chemo-enzymatic approach for site-specific modification of the RNA cap. Angew. Chem. Int. Ed. 52, 7874-7878 (2013).
- Peters, W., et al. Enzymatic site-specific functionalization of protein methyltransferase substrates with alkynes for click labeling. Angew. Chem. Int. Ed. 49, 5170-5173 (2010).
- Islam, K., Zheng, W., Yu, H., Deng, H., Luo, M. Expanding cofactor repertoire of protein lysine methyltransferase for substrate labeling. ACS Chem. Biol. 6, 679-684 (2011).
- Wang, R., Zheng, W., Yu, H., Deng, H., Luo, M. Labeling substrates of protein arginine methyltransferase with engineered enzymes and matched S-adenosyl-l-methionine analogues. J. Am. Chem. Soc. 133, 7648-7651 (2011).
- Islam, K., et al. Bioorthogonal profiling of protein methylation using azido derivative of S-adenosyl-l-methionine. J. Am. Chem. Soc. 134, 5909-5915 (2012).
- Islam, K., et al. Defining efficient enzyme-cofactor pairs for bioorthogonal profiling of protein methylation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 16778-16783 (2013).
- Binda, O., Boyce, M., Rush, J. S., Palaniappan, K. K., Bertozzi, C. R., Gozani, O. A chemical method for labeling lysine methyltransferase substrates. ChemBioChem. 12, 330-334 (2011).
- Willnow, S., Martin, M., Lüscher, B., Weinhold, E. A selenium-based click AdoMet analogue for versatile substrate labeling with wild-type protein methyltransferases. ChemBioChem. 13, 1167-1173 (2012).
- Bothwell, I. R., et al. Se-Adenosyl-l-selenomethionine cofactor analogue as a reporter of protein methylation. J. Am. Chem. Soc. 134, 14905-14912 (2012).
- Tomkuviene, M., Clouet-d’Orval, B., Cerniauskas, I., Weinhold, E., Klimasauskas, S. Programmable sequence-specific click-labeling of RNA using archaeal box C/D RNP methyltransferases. Nucleic Acids Res. 40, 6765-6773 (2012).
- Nishioka, K., et al. Set9, a novel histone H3 methyltransferase that facilitates transcription by precluding histone tail modifications required for heterochromatin formation. Genes Dev. 16, 479-489 (2002).
- Clark, P. M., et al. Direct in-gel fluorescence detection and cellular imaging of O-GlcNAc-modified proteins. J. Am. Chem. Soc. 130, (2008).
- Lukinavicius, G., Lapinaite, A., Urbanaviciute, G., Gerasimaite, R., Klimasauskas, S. Engineering the DNA cytosine-5 methyltransferase reaction for sequence-specific labeling of DNA. Nucleic Acids Res. 40, 11594-11602 (2012).
- Neely, R. K., Dedecker, P., Hotta, J., Urbanaviciute, G., Klimasauskas, S., Hofkens, J. DNA fluorocode: A single molecule, optical map of DNA with nanometre resolution. Chem. Sci. 1, 453-460 (2010).
- Roberts, R. J., Vincze, T., Posfai, J., Macelis, D. REBASE-a database for DNA restriction and modification: enzymes, genes and genomes. Nucleic Acids Res. 38, 234-236 (2010).
- Petrossian, T. C., Clarke, S. G. Uncovering the human methyltransferasome. Mol. Cell. Proteomics. 10, 1-12 (2011).
- Kriukiene, E., et al. DNA unmethylome profiling by covalent capture of CpG sites. Nat. Commun. 4, 2190 (2013).
- Wang, R., et al. Profiling genome-wide chromatin methylation with engineered posttranslation apparatus within living cells. J. Am. Chem. Soc. 135, 1048-1056 (2013).
- Zhang, C., Weller, R. L., Thorson, J. S., Rajski, S. R. Natural product diversification using a non-natural cofactor analogue of S-adenosyl-l-methionine. J. Am. Chem. Soc. 128, 2760-2761 (2006).
- Stecher, H., et al. Biocatalytic Fiedel-Crafts alkylation using non-natural cofactors. Angew. Chem. Int. Ed. 48, 9546-9548 (2009).
- Lee, B. W. K., Sun, H. G., Zang, T., Kim, B. J., Alfaro, J. F., Zhou, Z. S. Enzyme-catalyzed transfer of a ketone group from an S-adenosylmethionine analogue: A tool for the functional analysis of methyltransferases. J. Am. Chem. Soc. 132, 3642-3643 (2010).
- Winter, J. M., et al. Expanding the structural diversity of polyketides by exploring the cofactor tolerance of an inline methyltransferase domain. Org. Lett. 15, 3774-3777 (2013).
