우리는 전체 세포 패치 – 클램프 및 마우스 뇌의 급성 조직 슬라이스에서 수상 돌기 및 해마 신경 세포의 쪽의 세포 내 나트륨 과도 다중 광자 이미징 신경 활성 화합물의 초점 UV 유도 된 사진 활성화의 조합을 설명합니다.
다중 광자 형광 현미경은 높은 시공간 해상도의 손상 조직에서 뇌 세포의 형태 학적 및 생리 학적 파라미터들의 분석을 가능하게했다. 전기 생리학과 결합, 그것은 널리 돌기 및 돌기 쪽이 작은 세포 내 구획 활동 관련 칼슘 신호를 연구하는 데 사용됩니다. 칼슘 과도 외에도 시냅스 활성은 또한 시냅스 나트륨 신호 미미한 이해되고있는 특성을 유도한다. 여기서는 중앙 신경 세포에 결합 된 미소 영역 전체 세포 패치 – 클램프 및 다중 광자 나트륨 촬상하기위한 방법을 설명한다. 또한, 우리는 조직의 글루타메이트 수용체의 신뢰성과 초점 작동되도록 자외선 (UV) 글루탐산 – 빛에 의한 uncaging에 대한 수정 절차를 소개합니다. 이를 위해, 전체 셀 녹음 Cornu Ammonis 세분 한 (CA1)의 급성 조직 슬라이스의 피라미드 뉴런에서 수행 하였다마우스 해마. 뉴런은 패치 피펫을 통해 나트륨에 민감한 형광 염료 SBFI 가득하고, SBFI의 다 광자 여기에는 수상 돌기에 인접한 쪽의 시각화를 사용 하였다. UV-유도 된 초점 uncaging을 확립하기 위해, 광량, UV uncaging의 빔에 의해 영향 볼륨 빔의 위치 결정뿐만 아니라, 케이지 화합물의 농도 등 여러 가지 파라미터를 테스트하고 최적화 하였다. 우리의 결과는 갇힌 글루타메이트 (MNI-글루타민산)와 그 지역의 관류와 수상 돌기 및 등뼈의 안쪽으로 전류와 나트륨 과도에서의 초점 UV-uncaging 결과를 보여줍니다. 시간 경과와 내측 전류 나트륨 신호 모두의 진폭은 uncaging 펄스의 지속 기간과 연관. 또한, 우리의 결과는이 통로 비록 나트륨 유입에 의해 매개된다는 보여주는 세포 내 나트륨 이온 성 신호가 글루타메이트 수용체 차단제의 존재 하에서 차단되는 것으로 나타났다. 요약하면, 우리의 방법에 대한 신뢰할 수있는 도구를 제공합니다뇌 조직 손상에 초점 수용체 활성화에 의해 유도 된 세포 내 나트륨 신호들의 조사.
이러한 다중 광자 현미경과 같은 광학 현미경 기술의 최근 개선은 높은 공간 및 시간 해상도로 그대로 조직에서 뇌 세포의 형태 학적 및 생리 학적 파라미터의 연구를 활성화. 전기 생리학과 결합,이 기술은 현재 널리 즉 미세 돌기 및 돌기 쪽의 작은 세포 내 구획에서 신경 세포의 활동과 관련된 전기 신호뿐만 아니라 부수적 인 칼슘 신호를 분석하는 데 사용됩니다. 칼슘 과도 외에도 시냅스 활성 또한 덴 드라이트 및 등뼈 나트륨 신호를 유도의 특성은 크게 비경이다. 이러한 신호는 [나 +] 상당한 염료 표백 또는 광 손상 1,2없이 장기간 제가 과도 온라인 측정을 가능하게 세포 내 나트륨 이광자 영상 ([나 +] I)에 의해 분석 될 수있다.
[나 +] 난의 이미징을위한 </> 서브, 단 몇 화학 표시기 염료는, 예를 들어 코로나 녹색 또는 아산테 나트륨 녹색 3,4 사용할 수 있습니다. + 나 촬상 대한 가장 일반적으로 사용되는 형광 프로브는 나트륨 – 결합 벤조 푸란 이소 프탈레이트 (SBFI)를이다. 이것은 잘 알려진 칼슘 민감 염료의 Fura-2와 유사한 비율 적, UV 여기 된 염료이고 (예 5,6)는 많은 세포 유형에서 종래 + 나 촬상을 위해 사용되었다. 흥미로운 염료 및 형광을 수집하는 다른 가능성이 있습니다. 높은 시간 해상도 (즉, 높은 촬상 프레임 레이트), 공간 정보와 함께 필요한 경우 SBFI는 고속 전하 검출 크세논 아크 램프 또는 고출력 발광 다이오드 (LED) 장치 및 그 발광으로 여기 될 수있다 -coupled 소자 (CCD) 카메라 7,8. 깊은 조직에서 최대 공간 해상도를 들어, 다중 광자 레이저 주사 현미경 (9)의 선택 방법이다. 상대적으로 낮은 양자 efficie(- 0.5 mM의 2) 및 날카로운 미세 전극 (10) 또는 패치 피펫 1 비아 SBFI의 불 투과성 멤브레인 형태의 직접 로딩 중 SBFI NCY 염료는 비교적 높은 농도를 필요로한다.
SBFI를 사용하여 쥐 해마의 급성 조직 슬라이스에서 수행 초기 연구는 주로 1,2 수용체 이온 성 NMDA을 통해 나트륨의 유입에 의해 발생 CA1 피라미드 뉴런의 수상 돌기 및 등뼈 활동 관련 나트륨 과도를 보여 주었다. 더 자세하게 현지 나트륨 신호의 특성 연구를 위해, 수용체 작용제의인가에 의해 시냅스 수용체의 활성화는 특정 선택의 매우 적합한 방법이다. 시냅스 활동 및 송신기 릴리스를 모방하기 위해, 응용 프로그램은 상대적으로 짧은하고 현지 자극 수 있도록 집중해야한다. 그러나, 이것은 조직 손상에 매우 어려운 것으로 판명. 뾰족한 피펫을 사용하여 수용체 작용제의 현지 압력 응용 프로그램은 매우 초점 AP 통신을 가능하게습곡은 있지만 (예컨대 수지상 또는 돌기 쪽로서 예) 관심있는 구조의 움직임을 제조 위험을 호스팅, 따라서 고해상도의 촬상을 방해. 신경 활성 물질의 이온 토 포레 시스의 적합성은 자신의 전기적 특성에 따라 달라지며 높은 전류 진폭뿐만 아니라 세포 아티팩트를 생성 할 수있다.
이러한 장애물을 회피하는 한 방법은 광 활성 화합물 및 이의 플래시 광분해의 채용이다. 기본적으로, 두 개의 서로 다른 원리가 갇힌 물질의 광 활성화를 위해 사용된다 : 레이저 (12)와 조합하여 스캐닝 모듈을 이용하는 I) 와이드 필드 플래시 광분해 (11) 및 II)의 초점 uncaging. 와이드 필드 플래시 광분해가 큰 관심 영역을 활성화하기 위해 사용되지만, 예를 들면, 전체 셀은 초점 uncaging 특별히 작은 세포질 구획을 자극하기 위해 사용된다. 본 연구에서 우리는 전체 세포 패치 – 클램프 및 다중 페이지를위한 절차를 보여조직의 글루타메이트 수용체의 신뢰성과 초점 작동되도록 글루타메이트의 자외선에 의한 uncaging에 대한 수정 절차와 결합 돌기 및 중앙 신경 세포의 등뼈에 hoton 나트륨 이미징,.
본 연구는 SBFI 작은 세포의 세포 내 구획 나트륨 과도 이광자 촬상에 적합하다 보여준다. 그것은 SBFI의 양자 효율은 나트륨 농도가 다소 낮은 15 상대적인 변화가 생리 활성을 갖는 아주 작은이라는 점을 명심해야한다. 따라서, 미세 공정에서 나트륨 + 과도 고분해능 측정이 비교적 지루한 작업이며, 여러 가지 실험의 비닝 (binning) 또는 평균화 양호한 신호를 얻을 필요가있다. 또한, 나트륨 과도 동력학 확장 된 시간 기간에 대해 기록하는 것이 의무화 놀랍게도 느리다. 이러한 관찰은 신경 돌기 교세포와 나트륨 과도 단지 수 붕괴 실온 1,2,6에서 10 초의 범위에서 큰 감쇠 시간 상수에 의해 특성화 된 곳 이전 연구에서 이들에 대응한다. 나트륨 과도 따라서 훨씬 느린 시간 협력을 발휘하는 것urse 칼슘 과도 (16)에 비해 훨씬 더 큰 감쇠 시상수.
이러한 단점을 따로 설정, 나트륨 이미징은 신경 세포의 하위 도메인의 생리 학적 특성 조사를위한 유용한 도구가 될 증명한다. 예를 들어, 나트륨 이미징 또는 가까운 활성 시냅스에 흥분성 시냅스 활동을 감시하는 역할을 할 수 있습니다. 나트륨은 본질적으로 8, 17 버퍼링되지 않으므로, 활성 유도 나트륨 과도 선형 시냅스 글루타메이트 방출 다양한 관련 또는 외생 글루타메이트를 적용한다. 그들은 따라서 신경 세포의 글루타메이트 활동의 직접적이고 공정한 지표를 나타냅니다. 또한, 나트륨 인디케이터 염료는 높은 K D의 집 (SBFI의 K (D)가 25 내지 1 mm의 범위에있다) 나타낸다. (- 1 ㎜ 통상 0.5), K의 높은 D의이 염료 자체가 발을위한 버퍼로서 작용하지 않는 것을 의미하더라도 충분한 휘도를 달성하기 위해 사용되는 상대적으로 높은 세포 농도에서 염료odium. 결과적으로, 그들은 칼슘에 민감한 염료 셀 (18)에 도입 할 때 항상 문제가되는 나트륨 과도 전류의 진폭도 시간 과정을 왜곡하지 않습니다. 따라서 그것은 감지 된 신호가 세포 내 나트륨의 "진짜"변화의 좋은 척도를 나타내는 것으로 가정 할 수있다. 그들의 느린 시간 경과 후 뉴런에 대한 세포 내 나트륨 확산 속도는 이전에 19을 가정보다 훨씬 작은 것을 의미한다.
등뼈 및 수지상으로 흥분성 시냅스 전달 나트륨 유입 경로의 특성을 어드레싱 실험 성공적인 실행을위한 중요한 요구 사항은 시냅스 구조를 빠르고 높은 국부 활성화의 유도이다. 이는 척추의 직접 또는 근방 갇힌 화합물의 플래시 광분해 수지상에 글루타메이트 또는 글루타메이트 작용 물질의 신속하고 로컬 애플리케이션에 의해 얻을 수있다. 플래시 광분해하지 기계적 DAMA을 수행GE의 조직, 운동 유물의 무료이며 아니라 관련 질문의 조사를 위해 (예를 들어 지역의 칼슘 신호)를 설립한다. uncaging 스폿의 직경은 XY 평면 내에서 1.5 μM이었다. Uncaging 두 쪽의 가시 덴 드라이트에 의한 나트륨 신호에 가까운 부모 덴 드라이트 (dendrite). 신호 uncaging 스폿에 가장 가까운 쪽의 큰 경향 반면, 상위 덴 드라이트의 진폭과 등뼈가 여전히 멀리 uncaging 스폿의 직접적인 근방에서와 다소 유사 하였다. Uncaging 안쪽 전류 진폭이 증가하는 동안 300 밀리 초 동안 수행 하였다. Uncaged 글루타메이트가 멀어 uncaging 지점에서 수지상 영역과 등뼈에 이온 성 글루타메이트 수용체 나트륨 유입 활성화, 동일 기간 동안 조직에 확산 한 것이다.
셀 입욕 용액을 통해 투여 갇힌 화합물의 광분해를위한 UV 레이저를 사용할 때 발생하는 본질적인 문제'내부 필터링'입니다. 때문에 케이지의 높은 흡수율, UV 광 자극 사이트 (20, 21)로부터 대물 도중에 강하게 감쇠된다. 이를 방지하기 위해 적합한 방법은 또한 최소로 필요한 갇힌 화합물의 양을 감소 자극 사이트로 제한 케이지 로컬 관류이다. UV 레이저 주사 매개 uncaging, 근 적외선 이광자에 비해 uncaging 22 자극 정밀도 z 축으로 증가하기 때문에, 주로, 공간적으로 더 정확하다. 한편, 때문에, 이광자 여기에 채용 높은 갇힌 화합물의 농도 또는 매우 높음 어느 잠재적 광독성 광도 필요할 때 장파장위한 일반적으로 사용되는 케이지 작은 횡단면. 또한, 이광자 uncaging은 장비에 훨씬 더 높은 투자를 필요로한다; 다른 사람의 사이에서, 추가로 IR 레이저 플러스 필요한 광학 부품이 필요하다.
SBFI 및 MNI 글루탐산 모두 동일한 파장 범위에서 고르기가있다. 이것은 uncaging 플래시 및 / 또는 IR 빔에 의해 글루타메이트의 연속 uncaging 의해 SBFI의 표백 결과, 레이저 및 UV uncaging SBFI 또는 IR 촬상 레이저 및 MNI-글루타메이트의 의도하지 않은 상호 의존성을 초래할 수있다. 도 6c에 도시 된 바와 같이 단, 어느 쪽도 그 자체 다 광자 촬상 의한 UV 플래시가 우리의 실험 조건 하에서 같은 상호 영향을 발생하지 않는다.
여기에 설명 된 것과 유사한 UV 점멸 시스템은 여러 실험실에서 일상적으로 사용되며, 비교적 용이하게 기존의 다중 광자 현미경 이미징에 혼입 될 수있다. 그것은 광분해 용 레이저 빔이 시야에 자유롭게 배치 될 수있는 장점을 제공한다. 또한, 시스템은 실험 기간 동안 시야에 각각 레이저 빔의 빠르고 자동화 재배치 및 박리 볼륨을, 가능하게한다. 오우R 개질 단순화 및 이미징 소프트웨어의 프레임이 복합적 으 이미징 uncaging 프레임들을 조정하는 역할을 할 수 있도록, uncaging 스폿의 정확한 위치 결정을 개선시킨다.
이와 함께, 글루타메이트의 자외선에 의한 uncaging에 대한 수정 절차와 결합 돌기 및 중앙 신경 세포의 등뼈에서 전체 세포 패치 – 클램프 및 다중 광자 나트륨 이미징, 조직의 글루타메이트 수용체의 신뢰성과 초점 활성화 할 수 있습니다. 따라서 그것은 본래 조직에서 신경 세포에서 흥분성 시냅스 전달 및 시냅스 나트륨 신호의 특성을 분석하는 역할을 할 수있다.
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 저자는 S. Durry와 C. 로드리고 전문 기술 지원, 그리고 M. Dübbert (전자 공학 연구소, 동물학 연구소 감사드립니다 CRR하는 독일 과학 재단 (DFG, Ro2327 / 6-1)의 연구비 지원 포켈 셀 컨트롤러와 HF 스위치를 구현하는 데 필요한 지원을위한 쾰른, 대학, 독일).
Hadrware/Software Component | Manufacturer | Type | Comment |
Borosilicate-glass capillaries | Hilgenberg | 1405059 | 75 mm x 2 mm, wall thickness 0.3 mm |
Camera | Jenoptik | ProgRes MF | IR-DIC compatible camera |
Deconvolution software | SVI | Huygens Pofessional X11 | |
Fiber optic spectrometer | Ocean Optics | USB 4000 | Miniature fiber optic spectrometer |
Filter tubes | VWR | cenrifugal filter, 0.2 µm | |
Imaging software | Olympus Europe | Flowview Ver 5.0c, Tiempo | |
IR beam power controller | Custom built | Laser beam intensity control + fast switch to zero on flyback via pockels cell | |
IR laser | SpectraPhysics | Mai-Tai VF-N1S | fs-pulsed Ti:Sa tunable laser (710-990 nm); CAUTION |
IR power monitor | Custom built | ||
Micromanipulator | Burleigh | PCS 5000 | |
Microscope/Imaging System | Olympus Europe | BX51WI/FV300 | Both, the microscope and the imaging systems were strongly modified |
ND filter wheel | Newport | 50Q04AV.2 | UV fused silica, optical density 0.05-2.0 |
Objective | Nikon Instruments Europe | NIR Apo 60x/1.0w | |
Patch clamp amplifier | HEKA | EPC-10 | |
Pipette puller | Narishige | Model PP-830 | |
Pneumatic drug ejection system | NPI Electronic | PDES-DXH | |
Pockels cell | Conoptics | 350-80 LA-BK | EOM, used as fast switch and for power adjustment |
Pockels cell driver | Conoptics | M302-RM | High voltage differential amplifier |
Shutter | Vincent Associates | LS6ZM2 | ALMgF2-coated BeCu blades |
Shutter controller | Custom built | ||
Shutter driver | Vincent Associates | Uniblitz VCM D1 | |
Slicer / Vibratome | Thermo Scientific | Microm HM 650 V | |
Uncaging software | Rapp OptoElectronic | UGA40 1.1.2.6 + NetCam | |
UV laser | Rapp OptoElectronic | DL-355/10 | cw DPSSL Laser, 355 nm; 10 mW; CAUTION |
UV laser scanning system | Rapp OptoElectronic | UGA 40 | Galvanometric scanning system |
Name of Compound | Catalog Number | Comments/Description | |
CNQX | Sigma Aldrich | C-127 | AMPA receptor antagonist; CAUTION |
DL-AP5 | Alfa Aesar | J64210 | NMDA receptor antagonist; CAUTION |
SBFI K+ Salt | Teflabs | OO32 | |
TTX | Ascent Scientific | Asc-055 | Inhibitor of voltage-dependent Na+ channels; CAUTION |
NMI-caged-L-Glutamate | Torcis | 1490 | Caged glutamatereleased upon UV absobtion |