我们描述了焦紫外线引起的光激活的神经活性化合物与全细胞膜片钳和在枝晶和海马神经元的棘在小鼠脑的急性组织切片的细胞内钠瞬变多光子成像的组合。
多光子荧光显微镜,使脑细胞的形态和生理参数的分析,在完整的组织具有较高的空间和时间分辨率。再加上电,它被广泛用于研究活动相关的钙信号在小亚细胞如树突和树突棘。除了钙瞬变,突触活动也诱导突触后钠信号,其中仅略微理解的属性。在这里,我们描述了结合全细胞膜片钳和多光子成像钠在中央神经元细胞的微结构域的方法。此外,我们介绍了紫外(UV)谷氨酸 – 光诱导的解笼锁,这使得谷氨酸受体在组织中的可靠和焦活化的改性过程。为此,全细胞记录了上考纽Ammonis细分1(CA1)中的急性组织切片锥体神经元进行小鼠海马。神经元中装满通过膜片移液管中的钠敏感荧光染料SBFI和SBFI的多光子激发启用树突和相邻脊的可视化。建立由紫外线引起的焦解笼锁,几个参数,包括光的强度,体积受紫外线解笼锁梁,梁的定位以及笼形化合物的浓度进行了测试和优化。我们的研究结果表明,与笼谷氨酸(MNI-谷氨酸)局部灌注,其焦点紫外光解笼锁导致的内向电流和瞬态钠树突棘。时间过程和两个内向电流和钠的信号的振幅相关的解笼锁脉冲的持续时间。此外,我们的结果表明,细胞内的钠信号被阻断的阻断剂的存在下进行离子型谷氨酸受体,这表明它们是由潮虽然该通路钠介导的。总之,我们的方法提供了一个可靠的工具调查大鼠局灶性受体激活在完整的脑组织细胞内钠的信号。
在诸如多光子显微术的光显微技术的最新改进已启用的脑细胞的形态和生理参数的研究,在完整的组织具有较高的空间和时间分辨率。联合电生理学,这些技术现在被广泛用于分析活动有关的神经元的电信号,以及随之而来的钙信号中的小的亚细胞区室,即在细树突和树突棘。除了钙瞬变,突触活动也诱导树突和棘钠的信号,其中的性能是基本未开发。这样的信号可以通过细胞内钠的双光子成像([Na +]为ⅰ)它使在线测量[的Na +] i的瞬时长时间不显著染料漂白或光损伤1,2进行分析。
对于[娜+] i的成像</子>,只有少数化学指示剂染料可用, 如电晕绿色或阿散蒂绿钠3,4。最常用的荧光探针的Na +成像是钠结合的苯并呋喃间苯二甲酸酯(SBFI)。它是一种比例,UV激发类似于众所周知的钙敏感染料呋喃-2染料,并已用于常规的Na +成像在许多细胞类型( 例如,5,6)。有令人兴奋的染料和收集其荧光的不同的可能性。如果高时间分辨率( 即高的成像帧速率)是必需的,具有空间信息结合,SBFI可兴奋与高速充电检测的氙弧灯或高功率发光二极管(LED)器件和其发射耦联器件(CCD)摄像机7,8。为深的组织最大空间分辨率,多光子激光扫描显微术是选择9的方法。相对较低的量子efficieSBFI的NCY就必须相对较高的染料浓度(0.5 – 2毫米),并通过一个尖锐的微电极10或膜片电极1直接加载SBFI的不可透过膜的形式的。
使用SBFI,在啮齿动物海马急性组织切片进行的早期工作证明了这些主要是通过离子型NMDA受体引起钠涌入受体1,2树突CA1锥体神经元和刺活动相关的钠瞬变。为更详细地,例如本地钠信号的特性的研究中,突触后受体通过应用受体激动剂中的特定激活是一个选择的非常适合的方法。为了模拟突触前活性和递质释放,应用程序应该是比较简短,重点突出,使局部刺激。然而,这被证明是在完整的组织相当有挑战性的。用细尖的吸管受体激动剂的局部压力应用,使非常焦距AP褶皱,但承载用于产生感兴趣结构的运动( 例如,诸如枝状晶体或树突)的潜在风险,并因此阻碍了高分辨率成像。的神经活性物质的离子电渗疗法的适合性取决于它们的电性能和高的电流幅值可能产生蜂窝工件为好。
绕过这些障碍的方法之一是光激活化合物和其光解就业。基本上,用于光激活笼物质的两种不同的原则:1)宽视场光解11和II)焦解笼锁采用扫描模块与激光器12的组合。而宽视场光解被用于激活放大感兴趣的区域, 例如 ,一个完整的细胞,焦解笼锁被用来特异性刺激小细胞区室。在本研究中,我们证明了全细胞膜片钳和多页记载的方法HOTON钠成像在树突和中枢神经元的棘,结合对紫外光诱导的解笼锁谷氨酸,它允许谷氨酸受体在组织中的可靠和焦活化的改性过程。
本研究表明,SBFI非常适合在小细胞区室的细胞内钠瞬态双光子成像。它必须牢记,但是,SBFI的量子效率是相当低的15和相对变化的钠浓度是相当小的生理活性。因此, 钠离子瞬变精细工艺高分辨率测量是相对繁琐的任务,和分级的几次试验或平均化可能是必要的,以获得满意的信号。此外,钠的瞬变动力学是惊人的慢,使得它强制记录更长的时间内。这个观察对应于那些在早期的研究中,其中在神经元树突和星形胶质细胞钠瞬变单指数衰减,在室温下1,2,6其特征在于大的衰减时间常数在10秒的范围内。钠瞬变似乎从而发挥慢得多的时间合作URSE和更大的衰减时间常数相比,钙瞬变16。
抛开这些缺点,钠成像证明是神经元的子域生理特性的调查,一个有价值的工具。例如,钠成像可以用于在或接近活性突触并监控兴奋性突触活动。由于钠基本上没有缓冲8,17,活动引起的瞬态钠是线性相关的一系列突触谷氨酸释放或外源性应用谷氨酸。因此,他们代表神经元谷氨酸的活动直接和公正的指标。此外,钠指示剂染料表现出高K值d的(SBFI为其k d为25毫米范围1)。甚至在用于实现足够的亮度相对较高的细胞内的染料浓度(通常为0.5 – 1毫米)时,高K值d的暗示,染料本身不充当缓冲器š裂果。因此,他们不扭曲的钠瞬变幅度也不时程,这始终是一个问题时,钙敏感染料引入细胞18。因此,可以假设检测出的信号代表的胞内钠的“真实”的变化的良好量度。他们缓慢的时程则意味着速度为细胞内的扩散对钠的神经元比以前承担19小得多。
为成功执行实验针对的兴奋性突触传递和钠内流的途径进入棘和树突的性能的关键要求是突触结构的快速和高度本地化的活化诱导。这可以通过对谷氨酸或谷氨酸激动剂在脊柱的直接附近或枝状晶体通过笼化合物的闪光光解的快速和局部应用而得到。闪光光解不机械地按需分配GE的组织,是自由流动的文物,并确立对相关问题进行调查( 如本地钙信号)。的解笼锁点的直径是1.5微米,在xy平面上。解笼锁接近刺枝晶致钠信号在两个刺及家长枝蔓。而该信号往往是最大的最接近解笼锁点刺,在父枝晶的振幅和棘较远仍然非常类似于那些在解笼锁点的附近。解笼锁下进行300毫秒期间内向电流的幅值增加。在同一时间段出笼谷氨酸可能扩散到组织中,激活离子型谷氨酸受体和钠涌入对树突状区域和棘进一步远离解笼锁点。
在使用紫外线激光器通过细胞沐浴液投笼化合物光解时,会出现一个固有的问题是“内在的过滤”。因为保持器的高吸收率,UV光沿着从物镜到的刺激部位20,21的方式强烈地衰减。为了避免这一个可行的办法是局部灌注与只局限于刺激部位,这进一步减小所需的最小笼锁化合物的量的笼子。相比于紫外激光扫描介导的解笼锁,近红外双光子解笼锁22是空间上更精确,这主要是因为刺激的精度在z轴增加。另一方面,由于通常使用的笼子的如采用与双光子激发,或者以高浓度的笼形化合物的或非常高,则需要潜在的光毒性的光强度波长较长的小横截面。此外,双光子解笼锁就必须更高投资设备;在其他中,一个附加的红外激光加所需的光学元件,还需要。
既SBFI和MNI-谷氨酸是可激发的在相同的波长范围内。这可能会导致紫外线解笼锁激光和SBFI或红外激光成像和MNI-谷氨酸的非预期的相互依赖性,导致SBFI漂白的解笼锁闪光和/或谷氨酸的由红外线光束的连续解笼锁。然而, 如图6C所示 ,无论其本身也不多光子成像的UV闪光灯引起我们的实验条件下,这种相互影响。
类似于此处所描述的一种UV-闪光系统通常用于在许多其他实验室,并可以相对容易地被结合到任何现有的多光子成像显微镜。它提供了使激光束为光解可自由在视场定位的优点。此外,该系统使激光束的快速和自动的重新定位和释放体积,分别在视场中的实验过程中。欧ř修改简化和改进了的解笼锁点的准确定位,以使得成像软件的帧可用于同成分调整成像和解笼锁帧。
两者合计,全细胞膜片钳和多光子钠成像在树突和中枢神经元的棘,结合谷氨酸的紫外光诱导的解笼锁的变形过程中,使谷氨酸受体在组织中的可靠和焦活化。因此,它可以用来分析突触后信号钠兴奋性突触传递和性能的神经元在完整的组织。
The authors have nothing to disclose.
这项研究是由赠款德国科学基金会(DFG,Ro2327 / 6-1),以CRR作者要感谢南Durry和C罗德利哥专家技术援助和M.Dübbert(电子实验室,动物学研究所的支持,科隆大学,德国)在实施普克尔盒控制器和高频开关的帮助。
Hadrware/Software Component | Manufacturer | Type | Comment |
Borosilicate-glass capillaries | Hilgenberg | 1405059 | 75 mm x 2 mm, wall thickness 0.3 mm |
Camera | Jenoptik | ProgRes MF | IR-DIC compatible camera |
Deconvolution software | SVI | Huygens Pofessional X11 | |
Fiber optic spectrometer | Ocean Optics | USB 4000 | Miniature fiber optic spectrometer |
Filter tubes | VWR | cenrifugal filter, 0.2 µm | |
Imaging software | Olympus Europe | Flowview Ver 5.0c, Tiempo | |
IR beam power controller | Custom built | Laser beam intensity control + fast switch to zero on flyback via pockels cell | |
IR laser | SpectraPhysics | Mai-Tai VF-N1S | fs-pulsed Ti:Sa tunable laser (710-990 nm); CAUTION |
IR power monitor | Custom built | ||
Micromanipulator | Burleigh | PCS 5000 | |
Microscope/Imaging System | Olympus Europe | BX51WI/FV300 | Both, the microscope and the imaging systems were strongly modified |
ND filter wheel | Newport | 50Q04AV.2 | UV fused silica, optical density 0.05-2.0 |
Objective | Nikon Instruments Europe | NIR Apo 60x/1.0w | |
Patch clamp amplifier | HEKA | EPC-10 | |
Pipette puller | Narishige | Model PP-830 | |
Pneumatic drug ejection system | NPI Electronic | PDES-DXH | |
Pockels cell | Conoptics | 350-80 LA-BK | EOM, used as fast switch and for power adjustment |
Pockels cell driver | Conoptics | M302-RM | High voltage differential amplifier |
Shutter | Vincent Associates | LS6ZM2 | ALMgF2-coated BeCu blades |
Shutter controller | Custom built | ||
Shutter driver | Vincent Associates | Uniblitz VCM D1 | |
Slicer / Vibratome | Thermo Scientific | Microm HM 650 V | |
Uncaging software | Rapp OptoElectronic | UGA40 1.1.2.6 + NetCam | |
UV laser | Rapp OptoElectronic | DL-355/10 | cw DPSSL Laser, 355 nm; 10 mW; CAUTION |
UV laser scanning system | Rapp OptoElectronic | UGA 40 | Galvanometric scanning system |
Name of Compound | Catalog Number | Comments/Description | |
CNQX | Sigma Aldrich | C-127 | AMPA receptor antagonist; CAUTION |
DL-AP5 | Alfa Aesar | J64210 | NMDA receptor antagonist; CAUTION |
SBFI K+ Salt | Teflabs | OO32 | |
TTX | Ascent Scientific | Asc-055 | Inhibitor of voltage-dependent Na+ channels; CAUTION |
NMI-caged-L-Glutamate | Torcis | 1490 | Caged glutamatereleased upon UV absobtion |