Summary
We beschrijven de combinatie van focale UV-geïnduceerde foto-activatie van neuro-actieve verbindingen met whole-cell patch-clamp en multi-foton beeldvorming van intracellulaire natrium transiënten in dendrieten en de stekels van de hippocampus neuronen in acute weefsel plakjes van de hersenen van muizen.
Abstract
Multi-foton fluorescentie microscopie heeft de analyse van de morfologische en fysiologische parameters van hersencellen geactiveerd in het intacte weefsel met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie. Gecombineerd met elektrofysiologie, wordt het op grote schaal gebruikt om de werkzaamheid behorende calcium signalen studeren in kleine subcellulaire compartimenten zoals dendrieten en dendritische stekels. Naast calcium transiënten, synaptische activiteit induceert ook postsynaptische natrium signalen, waarvan de eigenschappen zijn slechts marginaal begrepen. Hier beschrijven we een werkwijze voor gecombineerde whole-cell patch-clamp en multi-foton natrium beeldvorming in cellulaire micro domeinen van centrale neuronen. Verder introduceren we een aangepaste procedure voor ultra-violet (UV)-licht-geïnduceerde uncaging van glutamaat, die betrouwbare en focale activering van glutamaat receptoren in het weefsel mogelijk maakt. Hiertoe werden whole-cell opnames uitgevoerd op Cornu Ammonis onderverdeling 1 (CA1) pyramidale neuronen in acute weefselplakjes van demuis hippocampus. Neuronen werden gevuld met de natrium-gevoelige fluorescente kleurstof SBFI door de patch-pipet, en multi-foton excitatie van SBFI kon de visualisatie van dendrieten en aangrenzende stekels. Om UV geïnduceerde focale uncaging stellen, werden verschillende parameters zoals lichtintensiteit, volume waarop de UV uncaging bundel positionering van de bundel en concentratie van gekooide verbinding getest en geoptimaliseerd. Onze resultaten tonen aan dat de lokale perfusie met gekooide glutamaat (MNI-glutamaat) en zijn brandpunt UV-uncaging resultaat in naar binnen stromen en natrium transiënten in dendrieten en stekels. Tijdsverloop en amplitude van zowel inkomende stromen en natrium signalen correleren met de duur van de puls uncaging. Bovendien tonen onze resultaten dat intracellulaire natrium signalen geblokkeerd in aanwezigheid van blokkers ionotrope glutamaatreceptoren, waaruit blijkt dat ze gemedieerd door natriuminstroom hoewel dit traject. Samengevat onze werkwijze verschaft een betrouwbaar middel voor hetonderzoek naar intracellulaire natrium signalen geïnduceerd door focale receptoractivering in intacte hersenweefsel.
Introduction
Recente verbeteringen in het licht microscopische technieken zoals multi-foton microscopie hebben de studie van de morfologische en fysiologische parameters van hersencellen geactiveerd in het intacte weefsel met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie. Gecombineerd met elektrofysiologie, zijn deze technieken nu op grote schaal gebruikt om de werkzaamheid behorende elektrische signalen op de neuronen, evenals gelijktijdig calcium signalen analyseren in kleine subcellulaire compartimenten, namelijk in fijne dendrieten en dendritische stekels. Naast calcium transiënten, synaptische activiteit induceert ook natrium signalen in dendrieten en stekels, waarvan de eigenschappen zijn nauwelijks onderzocht. Dergelijke signalen kunnen worden geanalyseerd door twee-foton beeldvorming van intracellulaire natrium ([Na +] i) die de on-line meting van [Na +] i transiënten gedurende langere tijd zonder significante kleurstofbleekoplossing of foto-beschadiging 1,2 maakt.
Voor de beeldvorming van [Na +] i bijvoorbeeld Corona Groen of Asante Natrium Green 3,4. De meest gebruikte fluorescente probe voor Na + imaging natriumvrij bindende benzofuran isoftalaat (SBFI). Het is een ratiometrische, UV-gegenereerde dye vergelijkbaar met de bekende calcium-gevoelige kleurstof fura-2 en is gebruikt voor conventionele Na + imaging in vele celtypen (bijvoorbeeld 5,6). Er zijn verschillende mogelijkheden van spannende de kleurstof en het verzamelen van de fluorescentie. Als een hoge temporele resolutie (dwz een hoge imaging framerate) is vereist in combinatie met ruimtelijke informatie, kan SBFI enthousiast met een xenon-booglamp of een high power light-emitting diode (LED)-apparaat en de emissie gedetecteerd met een hoge snelheid rekening gebracht -gekoppelde apparaat (CCD) camera 7,8. Voor maximale ruimtelijke resolutie diep in het weefsel, multi-foton laser scanning microscopie is de voorkeursmethode 9. De relatief lage quantum efficientie van SBFI vereist relatief hoge kleurstofconcentraties (0,5-2 mM) en direct laden van het membraan ondoorlaatbare vorm van SBFI via een scherpe micro-elektrode 10 of patch pipet 1.
Met behulp SBFI, eerder uitgevoerde werkzaamheden in acute weefsel plakjes van het knaagdier hippocampus aangetoond activiteitsgebonden natrium transiënten in dendrieten en stekels van CA1 pyramidale neuronen die vooral worden veroorzaakt door de instroom van natrium door ionotropische NMDA receptoren 1,2. Voor de studie van de eigenschappen van dergelijke lokale natrium signalen nader specifieke activatie van postsynaptische receptoren door toepassing van receptor agonisten is een zeer geschikt voorkeursmethode. Om presynaptische activiteit en zender vrijlating na te bootsen, moet de toepassing relatief kort zijn en gericht op de lokale stimulatie mogelijk te maken. Dit blijkt echter zeer uitdagend in het intacte weefsel zijn. Lokale druk toepassing van receptor agonisten met behulp van een fijne tip pipet maakt zeer centraal appassing, maar gastheer is van de mogelijke risico's voor de productie van beweging van de structuur van belang (bijvoorbeeld zoals een dendriet of dendritische stekels), en dus belemmert in hoge resolutie imaging. De geschiktheid van iontoforese van neuro-actieve stoffen hangt af van de elektrische eigenschappen en hoge stroom amplitudes kan cellulaire artefacten produceren ook.
Een manier om deze obstakels te omzeilen is de werkgelegenheid van de foto-actieve verbindingen en hun flitsfotolyse. In principe worden twee verschillende uitgangspunten gebruikt voor foto-activatie van gekooide stoffen: I) Wide-field flitsfotolyse 11 en II) focale uncaging gebruik scanning modules in combinatie met lasers 12. Terwijl wide-field flitsfotolyse wordt gebruikt om grotere gebieden plaats gebruiken, bijvoorbeeld een gehele cel, focale uncaging toegepast om specifiek stimuleren kleine cellulaire compartimenten. In deze studie demonstreren we een procedure voor whole-cell patch-clamp en multi-pHoton natrium beeldvorming in dendrieten en spines centrale neuronen, gecombineerd met een gemodificeerde procedure voor UV-licht geïnduceerde uncaging glutamaat, die betrouwbaar en focale activering van glutamaatreceptoren in het weefsel mogelijk maakt.
Protocol
Deze studie werd uitgevoerd in strikte overeenstemming met de institutionele richtlijnen van de Heinrich Heine Universiteit Düsseldorf, Duitsland, evenals de Europese Gemeenschap Richtlijn (86/609 / EEG) uitgevoerd. (: O52 / 05 institutionele act nummer) Alle experimenten werden bij de Animal Care en gebruik Facility van de Heinrich Heine Universiteit Düsseldorf, Duitsland meegedeeld aan en goedgekeurd door de Animal Welfare Office. In overeenstemming met de Duitse wet op de dierenbescherming (Tierschutzgesetz, zijn de artikelen 4 en 7), geen formele aanvullende goedkeuring voor de postmortale verwijdering van hersenweefsel was noodzakelijk.
Voor het genereren van acute plakjes werden muizen verdoofd met CO 2 en snel onthoofd (naar aanleiding van de aanbeveling van de Europese Commissie gepubliceerd in: euthanasie bij proefdieren, Luxemburg: Bureau voor officiële publicaties van de Europese Gemeenschappen, 1997 ISBN 92-827-9694 -9).
1 Bereiding vanOplossingen
- Bereid kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF) voor dissectie bevattende (in mM): 125 NaCl, 2,5 KCI, 0,5 CaCl2, 6 MgCl2, 1,25 NaH 2PO 4, 26 NaHCO3 en 20 glucose, geborreld met 95% O2 en 5% CO2, wat resulteert in een pH van 7,4.
- Bereid ACSF voor proeven bevatten (in mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 1,25 NaH 2PO 4, 26 NaHCO3 en 20 glucose, geborreld met 95% O2 en 5% CO2, resulterend in een pH van 7,4.
- Bereid intracellulaire oplossing (ICS) bevattende (in mM): 150 KMeSO 3, 12,5 hydroxyethyl piperazine-ethaansulfonzuur (HEPES), 40 KCl, 5 NaCl, 1,25 ethyleenglycol azijnzuur (EGTA), 5 Mg-ATP, 0,5 Na- GTP. Breng de pH op 7,3. WINKEL aliquots van 1 ml bij -20 ° C.
- Verdun-natrium binding benzofuraan isoftalaat (SBFI) -zout in dubbel-gedestilleerd water en porties van 5 ul bereidenvan een 10 mM voorraadoplossing.
- Ontdooi ICS en voeg SBFI stock oplossing bij een eindconcentratie van 1 mM. Vortex en micro-filtraat (0,22 pm). Bewaar bij 4 ° C tot gebruik in experiment. Niet opnieuw invriezen en alleen te gebruiken voor een dag.
- Bereid MNI glutamaat voorraad oplossing van 50 mM door het oplossen van de verbinding in dubbel gedestilleerd water. Verdun MNI glutamaat voorraadoplossing om een eindconcentratie van 5 mM in gewone ACSF. Bewaar bij 4 ° C tot gebruik in experiment. Niet opnieuw invriezen en alleen te gebruiken voor een dag. WINKEL aliquots, die niet direct worden gebruikt in het experiment, bij -20 ° C.
2 Dissectie van Tissue
OPMERKING: De voorbereiding van acute hippocampus plakjes van de hersenen van knaagdieren werd in detail beschreven eerder 13,14. In het kort werd het volgende protocol toegepast in deze studie.
- Na de onthoofding, snel verwijderen van de hersenen uit de schedel.
- Plaats onmiddellijk de hersenen in een petrischaalmet ijskoude ACSF dissectie en ontleden een halve bol door het uitvoeren van een sagittale snede langs de middellijn.
- Voer een tweede snede in de gewenste richting, zoals een blokkerende oppervlak en bevestig deze aan het uitsnijden van een vibratome met superlijm.
- Neem maaikamer en koelelement (beide bewaard bij -20 ° C) van de vibratome uit de vriezer en plaats snijden podium met sectie hersenen in de kamer. Dan zet koelelement in de kamer en dompel weefsel in ijskoud dissectie ACSF. Om het preparaat te stabiliseren, kan men willen het weefsel blok met agargel tegen.
- Snij 250 urn dik, parasagittal plakjes van de hippocampus met de vibratome. Zorg ervoor dat alle ACS vloeistoffen worden geborreld te allen tijde.
- Na snijden, houdt weefsel op een maas in een bekerglas met normale ACSF en incubeer bij 34 ° C gedurende 30 minuten. Dan houden bij kamertemperatuur.
3 Voorbereiding van de Hardware
Figuur 1 toont Schema lichtpaden en experimentele controle van de installatie bestaande uit multi-foton imaging, laser-scanning UV flitsfotolyse en elektrofysiologie. De multi-photon beam (rood) wordt geproduceerd door een gepulseerd, instelbare infrarood (IR) laser (TISA). Het geeft een mechanische sluiter, een Pockels 'cel en de IR detector (detectie van bundelintensiteit), die zelf te bedienen van het laservermogen en de duur van toediening. De flip-in / uitklapbare optionele laserdiode wordt toegepast voor basis uitlijning van de laserstraal. De bundel expander kan worden gebruikt in combinatie met doelen met een zeer brede rug-focal plane. De afstandsbediening ND filterwiel worden gebruikt naast of in plaats van de Pockels cel om laserbundel vermogensbesturing. Na het passeren van de scan hoofd, wordt de gepulseerde IR-licht geleid met het model. Uitstotented fluorescentie licht (licht groen) wordt verzameld, hetzij door de externe of de interne photomultiplier detectoren (PMT's). De externe detectoren worden volledig gesynchroniseerd met de interne PMT's via een hoge frequentie schakelaar (PMT-controller). De uncaging bundel (lichtblauw) wordt geproduceerd door een UV solid-state laser (DPSS UV-laser). Het wordt dan naar de galvo aangedreven aftasteenheid boven-achterzijde van de epi-fluorescentie koeler via een lichtgeleider. Dankzij de nauwkeurige positionering (chromatische aberratie tussen beeldvorming en uncaging straal) van de uncaging plek of het gebied wordt mogelijk gemaakt door het beeld uitvoer uit de beeldbewerkingssoftware. De timing management voor het synchroniseren van de beeldvorming, de elektrofysiologie en de flitsfotolyse wordt elektronisch geregeld. De transilluminatie detector (TL-PMT) is van de noodzaak om de documentatie van de positionering van de pipetten in het weefsel. De controle en de software van het beeldvormingssysteem, dat gemodificeerd is voor de bestrijding en synchroniseren alle apparatennoodzakelijk om het systeem in werking. Systeemcomponenten bestempeld als "op maat" werden ontworpen en gebouwd / aangepast door de auteurs. Sommige onderdelen werden aangepast aan de eisen van de aangepaste-build multi-foton-systeem te voldoen en worden aangeduid als "bewerkt". Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
- Schakel componenten van de multi-foton systeem. Testen en infrarode laserstraal uitlijning aanpassen.
- Controle van de laserstraal door flipping in de centrering prisma in plaats van een objectief. Als de balk wordt ontwricht, past het door de spiegels in de periscoop. Merk op dat de centrering vlak van het prisma moet op hetzelfde niveau als de achterkant brandvlak van het objectief tijdens beeldvorming.
- Schakel de spectrometer en controleren voor de multi-foton kenmerken van de bundel.
- Stel de parameters van de imaging-software op de volgende waarden: Kieseen frame van 512 x 512 pixels voor overzicht foto's van de cel (kleinere clip dozen met een zoomfactor van 2,5 voor hoge frame rate en hoge ruimtelijke resolutie, respectievelijk). Stel belichtingssnelheid om snel en scanmode te XYT. Z-stepping moet 1 micrometer voor overzicht stacks en 0,2 micrometer voor gedetailleerde stapels ruimtelijke bemonstering eisen voor deconvolution later uitgevoerd overeenkomen.
- Pas multi-foton laser (790 nm) intensiteit door het veranderen van de instellingen van de cel van de Pockels '(laatste kracht onder de doelstelling: ≈ 14 - 16 uW) en de foto-multipliers (PMT's).
- Schakelen en te kalibreren uncaging systeem door het plaatsen van een fluorescerende monster dia onder het objectief.
- Met behulp van de verrekijker, past u de focus van de UV-optica en ruimtelijk beperken de UV-laser spot tot een grootte van 2 micrometer in diameter aan de maximale door het gebruik van de focus-eenheid op de scan hoofd UGA.
- Start de kalibratie routine van de uncaging unit controle software.
- Zet de UV-laser een aantal punten binnen de scan range, terwijl de fluorescentie wordt vastgelegd met een CCD-camera. Door op de UV laser spot op elk punt, pas de positionering van de galvanische scan spiegels overeenkomend met een bepaald coördinaat in de software.
Figuur 2 Gedetailleerde schema ter illustratie van de kenmerken van excitatie, emissie en uncaging stralengangen. De IR excitatiebundel (rood) loopt de bundel combineren dichroïde spiegel op het niveau van de filer torentje in het epi-fluorescentie condensor van de microscoop en de doelstelling om bereiken het monster. De uncaging balk (blauw) wordt geleverd via een kwarts optische licht fiber to the collimatie en balk scherpsteleenheid en dan vervolgens geleid tot het scannen mirrors in de aftasteenheid, geeft een dichroïsche spiegel om de bundelsamenvoegende dichroïsche spiegel. Hier wordt gecombineerd met de excitatie aftastbundel. Het uitgezonden licht van het monster volgt het pad van de excitatie aftastbundel baan in omgekeerde oriëntatie op weg de beeldvormende scan. De camera wordt gebruikt voor de visuele controle van de patch pipet en positionering van de bundel uncaging in combinatie met de confocale laser scanning microscoop (niet getoond). Het groene lampje geeft pad een optionele epi-fluorescentie verlichting, die van het gebruik met andere toepassingen kunnen zijn.
- Gebruik de flitsfotolyse systeem in de spot modus om focale toepassingen krijgen. Zorg ervoor dat het brandpunt aanpassing van de uncaging bundel (gemiddeld vermogen onder de doelstelling: 0,55 mW) resulteert in een puntgrootte van 1,5 micrometer doorsnee (xy extensie) als geopenbaard in een fluorescent glijbaan geplaatst op een z-niveau dat overeenkomt met dat van a tissueslice (niet getoond).
- De nauwkeurige positionering van de uncaging spot wordt bereikt door de invoer van een beeld van het beeldvormingssysteem via een netwerkverbinding tussen uncaging- en imaging-computers.
- Met behulp van een screen grabber software, continu uitlezen van de frames van de imaging software (in plaats van de camera-feed) en de beeldvorming en uncaging frames congruent te passen. Exporteren elke 10e frame van de imaging-software als een referentie afbeelding in de flitser om de juiste afstelling te waarborgen gedurende het hele experiment.
Figuur 3 Aanpassing van de uncaging plaatse: Om precies te positioneren de uncaging plek, een screenshot van de imaging software (geel kader) wordt geïmporteerd in de uncaging software (groen kader). Hetlinker afbeelding binnen het gele kader is een Hi-Lo gecodeerde afbeelding (blauw: zwarte pixels, rood: verzadigd pixels) van de gehele CA1 pyramidale cel. Het beeld wordt bedekt door de kalibratie raster van de uncaging software (groen "X" s). Aan de rechterkant wordt een vergroot deel van de cel getoond met de overlay uncaging spot (rood kruis). De gele vlek is het automatisch overtrokken beeld van de uncaging balk. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
- Schakel micromanipulators, elektrofysiologie componenten, en de druk applicatie apparaat voor de levering van de gekooide verbinding naar het doelgebied.
- Installeer een centraal druk toepassing van het apparaat voor de lokale perfusie van gekooide verbindingen. Dit zal de kosten enorm verlagen vergeleken met bath perfusie van deze stoffen. Stel de druk die op de gegeven atmosferische druk tot een belemmering van AC voorkomenSF naar of een lekkage van gekooide stoffen uit de toepassing pipet.
OPMERKING: De druk applicatie apparaat herbergt een uiterst nauwkeurige en ultrasnelle micro-klep in de pipet houder. Dit maakt het mogelijk om een minimale druk van toepassing in dienst en dus vermindert de beweging artefacten tot een minimum tijdens de lokale perfusie met de gekooide verbinding. - Trek pipetten voor whole-cell patch-clamp en lokale perfusie met-het-vuren gepolijst borosilicaatglas haarvaten. Pipetten moeten een tip diameter van ~ 1 micrometer en een weerstand van R ≈ 3 MQ (waarden bepaald met K-meso 3 gebaseerde ICS).
- Plaats sneetje in de experimentele bad en maak hem vast met een raster (platina kader 250 um dik, overspannen met chirurgische filamenten, od 40 urn) (Figuur 4A, B). Gebruik een omgekeerde,-tip gebroken en vuur gepolijste Pasteur-pipet (zuigbal aan de zijkant van de gebroken punt) voor segment overdracht. Buig en alle andere agressieve behandeling van de snee.
- Plaats bad bij de microscoop podium en permanent perfuse slice met ACSF.
- Load patch pipet met ICS met SBFI en laad lokale perfusie pipet met gekooide verbinding. Bevestig pipetten aan overeenkomstige micromanipulators. Plaats referentie-elektrode in bad. Zorg ervoor dat u permanent zijn geaard om schade aan het hoofd podium (zie figuur 4C) te vermijden.
- Duw beide pipetten in bad en leg ze boven de hippocampus CA1 regio. Druk zachtjes aan patch pipet (40 mbar) tot verwatering van de ICS met ACSF voorkomen.
- Offset verrekenen potentieel van de patch pipet met de elektrofysiologie software.
- Benader een CA1 piramidale cel met patch pipet gebruik IR-DIC video microscopie. Solliciteer zachte zuigkracht tot een Giga-afdichting wordt verkregen. Kies een cel soma waarvan zich 30 -70 urn onder het oppervlak van het deel intact celmorfologie aan de ene kant en lage verstrooiing en demping van de uncaging balk aan de andere kant garanderen.
- Compenseren voor snelle capaciteit. Break membrane open cel whole-cell configuratie krijgen.
- Compenseer langzame capaciteit en serieweerstand.
- De zonnecel wordt gedialyseerd met SBFI-ICS gedurende ten minste 30 minuten voordat de beeldvorming experimenten.
- Tetrodotoxine (TTX, 500 nM) toe te voegen aan ACSF tot activatie van voltage-gated natriumkanalen en generatie van actiepotentialen te voorkomen.
- Visualiseren cellulaire morfologie met behulp van multi-foton excitatie en de daaruit voortvloeiende SBFI fluorescentie en kies een stekelige dendriet voor experiment. Zoom in voor beelden met een hogere resolutie en plaats een clip kader rond de dendriet.
- Vul een standaard patch pipet met 10 ul ACSF met gekooide glutamaat. Sluit de pipet om de druk applicatie systeem en bevestig deze aan de micromanipulator.
- Plaats pipet met gekooide verbinding bij dendriet (~ 30 urn). Plaats de pipet te latenefficiënte lokale perfusie van de dendriet van keuze. Pas de uncaging laser: plaats de uncaging plek dicht (~ 1 - 2 urn) de structuur van belang.
- Set regio's van de rente op de gekozen dendriet en aangrenzende stekels met beeldbewerkingssoftware.
- Benader de regio van belang en focaal injecteer de gekooide compound voor diverse sec met lage druk (<3 PSI). Start patch clamp en fluorescentie opnames (790 nm multi-foton excitatie) via triggersignaal.
OPMERKING: Tijdens de perfusie van de gekooide verbinding, wordt de excitatiebundel volledig gedimd tot bleken te voorkomen. - Stop lokale perfusie van de gekooide verbinding. Verhoog de intensiteit van de twee-foton laser om efficiënte excitatie van SBFI mogelijk te maken en een UV flash toepassing op uncaging (uncaging duur 300 msec) initialiseren.
- Monitor veranderingen in SBFI fluorescentie. De opname stoppen na SBFI fluorescentie terug naar de uitgangssituatie is hersteld.
- Om de betrokkenheid van ionotrope glutamaatreceptoren bij het genereren van de stroming en / of natrium signalen opgewekt door UV flitsfotolyse gekooide glutamaat testen dienst receptor blokkers.
- Switch to ACSF die de AMPA-receptor blocker cyano-nitrochinoxaline-dion (CNQX, 10 uM) en de NMDA-receptor blocker amino-phosphonopentanoate (APV, 50 uM) naast TTX (zie hierboven) en perfuseren slice minstens 10 min.
- Herhaal stimulatie procedure (zie 5.4 en 5.5.)
- Omkeerbaarheid van de effecten van de inhibitoren '
- Terug te schakelen naar de normale ACSF met alleen TTX.
- Perfuseren plak gedurende 20 minuten.
- Herhaal stimulatie procedure (zie 5.4 en 5.5.).
- Het opnemen van een XYZ-stack van de clip doos-regio set voor de uitgevoerde metingen. Zorg ervoor dat deze stack is oversampled ruimtelijk (ten minste 0,2 micrometer per pixel) om optimaal beeld deconvolution mogelijk te maken en om de beeldkwaliteit en de resolutie te verhogen.
- Neem een XYZ-stack van de gehele cel naar cel morfologie beoordelen.
- Run deconvolutie algoritme.
Figuur 4 Onderdelen van de experimentele bad en positionering van het bad in de microscoop stadium. (A) De experimentele bad bestaat uit het bad ovenkamer (blauw vierkant), omgeven door een magnetisch metalen ring. De slang zorgt voor een continue perfusie van het bad met zoutoplossing (ACSF). Het rooster naar beneden te houden en bevestig de slice wordt in het bad kamer gezet. (B) Acute slice voorbereiding gepositioneerd binnen de bad kamer. Het segment wordt vastgesteld door de draden van het rooster. (C) Plaatsing en geometrie van de experimentele bad bij de microscoop stadium tijdens de experimenten.
4 Whole-cell patch-klemmen
5 Multi-foton beeldvorming en stimulatie
Figuur 5 Experimenteel protocol. Om een experiment, een trigger puls (aangegeven door een rood teken (ᴨ) en de rode lijn) initialiseren is ingesteld om tegelijkertijd start de beeldvorming (blauw), de elektrofysiologie (groen) en de administratie van de gekooide Verbinding (geel) op tijdstip 0 sec. Tijdens deze eerste periode, moeten de beeldvorming balk volledig worden gedimd (lichtblauw). Na 4,5 sec (stippellijn), wordt de lokale doorbloeding van de gekooide verbinding beëindigd en de beeldvorming balk moet worden ingesteld op de werking intensiteit voor data-acquisitie (blauw). 1.5 sec later (tijdstip 6 seconden), een tweede trekker puls wordt gegeven (aangegeven met rood teken (ᴨ) en de rode lijn), die de UV flitser (duur van de flash initialiseert: 300 msec, aangeduid door de gele flash ) en stelt markers in de elektrofysiologie en de imaging protocol.
6 Farmacologie
7 morfologie
Representative Results
In de huidige studie, tonen we een procedure voor multi-foton microscopie van cellulaire natrium dynamiek met de natrium-afhankelijke fluorescerende kleurstof SBFI in CA1 piramidale neuronen van acute muis hippocampus weefsel plakjes. Bovendien laten we zien hoe deze beeldvormende techniek te combineren met laser-scanning-gebaseerde uncaging van neuro-actieve verbindingen (bijvoorbeeld gekooide glutamaat) en zijn precies richten en cellulaire micro-domeinen.
Laden met neuronen met SBFI via patch-pipet kon de visualisatie van de gehele cel inbegrip van fijne dendrieten en aangrenzende ruggengraten door gebruik multi-foton excitatie (Figuur 6A, B, D en figuur 7A).
Figuur 6 Natrium signalen en synaptische stromen geïnduceerd door flash fotolyse van gekooide glutamaat. (A) Maximal beeldprojectie van CA1 pyramidale neuron geladen met SBFI via de patch pipet (PP). De doos geeft het vergroot weergegeven in B. LP gebied geeft de positie en oriëntatie van de pipet voor de lokale perfusie van gekooide glutamaat. (B) Hoog vermogen maximale projectie van een stapel van optische onderdelen van een dendriet met aangrenzende dendritische stekels. De stapels van optische secties z-uitlijning en deconvolutie onderging. Het rode kruis geeft het doelgebied van de uncaging balk. De oranje stippellijn bakent het gebied van belang, waaruit de fluorescentie-emissie werd opgenomen. De doos geeft het getoonde gebied vergroot in D. (C) Links: Natrium signaal (bovenste rij) en somatische naar binnen lopende (onderste rij) veroorzaakt door flash fotolyse van gekooide glutamaat (aangegeven door gele flits). De rode lijn geeft een fit van de experimentele gegevens. Het grijze gebied representeert de periode waarin de uncaging flitser (300Hoge macht van de dendriet en aangrenzende: msec) belemmerd de beeldvorming van SBFI fluorescentie Rechts:. Zonder pre-perfusie met gekooide glutamaat, dezelfde UV-flash noch opgeroepen een verandering in SBFI emissie, noch een innerlijke stroom (D) links. stekels zoals afgebakend in B. Naast, hetzelfde beeld met omgekeerde grijswaarden. De stippellijnen geven de gebieden plaats waar de fluorescentie-emissie werd opgenomen. Het rode kruis geeft de lokalisatie van de uncaging balk rechts:. Sodium transiënten veroorzaakt door UV-flash fotolyse van gekooide glutamaat. Blauw trace: natrium signalen in de dendriet; rode trace: gemiddelde respons van drie stekels naast de uncaging plek; groene sporen: gemiddelde respons van drie verre stekels. Klik hier voor een grotere versie van deze figuur.
Na lokale perfusie met gekooideglutamaat, aanbrengen van een UV-flash nabij een dendriet resulteerde in een voorbijgaande daling van de fluorescentie emissie van SBFI als gevolg een verhoging van de intracellulaire natriumconcentratie (figuur 6C, D en figuur 7B). Tegelijkertijd werd een binnenwaartse stroom opgenomen in de soma (figuur 6C en figuur 7B). Het verhogen van de duur van de UV flash resulteerde in toenemende amplitudes van zowel de opgewekte naar binnen stromen en natrium signalen (data niet getoond), wat aangeeft dat het systeem goed binnen het dynamische bereik en dat noch uncaging of cellulaire responsen werden verzadigd. Toepassing van een UV-flits van identieke of een langere plakjes die niet waren vooraf geperfuseerd met gekooide glutamaat, niet opgewekt veranderingen in fluorescentie SBFI noch naar binnen stromen, wat aangeeft dat deze signalen door de uncaging glutamaat (figuur 6C). Bovendien tonen deze resultaten dat er geen onderlinge afhankelijkheid van imaging- en uncaging componenten waargenomen under onze experimentele omstandigheden. Natrium-signalen kunnen ook worden gedetecteerd in dendritische stekels (Figuur 6D). Terwijl wij niet proberen om de stimulatie van een enkele ruggengraat alleen met glutamaat uncaging bereiken, piekamplitudes neiging om iets hoger in stekels dicht bij de uncaging spot zijn, terwijl stekels verder weg toonde vrijwel identiek fluorescentie verandert naarmate het ouder dendriet (Figuur 6D).
Tot slot hebben we de route voor natrium influx in dendrieten en stekels in reactie op uncaging van glutamaat. Hiervoor gebruikten we CNQX en APV, die selectieve blokkers natrium-permeabel ionotrope glutamaatreceptoren van de AMPA- en NMDA-subtype, respectievelijk. Onze resultaten tonen aan dat glutamaat-geïnduceerde intracellulaire natrium signalen en de uitgelokte somatische stromingen werden weggelaten in de aanwezigheid van deze blokkers (Figuur 7B). Bij uitwassen van de blokkers worden de signalen weer. Dit toont that uncaging glutamaat activeert ionotrope glutamaatreceptoren op CA1 pyramidale neuronen, die de instroom van natrium bemiddelen in dendrieten en stekels, waardoor intracellulaire natrium transiënten en naar binnen stromen.
Figuur 7 farmacologische profiel van evoked natrium signalen en naar binnen stromen. (A)-SBFI gevulde CA1 pyramidale neuron met patch pipet (PP) gekoppeld aan de soma (B) Linker:. Natrium voorbijgaande en somatische stroom geïnduceerd door foto-activatie gekooide glutamaat in een dendriet gehecht stekels Center. Perfusie met de ionotrope glutamaat receptor blokkerende CNQX en APV remt zowel de natrium-signaal en de binnenwaartse stroom geïnduceerd door uncaging Rechts:. Bij wash-out van het blokkers worden de signalen hersteld. De rode lijn vertegents een fit van de experimentele gegevens. Het grijze gebied vertegenwoordigt de periode waarin de uncaging flash (300 msec) belemmerd de beeldvorming van SBFI fluorescentie. Klik hier voor een grotere versie van deze figuur.
Discussion
De onderhavige studie toont aan dat SBFI is geschikt voor twee-foton beeldvorming van intracellulaire natrium transiënten in kleine cellulaire compartimenten. Er moet in gedachten worden gehouden, echter, dat de kwantumefficiëntie van SBFI tamelijk laag 15 en relatieve veranderingen in de natriumconcentratie vrij klein met fysiologische activiteit. Aldus hoge resolutie metingen van Na + transiënten in fijne processen is een relatief vervelende taak en binning of middeling van meerdere studies noodzakelijk zijn om bevredigende signalen te verkrijgen. Bovendien, de kinetiek natrium overgangen zijn verrassend traag, waardoor het verplicht opnemen voor langere perioden. Deze waarneming komt overeen met die in eerdere studies, waarbij mono-exponentieel verval natrium transiënten in neuronale dendrieten en astrocyten werd gekenmerkt door grote verval tijdconstanten in het traject van 10 sec bij kamertemperatuur 1,2,6. Natrium transiënten lijken dus een veel langzamere tijd samen oefenenurse en veel grotere vervaltijd constanten vergeleken met calcium transiënten 16.
Natrium imaging gereserveerd deze nadelen, blijkt een waardevol instrument voor het onderzoek van fysiologische eigenschappen van neuronale subdomeinen zijn. Bijvoorbeeld kunnen natrium beeldvorming gebruikt voor de controle prikkelende synaptische activiteit op of nabij actieve synapsen. Omdat natrium wezen niet gebufferd 8,17, zijn natrium-activiteit geïnduceerd transiënten lineair gerelateerd aan diverse synaptische glutamaat afgifte of exogeen toegepaste glutamaat. Ze vertegenwoordigen dus directe en onpartijdige indicatoren van neuronale glutamaat activiteit. Bovendien natrium indicator kleurstoffen vertonen een hoge Kd's (SBFI K d in het traject van 25 mM 1). Zelfs bij relatief hoge intracellulaire concentraties kleurstof gebruikt om voldoende helder is (gewoonlijk 0,5-1 mM), hoge Kd's impliceren dat de kleurstoffen zelf niet dienen als buffers sodium. Bijgevolg zijn ze niet verstoren de amplitude noch tijdsverloop van natrium transiënten, dat is altijd een punt van zorg bij de calcium-gevoelige kleurstoffen worden ingevoerd in de cellen 18. Derhalve kan worden aangenomen dat de gedetecteerde signalen representeren een goede maat voor de "echte" veranderingen in intracellulaire natrium. Hun trage tijdsverloop impliceert dan dat de snelheid voor intracellulaire diffusie voor natrium in neuronen is veel kleiner dan eerder werd aangenomen 19.
Een essentieel vereiste voor het succesvol uitvoeren van proeven omtrent de eigenschappen van prikkelende synaptische transmissie en natriuminstroom trajecten in stekels en dendrieten is de inductie van een snelle en zeer lokale activatie van postsynaptische structuren. Dit kan worden verkregen door snelle en lokale afgifte van glutamaat of glutamaat agonisten in de directe nabijheid van een kern of een dendriet van de flitsfotolyse gekooide verbindingen. Flitsfotolyse niet mechanisch damage het weefsel, is vrij van bewegingsartefacten en is goed vastgesteld voor het onderzoek van verwante vragen (bijvoorbeeld plaatselijke calcium signalering). De diameter van de uncaging plek was 1,5 urn in het xy-vlak. Uncaging dicht bij een stekelige dendriet geïnduceerde natrium signalen in zowel de stekels en de ouder dendriet. Dat de signalen neiging grootste stekels dichtst bij de uncaging puntgrootte, de amplitudes in de bovenliggende dendriet en stekels verder nog tamelijk vergelijkbaar met die in de directe nabijheid van de uncaging spot. Uncaging werd gedurende 300 msec waarin actieve stromen toegenomen amplitude. Uncaged glutamaat zou hebben verspreid in het weefsel tijdens dezelfde periode activeren ionotrope glutamaatreceptoren en natriuminstroom op dendritische spines regio en verder weg van de uncaging plek.
Een intrinsiek probleem dat optreedt bij het gebruik van een UV laser fotolyse van gekooide verbindingen toegediend via cel badoplossingis 'innerlijke filtering'. Vanwege de hoge absorptie van de kooi, is UV licht sterk verzwakt langs de weg van het doel op de stimulatie plaats 20,21. Een geschikte manier om dit te vermijden is perfusie met de kooi die beperkt blijft tot de stimulatie site zijn bovendien vermindert de hoeveelheid gekooide verbinding nodig is om een minimum. Vergeleken met UV laser-scanning-gemedieerde uncaging, nabij-infrarood twee-foton uncaging 22 ruimtelijk nauwkeuriger, vooral omdat de nauwkeurigheid van de stimulatie verhoogd in de z-as. Anderzijds, door de kleine dwarsdoorsnede van gebruikelijke kooien voor langere golflengten zoals toegepast met twee-foton excitatie, hetzij een hoge concentratie van gekooide verbinding of zeer hoog zijn potentieel fototoxische lichtintensiteiten nodig. Ook twee-foton uncaging vereist een veel hogere investering in de apparatuur; oa extra IR laser plus de vereiste optische componenten nodig.
Zowel SBFI en MNI-glutamaat zijn prikkelbaar in de identieke golflengtegebied. Dit kan leiden tot een onbedoelde afhankelijkheid van UV uncaging laser en SBFI of IR imaging laser en MNI-glutamaat, waardoor bleken van SBFI de uncaging flash en / of continue uncaging van glutamaat door de infraroodstraal. Zoals getoond in figuur 6C, noch een UV flash zelf of multi foton imaging dergelijke wisselwerkingen onder onze experimentele omstandigheden veroorzaakt.
UV-flash systemen vergelijkbaar met die beschreven worden routinematig gebruikt in veel andere laboratoria en kunnen relatief gemakkelijk in een bestaande multi-foton imaging microscoop worden opgenomen. Dit biedt het voordeel dat de laserstraal voor fotolyse kan vrij in het gezichtsveld worden geplaatst. Bovendien laat het systeem een snelle en geautomatiseerde herpositionering van de laserbundel en het volume vrijgave, respectievelijk in het gezichtsveld tijdens een experiment. Our modificatie vereenvoudigt en verbetert de nauwkeurige positionering van de uncaging spot, zodat beelden van de imaging software kan dienen om beeldvorming en uncaging frames congruent passen.
Tezamen whole-cell patch-clamp en multi-foton natrium beeldvorming in dendrieten en spines centrale neuronen, gecombineerd met een gemodificeerde procedure voor UV-licht geïnduceerde uncaging glutamaat, een nauwkeurige en focale activering van glutamaatreceptoren in het weefsel. Derhalve kan dienen om de eigenschappen van prikkelende synaptische transmissie en postsynaptische natrium signalen analyseren neuronen in het intacte weefsel.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende belangen. De auteurs ontvingen financiële steun waarmee Open Access publicatie door Rapp opto-elektronische (Wedel, Duitsland), die een instrument dat gebruikt wordt in de video artikel oplevert. Het bedrijf was niet betrokken bij de experimenten, noch in de data handling en ook niet in het manuscript schrijven.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door een subsidie van de Duitse Science Foundation (DFG, Ro2327 / 6-1) aan CRR De auteurs willen S. Durry en C. Roderigo voor deskundige technische bijstand, en M. Dubbert (Elektronisch Laboratorium, Zoölogisch Instituut bedanken , Universiteit van Keulen, Duitsland) voor hulp bij de uitvoering van de Pockels cel controller en de HF-schakelaar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Borosilicate-glass capillaries | Hilgenberg | 1405059 | 75 x 2 mm, wall thickness 0.3 mm |
| Camera | Jenoptik | ProgRes MF | IR-DIC compatible camera |
| Deconvolution software | SVI | Huygens Pofessional X11 | |
| Fiber optic spectrometer | Ocean Optics | USB 4000 | Miniature fiber optic spectrometer |
| Filter tubes | VWR | cenrifugal filter, 0.2 µm | |
| Imaging software | Olympus Europe | Flowview Ver 5.0c, Tiempo | |
| IR beam power controller | Custom built | Laser beam intensity control + fast switch to zero on flyback via pockels cell | |
| IR laser | SpectraPhysics | Mai-Tai | fs-pulsed Ti:Sa tunable laser (710 - 990 nm); CAUTION |
| IR power monitor | Custom built | ||
| Micromanipulator | Burleigh | PCS 5000 | |
| Microscope/Imaging System | Olympus Europe | BX51WI/FV300 | Both, the microscope and the imaging systems were strongly modified |
| ND filter wheel | Newport | 50Q04AV.2 | UV fused silica, optical density 0.05 - 2.0 |
| Objective | Nikon Instruments Europe | NIR Apo 60x/1.0w | |
| Patch clamp amplifier | HEKA | EPC-10 | |
| Pipette puller | Narishige | Model PP-830 | |
| Pneumatic drug ejection system | NPI Electronic | PDES-DXH | |
| Pockels cell | Conoptics | 350-80 LA-BK | EOM, used as fast switch and for power adjustment |
| Pockels cell driver | Conoptics | M302-RM | High voltage differential amplifier |
| Shutter | Vincent Associates | LS6ZM2 | ALMgF2-coated BeCu blades |
| Shutter controller | Custom built | ||
| Shutter driver | Vincent Associates | Uniblitz VCM D1 | |
| Slicer/Vibratome | Thermo Scientific | Microm HM 650 V | |
| Uncaging software | Rapp OptoElectronic | UGA40 1.1.2.6 + NetCam | |
| UV laser | Rapp OptoElectronic | DL-355/10 | cw DPSSL Laser, 355 nm; 10 mW; CAUTION |
| UV laser scanning system | Rapp OptoElectronic | UGA 40 | Galvanometric scanning system |
| Name of Compound | Company | Catalog Number | Comments/ Description |
| CNQX | Sigma Aldrich | C-127 | AMPA receptor antagonist; CAUTION |
| DL-AP5 | Alfa Aesar | J64210 | NMDA receptor antagonist; CAUTION |
| SBFI K+ salt | Teflabs | OO32 | |
| TTX | Ascent Scientific | Asc-055 | Inhibitor of voltage-dependent Na+ channels; CAUTION |
| NMI-caged-L-Glutamate | Torcis | 1490 | Caged glutamate released upon UV absobtion |
References
- Rose, C. R., Kovalchuk, Y., Eilers, J., Konnerth, A. Two-photon Na+ imaging in spines and fine dendrites of central neurons. Pflueg. Arch., Eur. J. Phy. 439, 201-207 (1999).
- Rose, C. R., Konnerth, A. NMDA receptor-mediated Na+ signals in spines and dendrites. J. Neurosci. 21, 4207-4214 (2001).
- Meier, S. D., Kovalchuk, Y., Rose, C. R. Properties of the new fluorescent Na+ indicator CoroNa Green: comparison with SBFI and confocal Na+ imaging. J. Neurosci. Meth. 155, 251-259 (2006).
- Lamy, C., Chatton, J. Y. Optical probing of sodium dynamics in neurons and astrocytes. NeuroImage. 58, 572-578 (2011).
- Lasser-Ross, N., Ross, W. Imaging voltage and synaptically activated sodium transients in cerebellar Purkinje cells. Proc. Roy. Soc. B-Biol. Sci. 247, 35-39 (1992).
- Bennay, M., Langer, J., Meier, S. D., Kafitz, K. W., Rose, C. R. Sodium signals in cerebellar Purkinje neurons and Bergmann glial cells evoked by glutamatergic synaptic transmission. Glia. 56, 1138-1149 (2008).
- Baranauskas, G., David, Y., Fleidervish, I. Spatial mismatch between the Na+ flux and spike initiation in axon initial segment. Proc. Natl. Acad. Sci. 110, 4051-4056 (2013).
- Fleidervish, I., Lasser-Ross, N., Gutnick, M., Ross, W. Na+ imaging reveals little difference in action potential-evoked Na+ influx between axon and soma. Nat. Neurosci. , 852-860 (2010).
- Denk, W., Piston, D., Webb, W. Handbook of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. B. , Plenum Press. 445-458 (1995).
- Jaffe, D., et al. The spread of Na+ spikes determines the pattern of dendritic Ca2+ entry into hippocampal neurons. Nature. 357, 244-246 (1992).
- Boccaccio, A., Sagheddu, C., Menini, A. Flash photolysis of caged compounds in the cilia of olfactory sensory neurons. J. Vis. Exp. , (2011).
- Ikrar, T., Olivas, N., Shi, Y., Xu, X. Mapping inhibitory neuronal circuits by laser scanning photostimulation. J. Vis. Exp. , (2011).
- Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid. J. Vis. Exp. , (2011).
- Pannasch, U., Sibille, J., Rouach, N. Dual electrophysiological recordings of synaptically-evoked astroglial and neuronal responses in acute hippocampal slices. J. Vis. Exp. , (2012).
- Minta, A., Tsien, R. Fluorescent indicators for cytosolic sodium. J. Biol. Chem. 264, 19449-19457 (1989).
- Kuruma, A., Inoue, T., Mikoshiba, K. Dynamics of Ca(2+) and Na(+) in the dendrites of mouse cerebellar Purkinje cells evoked by parallel fibre stimulation. Eur. J. Neurosci. 18, 2677-2689 (2003).
- Despa, S., Bers, D. M. Na/K pump current and [Na](i) in rabbit ventricular myocytes: Local [Na](i) depletion and Na buffering. Biophys. 84, 4157-4166 (2003).
- Regehr, W., Tank, D. Calcium concentration dynamics produced by synaptic activation of CA1 hippocampal pyramidal cells. J. Neurosci. 12, 4202-4223 (1992).
- Kushmerick, M. J., Podolsky, R. J. Ionic mobility in muscle cells. Science. 166, 1297-1298 (1969).
- Palma-Cerda, F., et al. New caged neurotransmitter analogs selective for glutamate receptor sub-types based on methoxynitroindoline and nitrophenylethoxycarbonyl caging groups. Neuropharmacology. 63, 624-634 (2012).
- Trigo, F., Corrie, J., Ogden, D. Laser photolysis of caged compounds at 405 nm: photochemical advantages, localisation, phototoxicity and methods for calibration. J. Neurosci. Meth. 180, 9-21 (2009).
- Nikolenko, V., Peterka, D., Araya, R., Woodruff, A., Yuste, R. Spatial light modulator microscopy. Cold Spring Harbor protocols. , 1132-1141 (2013).
