אנו מתארים את השילוב של תמונה-הפעלה מושרה UV מוקד של תרכובות נוירו פעיל עם כל תא תיקון מהדק והדמיה רב פוטון של עוברי נתרן תאיים בדנדריטים ועמוד שדרה של תאי עצב בהיפוקמפוס בחתכי רקמה חריפים של מוח העכבר.
מיקרוסקופ פלואורסצנטי רב פוטון אפשר הניתוח של פרמטרים מורפולוגיים ופיסיולוגיים של תאים במוח ברקמות שלמות עם החלטת מרחב ובזמן גבוהה. בשילוב עם אלקטרופיזיולוגיה, זה נעשה שימוש נרחב ללמוד אותות סידן הקשורים לפעילות בתאי subcellular קטנים כגון דנדריטים וקוצים הדנדריטים. בנוסף לארעיים סידן, פעילות הסינפטית גם גורמת אותות נתרן postsynaptic, את המאפיינים שלו הם הבינו רק באופן שולי. כאן, אנו מתארים שיטה לתיקון מהדק בשילוב כל תא והדמיה נתרן רב פוטון בתחומים מיקרו סלולריים של נוירונים מרכזיים. יתר על כן, אנו מציגים הליך הותאם לאולטרה סגול (UV) משחררות רפרוף מושרה -light של גלוטמט, המאפשר הפעלה אמינה ומוקד של קולטני גלוטמט ברקמה. לשם כך, כל תא הקלטות בוצעו ביחידת משנה Cornu Ammonis 1 (CA1) נוירונים פירמידה בחתכי רקמה חריפים שלההיפוקמפוס עכבר. נוירונים היו מלאים בSBFI צבע פלואורסצנטי נתרן רגיש באמצעות התיקון-פיפטה, ועירור רב פוטונים של SBFI אפשר להדמיה של דנדריטים וקוצים סמוכים. להקים משחררות רפרוף מוקד מושרה UV, מספר פרמטרים ובכלל זה עוצמת אור, עוצמת קול מושפע מקורה משחררות רפרוף UV, מיצוב של הקרן, כמו גם ריכוז של המתחם בכלוב נבדקו ומותאמים. התוצאות שלנו מראות כי זלוף המקומי עם גלוטמט בכלוב (משרד התשתיות הלאומי-גלוטמט) ותוצאת UV-משחררות רפרוף המוקד שלה בזרמים פנימה וארעיים נתרן בדנדריטים ועמוד שדרה. כמובן זמן והמשרעת של שני זרמים פנימה ואותות נתרן לתאם עם משך דופק משחררות הרפרוף. יתר על כן, התוצאות שלנו מראות כי אותות נתרן תאיים חסומים בנוכחות חוסמי לionotropic קולטני גלוטמט, הוכחה כי הם מתווכים על ידי זרם נתרן למרות שמסלול זה. לסיכום, השיטה שלנו מספקת כלי אמין לחקירה של אותות נתרן תאיים הנגרמים על ידי הפעלת קולט מוקדי ברקמת המוח שלמה.
שיפורים שנעשה לאחרונה בטכניקות מיקרוסקופיות אור כגון מיקרוסקופיה רב הפוטון אפשרו המחקר של פרמטרים מורפולוגיים ופיסיולוגיים של תאים במוח ברקמות שלמות עם החלטת מרחב ובזמן גבוהה. בשילוב עם אלקטרופיזיולוגיה, טכניקות אלה נמצאים כעת בשימוש נרחב כדי לנתח אותות הקשורים לפעילות חשמליות בתאי עצב, כמו גם אותות סידן במקביל בתאי subcellular קטנים, כלומר בדנדריטים קנס וקוצים הדנדריטים. בנוסף לארעיים סידן, פעילות הסינפטית גם גורמת אותות נתרן בדנדריטים ועמוד שדרה, את המאפיינים שלו הם במידה רבה לא נחקרו. ניתן לנתח אותות אלה על ידי שני פוטונים הדמיה של נתרן תאיים ([Na +] i) המאפשרת המדידה של [Na +] אני ארעיים לתקופה ממושכת בלי הלבנת צבע משמעותית או צילום נזק 1,2 on-line.
להדמיה של [Na +] i </תת>, צבעי מחוון כימי רק כמה זמינים, למשל קורונה הירוקה לאסנטה נתרן הירוק 3,4. הבדיקה הניאון הנפוצה ביותר עבור Na + הדמיה היא isophthalate benzofuran (SBFI) מחייב נתרן. זה ratiometric, צבע UV-נרגש דומה לפורע-2 צבע סידן רגיש הידוע וכבר מועסק הדמיה Na + קונבנציונלית בסוגי תאים רבים (לדוגמא 5,6). ישנן אפשרויות שונות של מרגש הצבע ואיסוף הקרינה שלה. אם רזולוציה גבוהה זמנית (כלומר קצב פריימים גבוה הדמיה) נדרשת בשילוב עם מידע מרחבי, SBFI יכול להיות נרגש עם מנורת קשת קסנון או דיודה מכשיר בהספק גבוה פולטות אור (LED) ובפליטה שלה זוהתה עם תשלום במהירות גבוה מכשיר -coupled 7,8 (CCD) מצלמה. לרזולוציה מרחבית מקסימלי עמוקה ברקמה, מיקרוסקופיה סריקת לייזר רב פוטון היא שיטת הבחירה 9. Efficie הקוונטים הנמוך יחסיתncy של SBFI מחייב ריכוזים גבוהים יחסית צבע (0.5-2 מ"מ), וטעינה ישירה של צורת קרום בלתי חדיר של SBFI באמצעות חדה פיפטה microelectrode 10 או תיקון 1.
באמצעות SBFI, עבודה קודמת שבוצעה בחתכי רקמה חריפים של ההיפוקמפוס המכרסמים הראתה ארעיים נתרן הקשורים לפעילות בדנדריטים ועמוד שדרה של נוירונים הפירמידה CA1 שנגרמים בעיקר על ידי זרם של נתרן דרך ionotropic NMDA הקולטני 1,2. לצורך המחקר של המאפיינים של אותות נתרן מקומיים כגון בפירוט רב יותר, הפעלה ספציפית של קולטנים postsynaptic על ידי יישום של אגוניסטים לקולטן היא שיטה גם מתאימה-בחירה. כדי לחקות פעילות presynaptic ושחרור משדר, יישום צריך להיות קצר יחסית וממוקד כדי לאפשר גירוי מקומי. זה, עם זאת, מוכיח להיות די מאתגר ברקמה שלמה. יישום לחץ מקומי של אגוניסטים לקולטן באמצעות פיפטה דקה שקצהו מאפשר ap מאוד מוקדיקפול, אבל מארח את הסיכון הפוטנציאלי להפקת תנועה של המבנה של עניין (למשל כמו דנדריט או קוצים הדנדריטים), ובכך מעכב את ההדמיה ברזולוציה גבוהה. התאמתו של iontophoresis של חומרי נוירו פעיל תלויה בתכונות חשמליות שלהם ואמפליטודות נוכחית גבוהה עלולה לייצר חפצים סלולריים, כמו גם.
אחת דרכים לעקוף מכשולים אלה היא התעסוקה של תרכובות המופעלת תמונה וphotolysis הבזק שלהם. בעיקרון, שני עקרונות שונים המשמשים לצילום הפעלה של חומרים בכלוב: I) רחב בתחום הבזק photolysis 11 וII) משחררות רפרוף מוקד העסקת מודולים סריקה בשילוב עם לייזרים 12. בעוד photolysis הבזק רחב בתחום משמש להפעלת אזורים גדולים יותר של עניין, למשל כל תא, משחררות רפרוף מוקד מועסק כדי לעורר באופן ספציפי תאים סלולריים קטנים. במחקר הנוכחי אנו מדגימים הליך לכל תא תיקון מהדק ורב-pההדמיה hoton נתרן בדנדריטים ועמוד שדרה של תאי עצב מרכזיים, בשילוב עם הליך הותאם למשחררות רפרוף מושרה UV-האור של גלוטמט, המאפשר הפעלה אמינה ומוקד של קולטני גלוטמט ברקמה.
המחקר הנוכחי מראה כי SBFI הוא גם מתאים לשני פוטונים הדמיה של עוברי נתרן תאיים בתאים סלולריים קטנים. יש לה להיות כל הזמן לזכור, עם זאת, כי היעילות הקוונטית של SBFI היא נמוכים למדי 15 ויחסי שינויים בריכוז הנתרן הם די קטנים עם פעילות פיזיולוגית. לפיכך, מדידה ברזולוציה גבוהה של עוברי Na + בתהליכי קנס היא משימה יחסית משעממת, וbinning או מיצוע של מספר ניסויים שתידרש כדי להשיג אותות משביעות רצון. בנוסף, קינטיקה של עוברי נתרן היא איטית באופן מפתיע, מה שהופך את החובה להקליט לתקופות זמן ממושכות. תצפית זו מקבילה לאלה במחקרים קודמים, שבו ריקבון monoexponential של עוברי נתרן בדנדריטים עצביים ובהאסטרוציטים התאפיינו בקבועי זמן דעיכה גדולים בטווח של 10 שניות בטמפרטורת חדר 1,2,6. נראה ארעיים נתרן ובכך להפעיל שיתוף זמן הרבה יותר איטיurse וקבועי זמן דעיכה הרבה יותר גדולים בהשוואה לארעית סידן 16.
מניח בצד חסרונות אלה, הדמיה נתרן מוכיחה להיות כלי רב ערך לחקירת תכונות פיסיולוגיות של תחומי משנה עצביים. לדוגמא, הדמיה נתרן יכולה לשמש כדי לעקוב אחר פעילות הסינפטית מעוררת באו בסמוך לסינפסות פעילה. בגלל נתרן הוא בעצם לא נאגר 8,17, ארעיים נתרן מושרה פעילותם באופן ליניארי הקשורים למגוון רחב של שחרור גלוטמט הסינפטי או אקסוגני מיושם גלוטמט. הם מכאן מייצגים אינדיקטורים ישירים ובלתי משוחד של פעילות glutamatergic עצבית. יתר על כן, צבעי מחוון נתרן תערוכה של ד K הגבוה (ד K של SBFI הוא בטווח של 25 1 מ"מ). אפילו בריכוזי הצבע תאיים גבוהים יחסית המשמשים להשגת בהירות מספקת (בדרך כלל 0.5-1 מ"מ), ד הגבוה K של לרמוז כי הצבעים עצמם אינם פועלים כמאגרים ליםגנות. כתוצאה מכך, הם לא לעוות כמובן משרעת ולא זמן של עוברי נתרן, שהוא תמיד דאגה כאשר צבעי סידן רגיש הם הציגו לתוך התאים 18. מכאן ניתן להניח כי האותות שאותרו מייצגים מידה טובה של השינויים "האמיתיים" בנתרן תאיים. כמובן הזמן האיטי שלהם ואז משתמע כי המהירות לדיפוזיה תאית לנתרן בתאי עצב היא הרבה יותר קטנה מאשר להניח 19 בעבר.
דרישה קריטית עבור הביצוע המוצלח של ניסויים העוסקים במאפיינים של מסלולי הולכה וזרם נתרן הסינפטי מעוררים לתוך עמוד השדרה ודנדריטים היא האינדוקציה של הפעלה מהירה ומקומית מאוד של מבני postsynaptic. ניתן להשיג זאת על ידי יישום מהיר והמקומי של אגוניסטים גלוטמט או מונוסודיום בסביבה הישירה של עמוד השדרה או דנדריט ידי photolysis הבזק של תרכובות כלוב. photolysis פלאש עושה dama לא מכאניge הרקמות, ללא תשלום של חפצי תנועה ומבוסס היטב לחקירה של שאלות קשורות (למשל איתות סידן מקומית). הקוטר של נקודת משחררות הרפרוף היה 1.5 מיקרומטר בxy-המטוס. קרוב משחרר רפרוף לאותות נתרן דנדריט הקוצני מושרה בשני הקוצים ודנדריט ההורה. ואילו האותות נטו להיות הגדול ביותר בעמוד השדרה הקרוב ביותר למקום משחררות הרפרוף, אמפליטודות בדנדריט ההורה וקוצים רחוקים היו עדיין די דומות לאלו בסביבה ישירה של נקודת משחררות הרפרוף. משחרר רפרוף בוצע עבור 300 אלפיות השניים שבמהלכה זרמים פנימה גדלו במשרעת. גלוטמט שברחה מכלוב ייתכן שמתפזר ברקמות במהלך אותה תקופת הזמן, הפעלה מרוחקת יותר ממקום משחררות הרפרוף ionotropic קולטני גלוטמט וזרם נתרן באזורים וקוצים הדנדריטים.
בעיה מהותית שמתרחשת בעת שימוש בליזר UV לphotolysis של תרכובות כלוב מנוהלות באמצעות פתרון ים התאהוא 'סינון פנימי ". בגלל קצב הספיגה הגבוה של הכלוב, אור UV מוחלש מאוד לאורך הדרך מהמטרה לאתר הגירוי 20,21. דרך אפשרית על מנת להימנע ממצב זה היא זלוף המקומי עם הכלוב, כי היא מוגבלת רק לאתר הגירוי, אשר יתר על כן מקטין את הכמות של תרכובת בכלוב זקוקה למינימום. בהשוואה למשחררות רפרוף בתיווך לייזר סריקת UV, שני פוטונים כמעט אינפרא אדום 22 משחררות רפרוף הוא מרחבית מדויקת יותר, בעיקר בגלל הדיוק של הגירוי מוגבר בציר z. מצד השני, בשל החתך הקטן של כלובים נפוצים לאורכי גל ארוכים יותר כפי שהיא מתבצעת עם שני פוטונים עירור, או ריכוז גבוה של המתחם בכלוב או גבוה מאוד, יש צורך בעוצמות אור פוטנציאל phototoxic. כמו כן, משחררות רפרוף שני פוטונים מחייבים השקעה גבוהה בהרבה בציוד; בין השאר, לייזר נוסף IR בתוספת הרכיבים האופטיים הנדרשים, יש צורך.
SBFI ומשרד התשתיות הלאומי-גלוטמט שניהם להתרגש בטווח אורכי הגל הזהה. זה עלול להוביל לתלות הדדית לא מכוונת של לייזר UV משחררות רפרוף וSBFI או לייזר ההדמיה IR ומשרד התשתיות הלאומי, גלוטמט, וכתוצאה מכך הלבנת SBFI על ידי הבזק משחררות הרפרוף ו / או משחררות רפרוף רציפה של גלוטמט על ידי קרן IR. עם זאת, כפי שמוצג באיור 6 ג, לא פלאש UV על ידי עצמו ולא ההדמיה פוטון הרב נגרם שפעות גומלין כזה בתנאי הניסוי שלנו.
מערכות UV-פלאש דומים לזה שתואר כאן משמשות באופן שיגרתי בהרבה מעבדות אחרות ויכולות בקלות יחסית להיות משולבת בתוך כל מיקרוסקופ הדמיה רב פוטון הקיים. הוא מציע יתרון שקרן הלייזר לphotolysis ניתן למקם באופן חופשי בשדה הראייה. בנוסף, המערכת מאפשרת מיקום מחדש מהיר ואוטומטי של קרן הלייזר ואת שחרורו נפח, בהתאמה, בשדה הראייה במהלך ניסוי. Ouשינוי r מפשט ומשפר את המיקום מדויק של נקודת משחררות הרפרוף, כך שהמסגרות של תוכנת ההדמיה יכולות לשמש כדי להתאים מסגרות הדמיה ומשחררות רפרוף congruently.
יחדיו, כל תא תיקון מהדק והדמיה נתרן רב פוטון בדנדריטים ועמוד שדרה של תאי עצב מרכזיים, בשילוב עם הליך הותאם למשחררות רפרוף UV-induced אור של גלוטמט, מאפשר הפעלה אמינה ומוקד של קולטני גלוטמט ברקמה. וכך זה יכול לשמש כדי לנתח את המאפיינים של שידור סינפטי מעורר ושל אותות נתרן postsynaptic בתאי עצב ברקמה שלמה.
The authors have nothing to disclose.
מחקר זה נתמך על ידי מענק של הקרן הגרמנית למדע (DFG, Ro2327 / 6-1) לCRR המחברים מבקשים להודות ס Durry וג רודריגו לקבלת סיוע טכני מומחה, ומ 'Dübbert (אלקטרוניקה מעבדה, הזואולוגי מכון , האוניברסיטה של קלן, גרמניה) לעזרה ביישום בקר תא Pockels ומתג HF.
Hadrware/Software Component | Manufacturer | Type | Comment |
Borosilicate-glass capillaries | Hilgenberg | 1405059 | 75 mm x 2 mm, wall thickness 0.3 mm |
Camera | Jenoptik | ProgRes MF | IR-DIC compatible camera |
Deconvolution software | SVI | Huygens Pofessional X11 | |
Fiber optic spectrometer | Ocean Optics | USB 4000 | Miniature fiber optic spectrometer |
Filter tubes | VWR | cenrifugal filter, 0.2 µm | |
Imaging software | Olympus Europe | Flowview Ver 5.0c, Tiempo | |
IR beam power controller | Custom built | Laser beam intensity control + fast switch to zero on flyback via pockels cell | |
IR laser | SpectraPhysics | Mai-Tai VF-N1S | fs-pulsed Ti:Sa tunable laser (710-990 nm); CAUTION |
IR power monitor | Custom built | ||
Micromanipulator | Burleigh | PCS 5000 | |
Microscope/Imaging System | Olympus Europe | BX51WI/FV300 | Both, the microscope and the imaging systems were strongly modified |
ND filter wheel | Newport | 50Q04AV.2 | UV fused silica, optical density 0.05-2.0 |
Objective | Nikon Instruments Europe | NIR Apo 60x/1.0w | |
Patch clamp amplifier | HEKA | EPC-10 | |
Pipette puller | Narishige | Model PP-830 | |
Pneumatic drug ejection system | NPI Electronic | PDES-DXH | |
Pockels cell | Conoptics | 350-80 LA-BK | EOM, used as fast switch and for power adjustment |
Pockels cell driver | Conoptics | M302-RM | High voltage differential amplifier |
Shutter | Vincent Associates | LS6ZM2 | ALMgF2-coated BeCu blades |
Shutter controller | Custom built | ||
Shutter driver | Vincent Associates | Uniblitz VCM D1 | |
Slicer / Vibratome | Thermo Scientific | Microm HM 650 V | |
Uncaging software | Rapp OptoElectronic | UGA40 1.1.2.6 + NetCam | |
UV laser | Rapp OptoElectronic | DL-355/10 | cw DPSSL Laser, 355 nm; 10 mW; CAUTION |
UV laser scanning system | Rapp OptoElectronic | UGA 40 | Galvanometric scanning system |
Name of Compound | Catalog Number | Comments/Description | |
CNQX | Sigma Aldrich | C-127 | AMPA receptor antagonist; CAUTION |
DL-AP5 | Alfa Aesar | J64210 | NMDA receptor antagonist; CAUTION |
SBFI K+ Salt | Teflabs | OO32 | |
TTX | Ascent Scientific | Asc-055 | Inhibitor of voltage-dependent Na+ channels; CAUTION |
NMI-caged-L-Glutamate | Torcis | 1490 | Caged glutamatereleased upon UV absobtion |