Мы описания комбинации фокусным ультрафиолетовым излучением фото-активации нейро-активных соединений с цельноклеточной патч-зажим и мульти-Фотон изображений внутриклеточных переходных натрия в дендритов и шипиков нейронов гиппокампа в острых кусочков ткани мозга мыши.
Многофотонная флуоресцентной микроскопии позволило анализ морфологических и физиологических параметров клеток мозга в неповрежденной ткани с высоким пространственным и временным разрешением. В сочетании с электрофизиологии, он широко используется для изучения деятельностных сигналы кальция в небольших субклеточных отсеков, таких как дендритов и дендритных шипиков. В дополнение к переходных кальция, синаптической активности также вызывает постсинаптические сигналы натрия, свойства которых лишь незначительно понятны. Здесь мы опишем метод комбинированного цельноклеточная патч-зажим и визуализации многофотонной натрия в клеточных микро областях центральных нейронов. Кроме того, мы вводим модифицированный порядок ультрафиолетового (УФ) -light вызванной uncaging глутамата, что позволяет надежную и фокусное активацию рецепторов глутамата в тканях. С этой целью, цельноклеточные записи проводились на Корню Ammonis подразделения 1 (АК1) пирамидальных нейронов в острых кусочков тканигиппокамп мыши. Нейроны были наполнены SBFI флуоресцентным красителем натрия чувствительных через патч-пипетки, и многофотонное возбуждение SBFI включен визуализации дендритов и смежных шипами. Чтобы установить УФ-индуцированного фокусное uncaging, несколько параметров в том числе интенсивности света, объема, пострадавших от УФ uncaging луча, положения пучка, а также концентрации в клетке соединения были испытаны и оптимизированы. Наши результаты показывают, что местное кровоснабжение с клетке глутамата (MNI-глутамат) и его фокусное УФ-uncaging результат в внутрь токов и переходных натрия в дендритов и шипами. Время, конечно, и амплитуда токов как вовнутрь, так и сигналов натрия коррелирует с длительностью импульса uncaging. Кроме того, наши результаты показывают, что внутриклеточные сигналы, натриевые заблокированы в присутствии блокаторов для ионотропных глутаматных рецепторов, демонстрируя, что они опосредованы притока натрия, хотя этого пути. Таким образом, наш метод обеспечивает надежный инструмент дляИсследование внутриклеточных сигналов натрия, вызванных активацией рецептора фокальной в интактной ткани головного мозга.
Последние достижения в световой микроскопии методов, таких как многофотонной микроскопии позволили изучение морфологических и физиологических параметров клеток мозга в неповрежденной ткани с высоким пространственным и временным разрешением. В сочетании с электрофизиологии, эти методы в настоящее время широко используется для анализа деятельности, связанных электрических сигналов в нейронах, а также сопутствующих сигналов кальция в небольших субклеточных отсеков, а именно в мелких дендритов и дендритных шипиков. В дополнение к переходных кальция, синаптической активности также индуцирует сигналы натрия в дендритов и шипами, свойства которых в значительной степени неисследованными. Такие сигналы могут быть проанализированы двухфотонного визуализации внутриклеточного натрия ([Na +] I), который позволяет он-лайн измерение [Na +] Я переходных для длительных периодов времени без заметного обесцвечивания красителя или фото-повреждения 1,2.
Для визуализации [Na +] Я </суб>, только несколько красители химического индикатора доступны, например, короны Зеленый или Asante Натрий Зеленый 3,4. Наиболее часто используется флуоресцентного зонда для визуализации Na + является натрий-связывающий бензофурана изофталата (SBFI). Это ратиометрический, УФ-возбужденных краситель аналогично известному кальций-чувствительного красителя фура-2 и был использован для обычного изображения Na + во многих типах клеток (например, 5,6). Существуют различные возможности возбуждения красителя и сбора его флуоресценции. Если высоким временным разрешением (т.е. частота кадров высокой томография) требуется в сочетании с пространственной информацией, SBFI могут возбуждаться с ксеноновой дуговой лампы или высокой мощности светодиодной (LED) устройства и его излучения обнаруженного с высокой скоростью заряда -coupled (ПЗС) камеры 7,8. Для максимального пространственного разрешения глубоко в ткани, многофотонное лазерная сканирующая микроскопия является методом выбора 9. Относительно низкий квантовый efficieNCY из SBFI требует относительно высокие концентрации красителя (0,5 – 2 мм) и прямую загрузку с мембраной непроницаемой виде SBFI через резкого микроэлектрода 10 или патч-пипетки 1.
Использование SBFI, ранее выполненные работы в острых кусочков ткани грызунов гиппокампа показали деятельностных переходные натрия в дендритов и шипами CA1 пирамидальных нейронов, которые в основном вызванные притоком натрия через ионотропного NMDA рецепторов 1,2. Для изучения свойств таких местных сигналов натрия более подробно, удельная активация постсинаптических рецепторов путем применения агонистов рецептора представляет собой хорошо подходит метод выбора. Чтобы имитировать пресинаптическое активность и выделения медиатора, приложение должно быть относительно коротким и сосредоточены для разрешения локальных стимуляции. Это, однако, оказывается довольно сложной задачей в интактной ткани. Приложение Часовой давление агонистов рецептора с помощью пипетки с острым концом позволяет очень фокусное арпликация, но проходит потенциальный риск для получения движение структуре интерес (например, таких, как дендрита или дендритных шипов), и, таким образом, препятствует высокого разрешения изображений. Пригодность ионофореза нейро-активных веществ зависит от их электрических свойств и высокие амплитуды тока может производить сотовые артефакты, а также.
Один из способов обойти эти препятствия является применение фото-активированный соединений и их импульсного фотолиза. В принципе, два разных принципы используются для фото-активации в клетке веществ: I) Широкий поля импульсного фотолиза 11 и II) фокусное uncaging использованием модулей сканирования с лазерами на 12. Хотя широкого поля импульсного фотолиза используется для активации большие области, представляющие интерес, например, целая клетка, фокусное uncaging используется для специально стимулировать небольшие клеточные отсеков. В настоящем исследовании мы демонстрируем порядок цельноклеточная патч-зажим и мульти-рHoton изображений натрия в дендритов и шипов центральных нейронов, в сочетании с модифицированной процедуры для УФ-света, вызванного uncaging глутамата, который позволяет надежно и фокусное активации глутаматных рецепторов в ткани.
Настоящее исследование показывает, что SBFI хорошо подходит для двухфотонного визуализации внутриклеточных переходных натрия в малых сотовых отсеков. Следует иметь в виду, однако, что квантовая эффективность SBFI довольно низкие 15 и относительные изменения концентрации натрия довольно небольшие с физиологической активности. Таким образом, с высоким разрешением измерение Na + переходных процессов в тонких процессов является относительно трудоемкой задачей, и биннинг или усреднение нескольких испытаний необходимо получить удовлетворительные сигналы. Кроме того, кинетика переходных натрия удивительно медленно, что делает его обязательным для записи в течение длительных периодов времени. Это наблюдение соответствует тем в более ранних исследований, в которых моноэкспоненциален распад переходных натрия в нейрональных дендритов и в астроциты были характерны большие постоянные времени затухания в диапазоне от 10 сек при комнатной температуре в 1,2,6. Переходные натрия, таким образом, кажется, оказывают гораздо медленнее времени сотрудничестваUrse и гораздо более крупные временные распада константы как по сравнению с кальция переходных 16.
Отложите эти недостатки, изображений натрия оказывается ценным инструментом для исследования физиологических свойств нейронов поддоменов. Например, изображения натрия может служить для контроля возбуждающую синаптическую активность на уровне или близко к активных синапсов. Поскольку натрия, по существу, не сохраняются в буфере 8,17, активность индуцированной переходные натрия линейно связаны с широким диапазоном синаптической выпуска глутамата или экзогенно применяются глутамата. Они, следовательно, представляют собой прямые, беспристрастные показатели нейронов глутаматергической деятельности. Кроме того, индикатор натрия красители обладают высокой Уб 'ы (SBFI в Уб находится в диапазоне от 25 мм 1). Даже при относительно высоких концентрациях внутриклеточных красителей, используемых для достижения достаточной яркости (обычно 0,5 – 1 мм), высокой Уб 'ы подразумевает, что сами красители не действуют в качестве буферов для сOdium. Следовательно, они не искажают амплитуду, ни временной ход переходных натрия, который всегда является проблемой, когда кальция чувствительных красителей вводят в клетки 18. Таким образом, можно предположить, что обнаруженные сигналы представляют собой хорошую меру "реальных" изменения внутриклеточного натрия. Их медленное время, конечно, то означает, что скорость диффузии для внутриклеточного для натрия в нейронах значительно меньше, чем предполагалось ранее 19.
Важным условием для успешного проведения экспериментов, касающихся свойств возбуждающих синаптических передачи и притока натрия путей в колючки и дендритов является индукция быстрого и высоко локализованной активации постсинаптических структур. Это может быть получено быстро и местного применения глутамата или глутамата агонистов в непосредственной близости от позвоночника или дендритов по флэш-фотолиза клетке соединений. Импульсный фотолиз не механически DamaGE ткани, свободен от артефактов движения и хорошо известна за расследование связанных с этим вопросов (например, местную сигнализацию кальция). Диаметр uncaging месте был 1,5 мкм в плоскости ху. Uncaging близко к колючий дендритов индуцированных сигналов натрия в обоих шипами и родитель дендритов. В то время как сигналы, как правило, по величине в шипов, ближайших к месту uncaging, амплитуды в родительском дендрита и шипы еще дальше по-прежнему довольно близки к тем, в непосредственной близости от uncaging месте. Uncaging проводили в течение 300 мсек, в течение которого внутренние токи увеличению амплитуды. Uncaged глутамат, возможно, рассеянный в ткани в течение того же периода времени, активации ионотропных рецепторы глутамата и приток натрия на дендритных регионов и шипами дальше от uncaging месте.
Внутренняя проблема, которая возникает при использовании УФ лазер для фотолиза в клетке соединений, вводимых через клеточную растворе ванныявляется «внутренняя фильтрация». В связи с высокой скоростью поглощения клеткой, УФ-излучение ослабляется сильно по пути от объектива к стимуляции сайте 20,21. Еще один вероятный способ избежать этого является локальной перфузии с клеткой, ограниченной только на сайте стимуляции, которая, кроме того, уменьшается количество клетке соединения, необходимая к минимуму. По сравнению с УФ лазерного сканирования опосредованного uncaging, почти инфракрасного двухфотонного uncaging 22 пространственно точнее, в основном потому, что точность стимуляции увеличивается в оси. С другой стороны, в связи с небольшим поперечным сечением, обычно используемых клетках в течение более длинных волн, как работающих с двухфотонном возбуждении, либо высокая концентрация соединения в клетке или очень высокой, потенциально фототоксические интенсивности света необходимы. Кроме того, двухфотонная uncaging требует гораздо выше инвестиции в оборудование; среди прочего, дополнительный ИК лазер плюс обязательные оптические компоненты, необходимы.
Оба SBFI и MNI-глутамата в возбудимых в одинаковом диапазоне длин волн. Это может привести к непреднамеренной взаимозависимости УФ uncaging лазера и SBFI или лазера ИК изображений и MNI-глутамата, в результате отбеливания SBFI по uncaging вспышкой и / или непрерывном uncaging глутамата по ИК-луча. Однако, как показано на рисунке 6С, ни УФ вспышка сама по себе, ни мульти визуализации фотонов не вызвал таких взаимные эффекты в условиях нашего эксперимента.
УФ-флеш систем, подобные описанному здесь обычно используются во многих других лабораториях и может относительно легко быть включены в любой существующий мульти-Фотон изображений микроскопом. Это дает то преимущество, что лазерный луч для фотолиза может быть размещен свободно в поле зрения. Кроме того, система обеспечивает быстрый и автоматизированный изменение положения лазерного луча и объем выпуска, соответственно, в поле зрения во время эксперимента. OuR модификации упрощает и улучшает точность позиционирования uncaging месте, так, чтобы рамы обработки изображений может служить для регулировки изображений и uncaging кадров конгруэнтно.
Взятые вместе, цельноклеточная патч-зажим и визуализации многофотонной натрия в дендритов и шипов центральных нейронов, в сочетании с модифицированной процедуры для УФ-света, вызванного uncaging глутамата, позволяет надежно и фокусное активации глутаматных рецепторов в ткани. Он может, таким образом, служат для анализа свойств возбуждающей синаптической передачи и постсинаптических сигналов натрия в нейронах в неповрежденной ткани.
The authors have nothing to disclose.
Это исследование было поддержано грантом немецкого научного фонда (DFG, Ro2327 / 6-1), чтобы КПП Авторы выражают благодарность С. Durry и С. Родриго для экспертной технической помощи, и М. Dübbert (Electronics Laboratory, Зоологический институт , Кельнский университет, Германия) для помощи в осуществлении контроллер ячейки Поккельса и переключатель HF.
Hadrware/Software Component | Manufacturer | Type | Comment |
Borosilicate-glass capillaries | Hilgenberg | 1405059 | 75 mm x 2 mm, wall thickness 0.3 mm |
Camera | Jenoptik | ProgRes MF | IR-DIC compatible camera |
Deconvolution software | SVI | Huygens Pofessional X11 | |
Fiber optic spectrometer | Ocean Optics | USB 4000 | Miniature fiber optic spectrometer |
Filter tubes | VWR | cenrifugal filter, 0.2 µm | |
Imaging software | Olympus Europe | Flowview Ver 5.0c, Tiempo | |
IR beam power controller | Custom built | Laser beam intensity control + fast switch to zero on flyback via pockels cell | |
IR laser | SpectraPhysics | Mai-Tai VF-N1S | fs-pulsed Ti:Sa tunable laser (710-990 nm); CAUTION |
IR power monitor | Custom built | ||
Micromanipulator | Burleigh | PCS 5000 | |
Microscope/Imaging System | Olympus Europe | BX51WI/FV300 | Both, the microscope and the imaging systems were strongly modified |
ND filter wheel | Newport | 50Q04AV.2 | UV fused silica, optical density 0.05-2.0 |
Objective | Nikon Instruments Europe | NIR Apo 60x/1.0w | |
Patch clamp amplifier | HEKA | EPC-10 | |
Pipette puller | Narishige | Model PP-830 | |
Pneumatic drug ejection system | NPI Electronic | PDES-DXH | |
Pockels cell | Conoptics | 350-80 LA-BK | EOM, used as fast switch and for power adjustment |
Pockels cell driver | Conoptics | M302-RM | High voltage differential amplifier |
Shutter | Vincent Associates | LS6ZM2 | ALMgF2-coated BeCu blades |
Shutter controller | Custom built | ||
Shutter driver | Vincent Associates | Uniblitz VCM D1 | |
Slicer / Vibratome | Thermo Scientific | Microm HM 650 V | |
Uncaging software | Rapp OptoElectronic | UGA40 1.1.2.6 + NetCam | |
UV laser | Rapp OptoElectronic | DL-355/10 | cw DPSSL Laser, 355 nm; 10 mW; CAUTION |
UV laser scanning system | Rapp OptoElectronic | UGA 40 | Galvanometric scanning system |
Name of Compound | Catalog Number | Comments/Description | |
CNQX | Sigma Aldrich | C-127 | AMPA receptor antagonist; CAUTION |
DL-AP5 | Alfa Aesar | J64210 | NMDA receptor antagonist; CAUTION |
SBFI K+ Salt | Teflabs | OO32 | |
TTX | Ascent Scientific | Asc-055 | Inhibitor of voltage-dependent Na+ channels; CAUTION |
NMI-caged-L-Glutamate | Torcis | 1490 | Caged glutamatereleased upon UV absobtion |