وصفنا الجمع بين البؤري الناجم عن الأشعة فوق البنفسجية الصور تفعيل مركبات العصبية نشطة مع خلية كاملة التصحيح، المشبك والتصوير متعدد الفوتون من العابرين الصوديوم داخل الخلايا في التشعبات والعمود الفقري من الخلايا العصبية قرن آمون في شرائح الأنسجة الحادة للدماغ الفأر.
وقد مكن متعددة الفوتون مضان المجهري تحليل المعلمات المورفولوجية والفسيولوجية للخلايا الدماغ في أنسجة سليمة مع القرار المكانية والزمانية عالية. جنبا إلى جنب مع الكهربية، ويستخدم على نطاق واسع لدراسة اشارات الكالسيوم المتعلقة النشاط في مقصورات التحت خلوية صغيرة مثل التشعبات والعمود الفقري شجيري. بالإضافة إلى العابرين الكالسيوم، النشاط متشابك يدفع أيضا إشارات الصوديوم بعد المشبكي، خصائص التي تفهم بشكل هامشي فقط. هنا، نحن تصف طريقة لمجتمعة خلية كاملة التصحيح، المشبك ومتعدد الفوتون التصوير الصوديوم في المجالات الخلوية الصغيرة من الخلايا العصبية المركزية. وعلاوة على ذلك، ونحن نقدم إجراء تعديل لفوق البنفسجية (UV) uncaging خفيفة الناجم عن الغلوتامات، والذي يسمح موثوق بها وتفعيل التنسيق مستقبلات الغلوتامات في الأنسجة. ولهذه الغاية، أجريت تسجيلات خلية كاملة على كورنو آمون تقسيم 1 (CA1) الخلايا العصبية الهرمية في شرائح الأنسجة الحادة للالحصين الماوس. امتلأت الخلايا العصبية مع صبغة الفلورسنت SBFI الحساسة الصوديوم من خلال التصحيح، ماصة، ومتعدد الفوتون الإثارة من SBFI تمكين التصور من التشعبات والعمود الفقري المجاورة. لإنشاء uncaging البؤري الناجم عن الأشعة فوق البنفسجية، وجرى اختبار العديد من المعلمات بما في ذلك شدة الضوء، وحجم المتضررين من شعاع uncaging الأشعة فوق البنفسجية، وتحديد المواقع من الحزم وكذلك تركيز المركب في قفص والأمثل. نتائجنا تظهر ان نضح المحلي مع الغلوتامات قفص (MNI-الغلوتامات) والتنسيق نتيجة للأشعة فوق البنفسجية uncaging في تيارات الداخل والعابرين الصوديوم في التشعبات والعمود الفقري. بالطبع الوقت وسعة كل التيارات الداخل وإشارات الصوديوم ترتبط مع مدة نبض uncaging. وعلاوة على ذلك، تظهر نتائجنا أن الإشارات الصوديوم داخل الخلايا يتم حظر بحضور حاصرات مستقبلات الغلوتامات لionotropic، مما يدل على أنهم بوساطة تدفق الصوديوم على الرغم من هذا المسار. باختصار، يوفر طريقة لدينا أداة موثوقة لالتحقيق في إشارات الصوديوم داخل الخلايا الناجم عن تنشيط مستقبلات البؤري في أنسجة المخ سليمة.
وقد مكنت التحسينات الأخيرة في التقنيات المجهرية الخفيفة مثل متعدد الفوتون المجهري دراسة المعلمات المورفولوجية والفسيولوجية للخلايا الدماغ في أنسجة سليمة مع القرار المكانية والزمانية عالية. جنبا إلى جنب مع الكهربية، والآن تستخدم على نطاق واسع هذه التقنيات لتحليل الإشارات ذات الصلة النشاط الكهربائي في الخلايا العصبية وكذلك إشارات الكالسيوم مصاحبة في مقصورات التحت خلوية صغيرة، وبالتحديد في التشعبات الدقيقة والعمود الفقري شجيري. بالإضافة إلى العابرين الكالسيوم، النشاط متشابك يدفع أيضا إشارات الصوديوم في التشعبات والعمود الفقري، والخصائص التي هي غير مستكشفة إلى حد كبير. ويمكن تحليل هذه الإشارات بواسطة التصوير ثنائي الفوتون من الصوديوم داخل الخلايا ([نا +] ط) والتي تمكن القياس على الخط من [نا +] ط العابرين لفترات طويلة دون تبييض صبغة كبير أو الصور الضرر 1،2.
للتصوير من [نا +] ط </الفرعية>، ليست سوى عدد قليل من الأصباغ الكيميائية مؤشر المتاحة، مثل كورونا الأخضر أو الأخضر اشانتي الصوديوم 3،4. التحقيق الفلورسنت الأكثر استخداما لنا + التصوير هو isophthalate benzofuran (SBFI) ملزم الصوديوم. وهو ratiometric، الأشعة فوق البنفسجية صبغ متحمس مماثل لمعروفة الصبغة الحساسة للالكالسيوم FURA-2، وقد استخدمت لالتقليدي نا + التصوير في العديد من أنواع الخلايا (على سبيل المثال 5،6). هناك احتمالات مختلفة من المثير للصباغة وجمع مضان لها. إذا كان مطلوبا قرار زمنية عالية (أي معدل الإطار التصوير عالية) في تركيبة مع المعلومات المكانية، ويمكن SBFI تكون سعيدة مع مصباح زينون قوس أو عالية الطاقة الصمام الثنائي الباعثة للضوء (LED) وجهاز الكشف عن الانبعاثات ذات شحنة عالية السرعة -coupled جهاز (CCD) وكاميرا 7،8. عن القرار المكانية القصوى في عمق الأنسجة، والمسح الضوئي ليزر متعدد الفوتون المجهري هو الأسلوب المفضل 9. وefficie الكم منخفضة نسبياNCY من SBFI يتطلب تركيزات عالية نسبيا صبغ (0،5-2 ملم)، وتحميل مباشر من شكل غشاء كتيمة من SBFI عبر حادة مسرى مكروي 10 أو التصحيح ماصة 1.
باستخدام SBFI أظهر العمل في وقت سابق أجريت في شرائح الأنسجة الحادة للالحصين القوارض العابرين الصوديوم ذات الصلة النشاط في التشعبات والعمود الفقري من الخلايا العصبية CA1 الهرمية التي هي سبب رئيسي من تدفق الصوديوم من خلال ionotropic NMDA مستقبلات 1،2. لدراسة خصائص هذه الإشارات الصوديوم المحلية في مزيد من التفاصيل، وتفعيل محدد من المستقبلات بعد المشبكي بتطبيق منبهات مستقبلات هي طريقة مناسبة تماما في الاختيار. لتقليد النشاط قبل المشبكي وإطلاق الإرسال، يجب أن يكون تطبيق وجيزة نسبيا، وركز لتمكين التحفيز المحلي. هذا، ومع ذلك، يبرهن على أن تكون صعبة جدا في أنسجة سليمة. تطبيق الضغط المحلي للمنبهات مستقبلات باستخدام ماصة ذات الرؤوس غرامة تمكن ا ف ب البؤري جداالثني، ولكن يستضيف المخاطر المحتملة لإنتاج حركة هيكل الفائدة (على سبيل المثال مثل التغصنات أو العمود الفقري شجيري)، وبالتالي يعيق التصوير ذات الدقة العالية. مدى ملاءمة الرحلان الشاردي للمواد العصبية نشطة تعتمد على خصائصها الكهربائية وسعة الحالية المرتفعة قد تنتج القطع الأثرية الخلوية أيضا.
طريقة واحدة للتغلب على هذه العقبات هي توظيف المركبات تنشيط التحلل الضوئي للصور وفلاش بهم. أساسا، وتستخدم اثنين من مبادئ مختلفة عن الصور تفعيل المواد قفص: I) حقل واسع التحلل الضوئي فلاش 11 والثاني) uncaging البؤري توظيف وحدات المسح في تركيبة مع الليزر 12. في حين يستخدم واسعة المجال التحلل الضوئي فلاش لتنشيط مناطق أكبر من الفائدة، مثل خلية بأكملها، ويعمل uncaging البؤري لتحفيز تحديدا مقصورات الخلوية الصغيرة. في هذه الدراسة نظهر إجراء لخلية كاملة التصحيح، المشبك ومتعدد صالتصوير الصوديوم hoton في التشعبات والعمود الفقري من الخلايا العصبية المركزية، جنبا إلى جنب مع إجراء تعديل لالناجم عن الأشعة فوق البنفسجية ضوء uncaging الغلوتامات، والذي يسمح موثوق بها وتفعيل التنسيق مستقبلات الغلوتامات في الأنسجة.
وتظهر هذه الدراسة أن SBFI مناسب تماما لاثنين من الفوتون التصوير من العابرين الصوديوم داخل الخلايا في مقصورات الخلوية الصغيرة. لا بد من وضعها في الاعتبار، مع ذلك، أن كفاءة الكم من SBFI منخفضة نوعا ما 15 والنسبية تغييرات في تركيز الصوديوم صغيرة جدا مع النشاط الفسيولوجي. وبالتالي، عالية الدقة قياس نا + العابرين في عمليات الجميلة هو مهمة شاقة نسبيا، وbinning أو المتوسط من عدة محاكمات قد يكون من الضروري الحصول على إشارات مرضية. بالإضافة إلى ذلك، حركية العابرين الصوديوم بطيئة المستغرب، مما يجعلها واجبة لتسجيل لفترات زمنية ممتدة. هذه الملاحظة يتوافق مع تلك في الدراسات السابقة، حيث تميزت تسوس monoexponential العابرين الصوديوم في التشعبات العصبية والخلايا النجمية من الثوابت في الوقت تسوس كبيرة في حدود 10 ثانية في درجة حرارة الغرفة 1،2،6. هكذا يبدو العابرين الصوديوم لممارسة أبطأ بكثير الساعة شاركurse وأكبر من ذلك بكثير الثوابت الوقت تسوس بالمقارنة مع العابرين الكالسيوم 16.
تخصيص هذه العيوب، والتصوير الصوديوم يبرهن على أن تكون أداة قيمة للتحقيق في الخصائص الفيزيولوجية العصبية من النطاقات الفرعية. على سبيل المثال، يمكن التصوير الصوديوم يخدم لمراقبة نشاط متشابك مثير في أو بالقرب من نقاط الاشتباك العصبي نشطة. لأن الصوديوم أساسا لا مخزنة 8،17، العابرين الصوديوم الناجم عن النشاط ترتبط خطيا إلى مجموعة واسعة من الافراج عن الغلوتامات متشابك أو تطبيقها خارجيا الغلوتامات. وبالتالي فإنها تمثل المؤشرات المباشرة وغير متحيزة النشاط الجلوتامين العصبية. وعلاوة على ذلك، والأصباغ مؤشر الصوديوم تظهر ارتفاع K ل د (K د SBFI هو في حدود 25 ملي 1). حتى في تركيزات عالية نسبيا صبغ الخلايا المستخدمة لتحقيق سطوع كافية (عادة 0،5-1 ملم)، وارتفاع K 'د ق يعني أن الأصباغ أنفسهم لا تعمل كحواجز لقالكراهية. وبالتالي، فإنها لا تشوه بالطبع السعة ولا وقت العابرين الصوديوم، الذي هو دائما مصدر قلق عندما يتم إدخال الأصباغ الحساسة الكالسيوم في الخلايا 18. ومن ثم يمكن افتراض أن الكشف عن إشارات تمثل مقياسا جيدا للتغييرات "حقيقية" في الصوديوم داخل الخلايا. البطيء دوام ثم يعني أن سرعة الانتشار داخل الخلايا للالصوديوم في الخلايا العصبية هي أصغر بكثير مما كان يفترض سابقا 19.
وهناك شرط حاسم للتنفيذ الناجح من التجارب معالجة خصائص مثير متشابك انتقال وتدفق الصوديوم مسارات في العمود الفقري والتشعبات هو تحريض على تفعيل سريع وموضعي للغاية من الهياكل بعد المشبكي. هذا ويمكن الحصول على التطبيق السريع والمحلية من الغلوتامات أو الغلوتامات منبهات في المنطقة المجاورة مباشرة من العمود الفقري أو التغصنات قبل التحلل الضوئي فلاش من المركبات في قفص. فلاش التحلل الضوئي لا داما لا ميكانيكياجنرال الكتريك الأنسجة، خالية من القطع الأثرية الحركة وراسخة للتحقيق في المسائل ذات الصلة (مثل إشارات الكالسيوم المحلية). كان قطرها من 1.5 ميكرون uncaging بقعة في الطائرة س ص. على مقربة Uncaging إلى إشارات الصوديوم شائك يسببها التغصنات في كل من العمود الفقري والتغصنات الأم. في حين أن إشارات تميل إلى أن تكون أكبر في العمود الفقري الأقرب إلى بقعة uncaging، لا تزال السعات في التغصنات الأم والعمود الفقري وليس بعيدا مماثلة لتلك الموجودة في المناطق المجاورة مباشرة للبقعة uncaging. تم تنفيذ Uncaging ل300 ميللي ثانية خلالها زيادة في السعة التيارات الداخل. الغلوتامات Uncaged قد تنتشر في الأنسجة خلال نفس الفترة الزمنية، وتفعيل مستقبلات الغلوتامات ionotropic وتدفق الصوديوم في المناطق شجيري العمود الفقري وبعيدا عن بقعة uncaging.
مشكلة الجوهرية التي تحدث عند استخدام ليزر الأشعة فوق البنفسجية لالتحلل الضوئي للمركبات في قفص تدار من خلال حل الاستحمام خليةهو 'تصفية الداخلية. بسبب ارتفاع معدل امتصاص من القفص، والموهن ضوء الأشعة فوق البنفسجية بقوة على طول الطريق من الهدف الى الموقع التحفيز 20،21. وهناك طريقة ممكنة لتجنب ذلك هي نضح المحلي مع القفص الذي يقتصر فقط على الموقع التحفيز، مما يقلل كذلك كمية مركب قفص بحاجة إلى الحد الأدنى. بالمقارنة مع uncaging بوساطة الليزر المسح الضوئي للأشعة فوق البنفسجية، القريب من الأشعة تحت الحمراء ثنائي الفوتون uncaging 22 غير مكانيا أكثر دقة، وذلك بسبب دقة التحفيز هو زيادة في محور ض. من ناحية أخرى، وذلك بسبب شريحة صغيرة من أقفاص تستخدم عادة لأطوال موجية أطول كما يعمل مع اثنين من الفوتون الإثارة، إما على نسبة عالية من المركب قفص أو عالية للغاية، وهناك حاجة شدة الضوء يحتمل الضوئية. أيضا، واثنين من الفوتون uncaging يتطلب استثمارا أكبر بكثير في المعدات؛ من بين أمور أخرى، وهناك حاجة ليزر الأشعة تحت الحمراء إضافية بالإضافة إلى المكونات البصرية المطلوبة،.
كلا SBFI وMNI-الغلوتامات ومنفعل في نطاق الطول الموجي متطابقة. وهذا قد يؤدي إلى الاعتماد المتبادل غير مقصود من الأشعة فوق البنفسجية والليزر uncaging SBFI أو ليزر الأشعة تحت الحمراء والتصوير MNI-الغلوتامات، مما أدى إلى تبييض SBFI من قبل فلاش uncaging و / أو uncaging المستمر من الغلوتامات بواسطة شعاع الأشعة تحت الحمراء. لكن، وكما هو مبين في الشكل 6C، لا الأشعة فوق البنفسجية ومضة في حد ذاته ولا الفوتون التصوير متعددة تسبب هذه الآثار المتبادلة تحت ظروف تجريبية لدينا.
وتستخدم أنظمة الأشعة فوق البنفسجية فلاش مماثلة لتلك الموصوفة هنا بصورة روتينية في العديد من المختبرات الأخرى، ويمكن بسهولة نسبيا أن تدمج في أي المجهر التصوير متعدد الفوتون القائمة. فهو يقدم ميزة أن شعاع الليزر لالتحلل الضوئي يمكن وضعه بحرية في مجال الرؤية. وبالإضافة إلى ذلك، يسمح النظام لاعادة تموضع سريع والآلي من شعاع الليزر وحجم الإصدار، على التوالي، في مجال الرؤية أثناء التجربة. أويحييص التعديل يبسط ويحسن دقة تحديد المواقع من بقعة uncaging، بحيث إطارات من برامج التصوير يمكن أن تخدم لضبط الإطارات التصوير وuncaging بشكل متطابق.
أخذت معا، خلية كاملة التصحيح، المشبك ومتعدد الفوتون التصوير الصوديوم في التشعبات والعمود الفقري من الخلايا العصبية المركزية، جنبا إلى جنب مع إجراء تعديل للأشعة فوق البنفسجية التي يسببها الخفيف uncaging الغلوتامات، يسمح موثوقة وتفعيل التنسيق مستقبلات الغلوتامات في الأنسجة. وبالتالي فإنه يمكن أن تعمل على تحليل خصائص انتقال متشابك مثير والإشارات الصوديوم بعد المشبكي في الخلايا العصبية في أنسجة سليمة.
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذه الدراسة عن طريق منحة من المؤسسة الألمانية للعلوم (DFG، Ro2327 / 6-1) لمجلس طعون اللجوء الكتاب أود أن أشكر S. Durry وC. Roderigo للحصول على المساعدة الفنية من الخبراء، وM. Dübbert (مختبر الالكترونيات، معهد علم الحيوان ، جامعة كولونيا، ألمانيا) للمساعدة في تنفيذ وحدة تحكم خلية Pockels والتبديل HF.
Hadrware/Software Component | Manufacturer | Type | Comment |
Borosilicate-glass capillaries | Hilgenberg | 1405059 | 75 mm x 2 mm, wall thickness 0.3 mm |
Camera | Jenoptik | ProgRes MF | IR-DIC compatible camera |
Deconvolution software | SVI | Huygens Pofessional X11 | |
Fiber optic spectrometer | Ocean Optics | USB 4000 | Miniature fiber optic spectrometer |
Filter tubes | VWR | cenrifugal filter, 0.2 µm | |
Imaging software | Olympus Europe | Flowview Ver 5.0c, Tiempo | |
IR beam power controller | Custom built | Laser beam intensity control + fast switch to zero on flyback via pockels cell | |
IR laser | SpectraPhysics | Mai-Tai VF-N1S | fs-pulsed Ti:Sa tunable laser (710-990 nm); CAUTION |
IR power monitor | Custom built | ||
Micromanipulator | Burleigh | PCS 5000 | |
Microscope/Imaging System | Olympus Europe | BX51WI/FV300 | Both, the microscope and the imaging systems were strongly modified |
ND filter wheel | Newport | 50Q04AV.2 | UV fused silica, optical density 0.05-2.0 |
Objective | Nikon Instruments Europe | NIR Apo 60x/1.0w | |
Patch clamp amplifier | HEKA | EPC-10 | |
Pipette puller | Narishige | Model PP-830 | |
Pneumatic drug ejection system | NPI Electronic | PDES-DXH | |
Pockels cell | Conoptics | 350-80 LA-BK | EOM, used as fast switch and for power adjustment |
Pockels cell driver | Conoptics | M302-RM | High voltage differential amplifier |
Shutter | Vincent Associates | LS6ZM2 | ALMgF2-coated BeCu blades |
Shutter controller | Custom built | ||
Shutter driver | Vincent Associates | Uniblitz VCM D1 | |
Slicer / Vibratome | Thermo Scientific | Microm HM 650 V | |
Uncaging software | Rapp OptoElectronic | UGA40 1.1.2.6 + NetCam | |
UV laser | Rapp OptoElectronic | DL-355/10 | cw DPSSL Laser, 355 nm; 10 mW; CAUTION |
UV laser scanning system | Rapp OptoElectronic | UGA 40 | Galvanometric scanning system |
Name of Compound | Catalog Number | Comments/Description | |
CNQX | Sigma Aldrich | C-127 | AMPA receptor antagonist; CAUTION |
DL-AP5 | Alfa Aesar | J64210 | NMDA receptor antagonist; CAUTION |
SBFI K+ Salt | Teflabs | OO32 | |
TTX | Ascent Scientific | Asc-055 | Inhibitor of voltage-dependent Na+ channels; CAUTION |
NMI-caged-L-Glutamate | Torcis | 1490 | Caged glutamatereleased upon UV absobtion |