We beschrijven de combinatie van focale UV-geïnduceerde foto-activatie van neuro-actieve verbindingen met whole-cell patch-clamp en multi-foton beeldvorming van intracellulaire natrium transiënten in dendrieten en de stekels van de hippocampus neuronen in acute weefsel plakjes van de hersenen van muizen.
Multi-foton fluorescentie microscopie heeft de analyse van de morfologische en fysiologische parameters van hersencellen geactiveerd in het intacte weefsel met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie. Gecombineerd met elektrofysiologie, wordt het op grote schaal gebruikt om de werkzaamheid behorende calcium signalen studeren in kleine subcellulaire compartimenten zoals dendrieten en dendritische stekels. Naast calcium transiënten, synaptische activiteit induceert ook postsynaptische natrium signalen, waarvan de eigenschappen zijn slechts marginaal begrepen. Hier beschrijven we een werkwijze voor gecombineerde whole-cell patch-clamp en multi-foton natrium beeldvorming in cellulaire micro domeinen van centrale neuronen. Verder introduceren we een aangepaste procedure voor ultra-violet (UV)-licht-geïnduceerde uncaging van glutamaat, die betrouwbare en focale activering van glutamaat receptoren in het weefsel mogelijk maakt. Hiertoe werden whole-cell opnames uitgevoerd op Cornu Ammonis onderverdeling 1 (CA1) pyramidale neuronen in acute weefselplakjes van demuis hippocampus. Neuronen werden gevuld met de natrium-gevoelige fluorescente kleurstof SBFI door de patch-pipet, en multi-foton excitatie van SBFI kon de visualisatie van dendrieten en aangrenzende stekels. Om UV geïnduceerde focale uncaging stellen, werden verschillende parameters zoals lichtintensiteit, volume waarop de UV uncaging bundel positionering van de bundel en concentratie van gekooide verbinding getest en geoptimaliseerd. Onze resultaten tonen aan dat de lokale perfusie met gekooide glutamaat (MNI-glutamaat) en zijn brandpunt UV-uncaging resultaat in naar binnen stromen en natrium transiënten in dendrieten en stekels. Tijdsverloop en amplitude van zowel inkomende stromen en natrium signalen correleren met de duur van de puls uncaging. Bovendien tonen onze resultaten dat intracellulaire natrium signalen geblokkeerd in aanwezigheid van blokkers ionotrope glutamaatreceptoren, waaruit blijkt dat ze gemedieerd door natriuminstroom hoewel dit traject. Samengevat onze werkwijze verschaft een betrouwbaar middel voor hetonderzoek naar intracellulaire natrium signalen geïnduceerd door focale receptoractivering in intacte hersenweefsel.
Recente verbeteringen in het licht microscopische technieken zoals multi-foton microscopie hebben de studie van de morfologische en fysiologische parameters van hersencellen geactiveerd in het intacte weefsel met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie. Gecombineerd met elektrofysiologie, zijn deze technieken nu op grote schaal gebruikt om de werkzaamheid behorende elektrische signalen op de neuronen, evenals gelijktijdig calcium signalen analyseren in kleine subcellulaire compartimenten, namelijk in fijne dendrieten en dendritische stekels. Naast calcium transiënten, synaptische activiteit induceert ook natrium signalen in dendrieten en stekels, waarvan de eigenschappen zijn nauwelijks onderzocht. Dergelijke signalen kunnen worden geanalyseerd door twee-foton beeldvorming van intracellulaire natrium ([Na +] i) die de on-line meting van [Na +] i transiënten gedurende langere tijd zonder significante kleurstofbleekoplossing of foto-beschadiging 1,2 maakt.
Voor de beeldvorming van [Na +] i </sub>, op slechts een paar chemische indicator kleurstoffen zijn beschikbaar, bijvoorbeeld Corona Groen of Asante Natrium Green 3,4. De meest gebruikte fluorescente probe voor Na + imaging natriumvrij bindende benzofuran isoftalaat (SBFI). Het is een ratiometrische, UV-gegenereerde dye vergelijkbaar met de bekende calcium-gevoelige kleurstof fura-2 en is gebruikt voor conventionele Na + imaging in vele celtypen (bijvoorbeeld 5,6). Er zijn verschillende mogelijkheden van spannende de kleurstof en het verzamelen van de fluorescentie. Als een hoge temporele resolutie (dwz een hoge imaging framerate) is vereist in combinatie met ruimtelijke informatie, kan SBFI enthousiast met een xenon-booglamp of een high power light-emitting diode (LED)-apparaat en de emissie gedetecteerd met een hoge snelheid rekening gebracht -gekoppelde apparaat (CCD) camera 7,8. Voor maximale ruimtelijke resolutie diep in het weefsel, multi-foton laser scanning microscopie is de voorkeursmethode 9. De relatief lage quantum efficientie van SBFI vereist relatief hoge kleurstofconcentraties (0,5-2 mM) en direct laden van het membraan ondoorlaatbare vorm van SBFI via een scherpe micro-elektrode 10 of patch pipet 1.
Met behulp SBFI, eerder uitgevoerde werkzaamheden in acute weefsel plakjes van het knaagdier hippocampus aangetoond activiteitsgebonden natrium transiënten in dendrieten en stekels van CA1 pyramidale neuronen die vooral worden veroorzaakt door de instroom van natrium door ionotropische NMDA receptoren 1,2. Voor de studie van de eigenschappen van dergelijke lokale natrium signalen nader specifieke activatie van postsynaptische receptoren door toepassing van receptor agonisten is een zeer geschikt voorkeursmethode. Om presynaptische activiteit en zender vrijlating na te bootsen, moet de toepassing relatief kort zijn en gericht op de lokale stimulatie mogelijk te maken. Dit blijkt echter zeer uitdagend in het intacte weefsel zijn. Lokale druk toepassing van receptor agonisten met behulp van een fijne tip pipet maakt zeer centraal appassing, maar gastheer is van de mogelijke risico's voor de productie van beweging van de structuur van belang (bijvoorbeeld zoals een dendriet of dendritische stekels), en dus belemmert in hoge resolutie imaging. De geschiktheid van iontoforese van neuro-actieve stoffen hangt af van de elektrische eigenschappen en hoge stroom amplitudes kan cellulaire artefacten produceren ook.
Een manier om deze obstakels te omzeilen is de werkgelegenheid van de foto-actieve verbindingen en hun flitsfotolyse. In principe worden twee verschillende uitgangspunten gebruikt voor foto-activatie van gekooide stoffen: I) Wide-field flitsfotolyse 11 en II) focale uncaging gebruik scanning modules in combinatie met lasers 12. Terwijl wide-field flitsfotolyse wordt gebruikt om grotere gebieden plaats gebruiken, bijvoorbeeld een gehele cel, focale uncaging toegepast om specifiek stimuleren kleine cellulaire compartimenten. In deze studie demonstreren we een procedure voor whole-cell patch-clamp en multi-pHoton natrium beeldvorming in dendrieten en spines centrale neuronen, gecombineerd met een gemodificeerde procedure voor UV-licht geïnduceerde uncaging glutamaat, die betrouwbaar en focale activering van glutamaatreceptoren in het weefsel mogelijk maakt.
De onderhavige studie toont aan dat SBFI is geschikt voor twee-foton beeldvorming van intracellulaire natrium transiënten in kleine cellulaire compartimenten. Er moet in gedachten worden gehouden, echter, dat de kwantumefficiëntie van SBFI tamelijk laag 15 en relatieve veranderingen in de natriumconcentratie vrij klein met fysiologische activiteit. Aldus hoge resolutie metingen van Na + transiënten in fijne processen is een relatief vervelende taak en binning of middeling van meerdere studies noodzakelijk zijn om bevredigende signalen te verkrijgen. Bovendien, de kinetiek natrium overgangen zijn verrassend traag, waardoor het verplicht opnemen voor langere perioden. Deze waarneming komt overeen met die in eerdere studies, waarbij mono-exponentieel verval natrium transiënten in neuronale dendrieten en astrocyten werd gekenmerkt door grote verval tijdconstanten in het traject van 10 sec bij kamertemperatuur 1,2,6. Natrium transiënten lijken dus een veel langzamere tijd samen oefenenurse en veel grotere vervaltijd constanten vergeleken met calcium transiënten 16.
Natrium imaging gereserveerd deze nadelen, blijkt een waardevol instrument voor het onderzoek van fysiologische eigenschappen van neuronale subdomeinen zijn. Bijvoorbeeld kunnen natrium beeldvorming gebruikt voor de controle prikkelende synaptische activiteit op of nabij actieve synapsen. Omdat natrium wezen niet gebufferd 8,17, zijn natrium-activiteit geïnduceerd transiënten lineair gerelateerd aan diverse synaptische glutamaat afgifte of exogeen toegepaste glutamaat. Ze vertegenwoordigen dus directe en onpartijdige indicatoren van neuronale glutamaat activiteit. Bovendien natrium indicator kleurstoffen vertonen een hoge Kd's (SBFI K d in het traject van 25 mM 1). Zelfs bij relatief hoge intracellulaire concentraties kleurstof gebruikt om voldoende helder is (gewoonlijk 0,5-1 mM), hoge Kd's impliceren dat de kleurstoffen zelf niet dienen als buffers sodium. Bijgevolg zijn ze niet verstoren de amplitude noch tijdsverloop van natrium transiënten, dat is altijd een punt van zorg bij de calcium-gevoelige kleurstoffen worden ingevoerd in de cellen 18. Derhalve kan worden aangenomen dat de gedetecteerde signalen representeren een goede maat voor de "echte" veranderingen in intracellulaire natrium. Hun trage tijdsverloop impliceert dan dat de snelheid voor intracellulaire diffusie voor natrium in neuronen is veel kleiner dan eerder werd aangenomen 19.
Een essentieel vereiste voor het succesvol uitvoeren van proeven omtrent de eigenschappen van prikkelende synaptische transmissie en natriuminstroom trajecten in stekels en dendrieten is de inductie van een snelle en zeer lokale activatie van postsynaptische structuren. Dit kan worden verkregen door snelle en lokale afgifte van glutamaat of glutamaat agonisten in de directe nabijheid van een kern of een dendriet van de flitsfotolyse gekooide verbindingen. Flitsfotolyse niet mechanisch damage het weefsel, is vrij van bewegingsartefacten en is goed vastgesteld voor het onderzoek van verwante vragen (bijvoorbeeld plaatselijke calcium signalering). De diameter van de uncaging plek was 1,5 urn in het xy-vlak. Uncaging dicht bij een stekelige dendriet geïnduceerde natrium signalen in zowel de stekels en de ouder dendriet. Dat de signalen neiging grootste stekels dichtst bij de uncaging puntgrootte, de amplitudes in de bovenliggende dendriet en stekels verder nog tamelijk vergelijkbaar met die in de directe nabijheid van de uncaging spot. Uncaging werd gedurende 300 msec waarin actieve stromen toegenomen amplitude. Uncaged glutamaat zou hebben verspreid in het weefsel tijdens dezelfde periode activeren ionotrope glutamaatreceptoren en natriuminstroom op dendritische spines regio en verder weg van de uncaging plek.
Een intrinsiek probleem dat optreedt bij het gebruik van een UV laser fotolyse van gekooide verbindingen toegediend via cel badoplossingis 'innerlijke filtering'. Vanwege de hoge absorptie van de kooi, is UV licht sterk verzwakt langs de weg van het doel op de stimulatie plaats 20,21. Een geschikte manier om dit te vermijden is perfusie met de kooi die beperkt blijft tot de stimulatie site zijn bovendien vermindert de hoeveelheid gekooide verbinding nodig is om een minimum. Vergeleken met UV laser-scanning-gemedieerde uncaging, nabij-infrarood twee-foton uncaging 22 ruimtelijk nauwkeuriger, vooral omdat de nauwkeurigheid van de stimulatie verhoogd in de z-as. Anderzijds, door de kleine dwarsdoorsnede van gebruikelijke kooien voor langere golflengten zoals toegepast met twee-foton excitatie, hetzij een hoge concentratie van gekooide verbinding of zeer hoog zijn potentieel fototoxische lichtintensiteiten nodig. Ook twee-foton uncaging vereist een veel hogere investering in de apparatuur; oa extra IR laser plus de vereiste optische componenten nodig.
Zowel SBFI en MNI-glutamaat zijn prikkelbaar in de identieke golflengtegebied. Dit kan leiden tot een onbedoelde afhankelijkheid van UV uncaging laser en SBFI of IR imaging laser en MNI-glutamaat, waardoor bleken van SBFI de uncaging flash en / of continue uncaging van glutamaat door de infraroodstraal. Zoals getoond in figuur 6C, noch een UV flash zelf of multi foton imaging dergelijke wisselwerkingen onder onze experimentele omstandigheden veroorzaakt.
UV-flash systemen vergelijkbaar met die beschreven worden routinematig gebruikt in veel andere laboratoria en kunnen relatief gemakkelijk in een bestaande multi-foton imaging microscoop worden opgenomen. Dit biedt het voordeel dat de laserstraal voor fotolyse kan vrij in het gezichtsveld worden geplaatst. Bovendien laat het systeem een snelle en geautomatiseerde herpositionering van de laserbundel en het volume vrijgave, respectievelijk in het gezichtsveld tijdens een experiment. Our modificatie vereenvoudigt en verbetert de nauwkeurige positionering van de uncaging spot, zodat beelden van de imaging software kan dienen om beeldvorming en uncaging frames congruent passen.
Tezamen whole-cell patch-clamp en multi-foton natrium beeldvorming in dendrieten en spines centrale neuronen, gecombineerd met een gemodificeerde procedure voor UV-licht geïnduceerde uncaging glutamaat, een nauwkeurige en focale activering van glutamaatreceptoren in het weefsel. Derhalve kan dienen om de eigenschappen van prikkelende synaptische transmissie en postsynaptische natrium signalen analyseren neuronen in het intacte weefsel.
The authors have nothing to disclose.
Deze studie werd ondersteund door een subsidie van de Duitse Science Foundation (DFG, Ro2327 / 6-1) aan CRR De auteurs willen S. Durry en C. Roderigo voor deskundige technische bijstand, en M. Dubbert (Elektronisch Laboratorium, Zoölogisch Instituut bedanken , Universiteit van Keulen, Duitsland) voor hulp bij de uitvoering van de Pockels cel controller en de HF-schakelaar.
Hadrware/Software Component | Manufacturer | Type | Comment |
Borosilicate-glass capillaries | Hilgenberg | 1405059 | 75 mm x 2 mm, wall thickness 0.3 mm |
Camera | Jenoptik | ProgRes MF | IR-DIC compatible camera |
Deconvolution software | SVI | Huygens Pofessional X11 | |
Fiber optic spectrometer | Ocean Optics | USB 4000 | Miniature fiber optic spectrometer |
Filter tubes | VWR | cenrifugal filter, 0.2 µm | |
Imaging software | Olympus Europe | Flowview Ver 5.0c, Tiempo | |
IR beam power controller | Custom built | Laser beam intensity control + fast switch to zero on flyback via pockels cell | |
IR laser | SpectraPhysics | Mai-Tai VF-N1S | fs-pulsed Ti:Sa tunable laser (710-990 nm); CAUTION |
IR power monitor | Custom built | ||
Micromanipulator | Burleigh | PCS 5000 | |
Microscope/Imaging System | Olympus Europe | BX51WI/FV300 | Both, the microscope and the imaging systems were strongly modified |
ND filter wheel | Newport | 50Q04AV.2 | UV fused silica, optical density 0.05-2.0 |
Objective | Nikon Instruments Europe | NIR Apo 60x/1.0w | |
Patch clamp amplifier | HEKA | EPC-10 | |
Pipette puller | Narishige | Model PP-830 | |
Pneumatic drug ejection system | NPI Electronic | PDES-DXH | |
Pockels cell | Conoptics | 350-80 LA-BK | EOM, used as fast switch and for power adjustment |
Pockels cell driver | Conoptics | M302-RM | High voltage differential amplifier |
Shutter | Vincent Associates | LS6ZM2 | ALMgF2-coated BeCu blades |
Shutter controller | Custom built | ||
Shutter driver | Vincent Associates | Uniblitz VCM D1 | |
Slicer / Vibratome | Thermo Scientific | Microm HM 650 V | |
Uncaging software | Rapp OptoElectronic | UGA40 1.1.2.6 + NetCam | |
UV laser | Rapp OptoElectronic | DL-355/10 | cw DPSSL Laser, 355 nm; 10 mW; CAUTION |
UV laser scanning system | Rapp OptoElectronic | UGA 40 | Galvanometric scanning system |
Name of Compound | Catalog Number | Comments/Description | |
CNQX | Sigma Aldrich | C-127 | AMPA receptor antagonist; CAUTION |
DL-AP5 | Alfa Aesar | J64210 | NMDA receptor antagonist; CAUTION |
SBFI K+ Salt | Teflabs | OO32 | |
TTX | Ascent Scientific | Asc-055 | Inhibitor of voltage-dependent Na+ channels; CAUTION |
NMI-caged-L-Glutamate | Torcis | 1490 | Caged glutamatereleased upon UV absobtion |