Vi beskriver kombinasjonen av brennvidde UV-indusert foto-aktivering av nevro-aktive forbindelser med hel-celle patch-clamp og multi-foton avbildning av intracellulære natrium transienter i dendritter og pigger av hippocampus nevroner i akutte vev skiver av musen hjernen.
Multi-foton fluorescens mikroskopi har muliggjort analyse av morfologiske og fysiologiske parametere av hjerneceller i intakt vev med høy romlig og tidsmessig oppløsning. Kombinert med elektrofysiologi, er det mye brukt til å studere aktivitetsrelaterte kalsium signaler i små subcellulære avdelinger som dendritter og dendrittutløperne. I tillegg til kalsium-transienter, synaptisk aktivitet induserer også postsynaptiske natrium signalene, egenskapene av disse er bare marginalt forstått. Her beskriver vi en metode for kombinert hel-celle patch-clamp og multi-foton natrium bildebehandling i cellulære mikro domener av sentrale nerveceller. Videre introduserer vi en modifisert prosedyre for ultrafiolett (UV)-lys-indusert uncaging av glutamat, som tillater pålitelig og fokal aktivering av glutamat-reseptorer i vev. For å oppnå dette, ble hel-celle opptak utført på Cornu Ammonis underavdeling 1 (CA1) pyramidale nevroner i akutte vev skiver avmuse hippocampus. Nevronene ble fylt med natrium-sensitive fluorescerende fargestoff SBFI gjennom patch-pipette, og multi-foton eksitasjon av SBFI aktivert visualisering av dendritter og tilstøtende pigger. For å etablere UV-indusert fokal uncaging ble flere parametere inkludert lysintensitet, volum påvirkes av UV uncaging strålen, posisjonering av strålen, så vel som konsentrasjonen av den testede forbindelse i bur og optimalisert. Våre resultater viser at lokal perfusjon med bur glutamat (MNI-Glutamat) og sitt midt UV-uncaging resultat i indre strømninger og natrium transienter i dendritter og pigger. Tidsforløpet og amplitude av både innover strømmer og natrium signaler korrelerer med varigheten av uncaging puls. Videre viser våre resultater at intracellulære natrium signalene blir blokkert i nærvær av blokkere for ionotrofiske glutamatreseptorer, noe som viser at de er mediert av natriuminnstrømning men denne veien. Oppsummert gir vår metode et pålitelig verktøy forundersøkelse av intracellulære natrium signaler indusert av fokal reseptoraktivering hos intakte hjernevev.
Nylige forbedringer i lys mikroskopiske teknikker som multi-foton mikroskopi har aktivert studiet av morfologiske og fysiologiske parametere av hjerneceller i intakt vev med høy romlig og tidsmessig oppløsning. Kombinert med elektrofysiologi, er disse teknikkene nå mye brukt for å analysere aktiviteten messige elektriske signalene på nerveceller, så vel som kalsium samtidige signaler i små subcellulære rom, nemlig i fine dendritter og dendrittutløperne. I tillegg til kalsium-transienter, synaptisk aktivitet induserer også natrium signaler i dendritter og pigger, egenskaper som er lite utforsket. Slike signaler kan analyseres ved to-foton avbildning av intracellulær natrium-([Na +] i), som gjør det mulig for on-line-måling av [Na +] i transienter i lengre perioder uten signifikant fargestoff bleking eller foto-skade 1,2.
For avbildning av [Na +] i </sub>, bare noen få kjemisk indikatorfargestoffer er tilgjengelig, f.eks Corona Grønn eller Asante Natrium Grønn 3,4. Den mest brukte fluorescerende probe for Na + bildebehandling er natrium-bindende benzofuran isoftalat (SBFI). Det er et ratiometrisk, UV-spent fargestoff som ligner den kjente kalsium-sensitive fura fargestoff-2, og har vært anvendt for konvensjonelle Na + avbildning i mange celletyper (for eksempel 5,6). Det finnes forskjellige muligheter for å eksitere fargestoff og samle dens fluorescens. Hvis høy tidsoppløsning (dvs. en høy bildebehandling bildefrekvens) er nødvendig i kombinasjon med romlig informasjon, kan SBFI være glade med en xenon arc lampe eller en høy effekt light-emitting diode (LED) enheten og dens utslipp oppdages med en høy hastighet kostnad -koblet enhet (CCD)-kamera 7,8. For maksimal romlig oppløsning dypt i vev, er multi-foton laser scanning mikroskop metoden for valg 9. Den relativt lave quantum effektiv vNCY av SBFI nødvendiggjør forholdsvis høye fargestoffkonsentrasjoner (0,5 til 2 mm), og direkte lasting av den membran-ugjennomtrengelig form av SBFI via en skarp microelectrode 10 eller lapp pipette 1.
Bruke SBFI, tidligere arbeid utført i akutte vev skiver av de gnager hippocampus demonstrert aktivitetsrelaterte natrium transienter i dendritter og pigger av CA1 pyramidale nevroner som i hovedsak forårsaket av tilstrømningen av natrium gjennom ionotropiske NMDA reseptorer 1,2. For undersøkelse av egenskapene til slike lokale natrium signaler i mer detalj, er spesifikk aktivering av postsynaptiske reseptorer ved anvendelse av reseptor-agonister en velegnet metode for valg. Å etterligne presynaptisk aktivitet og senderen utgivelsen, bør søknaden være relativt kortfattet og fokusert for å aktivere lokal stimulering. Dette, men viser seg å være ganske vanskelig i intakt vev. Lokalt trykk anvendelse av reseptor agonister ved hjelp av en tynn pipette gir svært focal application, men er vert for den potensielle risikoen for å produsere bevegelse av strukturen av interesse (f.eks eksempel en dendrite eller dendrittutløperne), og dermed hindrer bildebehandling med høy oppløsning. Egnetheten iontoforese av nevro-aktive stoffer, avhenger av deres elektriske egenskaper og høy strøm amplituder kan produsere cellulære gjenstander i tillegg.
En måte å omgå disse hindringene er ansettelse av foto-aktivert forbindelser og deres flash fotolyse. I utgangspunktet er to ulike prinsipper som brukes for foto-aktivering av bur stoffer: I) Wide-field flash fotolyse 11 og II) focal uncaging ansette skanning moduler i kombinasjon med laser 12. Mens bredt felt flashfotolyse benyttes for å aktivere større regioner av interesse, for eksempel en hel celle, er fokal uncaging anvendes for å spesifikt stimulere små cellulære avdelinger. I den foreliggende undersøkelse viser vi en fremgangsmåte for hel-celle patch-clamp og multi-pHoton natrium avbildning i dendritter og pigger av sentrale neuroner, i kombinasjon med en modifisert prosedyre for UV-lysindusert uncaging av glutamat, som tillater pålitelig og fokal aktivering av glutamat-reseptorer i vev.
Denne studien viser at SBFI er godt egnet for to-foton avbildning av intracellulære natrium transienter i små cellulære avdelinger. Det må tas i betraktning, men at Quantum effektiviteten av SBFI er ganske lave 15 og relative endringer i natriumkonsentrasjonen er ganske liten med fysiologisk aktivitet. Således er høyoppløselig måling av Na + transienter i fin prosesser relativt kjedelig oppgave, og binning eller midling av flere forsøk kan være nødvendig for å oppnå tilfredsstillende signaler. I tillegg, kinetikken av natrium transienter er overraskende langsom, noe som gjør det obligatorisk å ta opp i lengre tidsperioder. Denne observasjon stemmer overens med de i tidligere studier, hvor monoexponential nedbrytning av natrium transienter i neuronale dendritter og i astrocytter ble karakterisert ved store nedbrytning tidskonstanter i området fra 10 sek ved romtemperatur 1,2,6. Natrium transienter dermed synes å utøve en mye tregere tid coUrse og mye større nedbrytning tidskonstanter som sammenlignet med kalsium-transienter 16.
Sett av disse ulempene, beviser natrium bildebehandling å være et verdifullt verktøy for etterforskningen av fysiologiske egenskaper av nevronale underdomener. For eksempel kan natrium-avbildning tjene til å overvåke eksitatorisk synaptisk aktivitet ved eller i nærheten av aktive synapser. Fordi natrium er i det vesentlige ikke er buffret 8,17, er aktivitets-induserte transienter natrium lineært relatert til et bredt spekter av synaptiske glutamatfrigi eller eksogent glutamat anvendt. De dermed representerer direkte og objektive indikatorer på nevronale glutamaterg aktivitet. Videre natrium indikatorfargestoffer oppviser høy K d 's (SBFI største K d er i området fra 25 mM 1). Selv ved den relativt høye intracellulære konsentrasjoner fargestoff som brukes for å oppnå tilstrekkelig lysstyrke (vanligvis 0.5 – 1 mM), den høye K d 's antyde at de fargestoffer som i seg selv ikke virker som buffere for sOdium. Følgelig har de ikke forvrenge amplitude eller tidsforløpet av natrium transienter, som alltid er et problem når kalsiumfølsomme fargestoffer blir introdusert inn i cellene 18. Det kan dermed antas at de oppdagede signalene representerer et godt mål på den "ekte" endringer i intracellulær natrium. Deres langsom tid selvfølgelig medfører da at hastigheten for intracellulær diffusjon for natrium i nevroner er mye mindre enn tidligere antatt 19.
En viktig forutsetning for en vellykket gjennomføring av forsøkene adressering egenskapene av eksitatoriske synaptisk transmisjon og natrium tilstrømningen trasé til pigger og dendrittene er dannelse av et fast og sterkt lokalisert aktivering av postsynaptisk strukturer. Dette kan oppnås ved rask og lokal påføring av glutamat eller glutamatagonister i umiddelbar nærhet av en rygg eller et dendritt ved flashfotolyse av bur forbindelser. Flash fotolyse ikke mekanisk damage vevet, er fri for bevegelse gjenstander og er godt etablert for etterforskningen av relaterte spørsmål (f.eks lokale kalsium signalisering). Diameteren på uncaging punktet var 1,5 mikrometer i xy-planet. Uncaging nær en spiny Dendritt indusert natrium signaler i begge pigger og foreldre dendrite. Mens signalene tendens til å være størst i pigger nærmest uncaging spot, amplitudene i den overordnede dendrite og pigger lenger unna var fortsatt ganske lik de i direkte nærhet av uncaging spot. Uncaging ble utført for 300 msek der innover strøm økte i amplitude. Uncaged glutamat kan ha diffundert inn i vevet i løpet av samme tidsperiode, aktivering ionotrofiske glutamatreseptorer og natriuminnstrømning på dendrittiske regioner og pigger lenger bort fra uncaging flekk.
Et iboende problem som oppstår ved bruk av en UV-laser for fotolyse av bur forbindelser administreres gjennom cellen badeløsningener 'indre filtrering'. På grunn av den høye absorption rate av buret, er UV-lys dempes sterkt underveis fra målet til stimulering nettstedet 20,21. En mulig måte å unngå dette på er lokal perfusjon med bur som er begrenset bare til stimulering side, som dessuten reduserer mengden bur forbindelsen som trengs til et minimum. Som sammenlignet med UV-laser-scanning-mediert uncaging, nær-infrarød to-foton uncaging 22 er romlig mer nøyaktig, fordi nøyaktigheten av stimuleringen øker i z-aksen. På den annen side, på grunn av det lille tverrsnitt av vanlig brukte bur for lengre bølgelengder som anvendes til to-foton-eksitasjon, enten en høy konsentrasjon av den innestengte forbindelse eller svært høy, er potensielt fototoksiske lysintensiteter som trengs. Også nødvendig to-foton uncaging en mye høyere investering i utstyr; blant andre, er en ytterligere IR-laser pluss de nødvendige optiske komponenter, trengte.
Både SBFI og MNI-glutamat er hissige i samme bølgelengdeområde. Dette kan føre til en utilsiktet interdependency av UV uncaging laser og SBFI eller IR bildebehandling laser og MNI-glutamat, som resulterer i bleking av SBFI av uncaging blits og / eller en kontinuerlig uncaging av glutamat ved IR-strålen. Imidlertid, som vist i figur 6C, verken en UV flash i seg selv eller multifoton avbildning forårsaket slike gjensidige virkninger under våre eksperimentelle betingelser.
UV-blitz-systemer som ligner på det som beskrives her, brukes rutinemessig i mange andre laboratorier og kan relativt lett bli innarbeidet i alle eksisterende multi-foton bildebehandling mikroskop. Det har den fordelen at laserstrålen for fotolyse kan plasseres fritt i synsfeltet. I tillegg gir systemet en rask og automatisert reposisjonering av laserstrålen, og volumet frigjøring, hhv, i synsfeltet løpet av et eksperiment. Our modifikasjon forenkler og forbedrer nøyaktig posisjonering av uncaging spot, slik at rammene i bildebehandlingsprogrammer kan tjene til å justere bilde og uncaging rammer congruently.
Tatt sammen, hel-celle patch-clamp og multi-foton natrium avbildning i dendritter og pigger av sentrale neuroner, i kombinasjon med en modifisert prosedyre for UV-lysindusert uncaging av glutamat, tillater pålitelig og fokal aktivering av glutamat-reseptorer i vev. Det kan således tjene til å analysere egenskapene til eksitatorisk synaptisk transmisjon og av postsynaptiske natrium-signaler i nevroner i intakt vev.
The authors have nothing to disclose.
Denne studien ble støttet av et stipend fra det tyske Science Foundation (DFG, Ro2327 / 6-1) til CRR Forfatterne ønsker å takke S. Durry og C. Roderigo for ekspert teknisk assistanse, og M. Dübbert (Electronics Laboratory, Zoologisk Institutt , Universitetet i Köln, Tyskland) for å få hjelp i gjennomføringen av Pockelscellen kontrolleren og HF-switch.
Hadrware/Software Component | Manufacturer | Type | Comment |
Borosilicate-glass capillaries | Hilgenberg | 1405059 | 75 mm x 2 mm, wall thickness 0.3 mm |
Camera | Jenoptik | ProgRes MF | IR-DIC compatible camera |
Deconvolution software | SVI | Huygens Pofessional X11 | |
Fiber optic spectrometer | Ocean Optics | USB 4000 | Miniature fiber optic spectrometer |
Filter tubes | VWR | cenrifugal filter, 0.2 µm | |
Imaging software | Olympus Europe | Flowview Ver 5.0c, Tiempo | |
IR beam power controller | Custom built | Laser beam intensity control + fast switch to zero on flyback via pockels cell | |
IR laser | SpectraPhysics | Mai-Tai VF-N1S | fs-pulsed Ti:Sa tunable laser (710-990 nm); CAUTION |
IR power monitor | Custom built | ||
Micromanipulator | Burleigh | PCS 5000 | |
Microscope/Imaging System | Olympus Europe | BX51WI/FV300 | Both, the microscope and the imaging systems were strongly modified |
ND filter wheel | Newport | 50Q04AV.2 | UV fused silica, optical density 0.05-2.0 |
Objective | Nikon Instruments Europe | NIR Apo 60x/1.0w | |
Patch clamp amplifier | HEKA | EPC-10 | |
Pipette puller | Narishige | Model PP-830 | |
Pneumatic drug ejection system | NPI Electronic | PDES-DXH | |
Pockels cell | Conoptics | 350-80 LA-BK | EOM, used as fast switch and for power adjustment |
Pockels cell driver | Conoptics | M302-RM | High voltage differential amplifier |
Shutter | Vincent Associates | LS6ZM2 | ALMgF2-coated BeCu blades |
Shutter controller | Custom built | ||
Shutter driver | Vincent Associates | Uniblitz VCM D1 | |
Slicer / Vibratome | Thermo Scientific | Microm HM 650 V | |
Uncaging software | Rapp OptoElectronic | UGA40 1.1.2.6 + NetCam | |
UV laser | Rapp OptoElectronic | DL-355/10 | cw DPSSL Laser, 355 nm; 10 mW; CAUTION |
UV laser scanning system | Rapp OptoElectronic | UGA 40 | Galvanometric scanning system |
Name of Compound | Catalog Number | Comments/Description | |
CNQX | Sigma Aldrich | C-127 | AMPA receptor antagonist; CAUTION |
DL-AP5 | Alfa Aesar | J64210 | NMDA receptor antagonist; CAUTION |
SBFI K+ Salt | Teflabs | OO32 | |
TTX | Ascent Scientific | Asc-055 | Inhibitor of voltage-dependent Na+ channels; CAUTION |
NMI-caged-L-Glutamate | Torcis | 1490 | Caged glutamatereleased upon UV absobtion |