Bu tam hücre patch-kelepçesi ve fare beyin, akut doku dilimleri dendrit ve hipokampal nöronlar dikenler Hücre içi sodyum transient çoklu foton görüntüleme ile, nöro-aktif bileşiklerin fokal UV uyarımlı foto-aktivasyon kombinasyonunu tarif eder.
Çoklu foton floresan mikroskopi yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlüğe sahip sağlam doku beyin hücrelerinin morfolojik ve fizyolojik parametrelerin analizini sağladı. Elektrofizyoloji ile birlikte, yaygın olarak dendrit ve dendritik dikenler gibi küçük subselüler bölümlerinde etkinlik ile ilgili kalsiyum sinyalleri incelemek için kullanılır. Kalsiyum geçici ek olarak, sinaptik etkinliği de postsinaptik sodyum sinyalleri, sadece marjinal anlaşılmalıdır ki özelliklerini neden olur. Burada, merkezi nöronların hücre mikro etki kombine tam hücre patch-kelepçesi ve çoklu foton sodyum görüntüleme için bir yöntem tarif eder. Ayrıca, doku, glutamat reseptörlerinin, güvenilir ve fokal hareketliliğe olanak tanıyan, ultra viyole (UV) ışığı-glutamat kaynaklı uncaging için modifiye edilmiş bir prosedürü getirmektedir. Bu amaçla, tam-hücre kayıtları cornu ammonis alt bölüm 1 (CA1) akut doku dilimleri piramidal nöronlar üzerinde gerçekleştirilmiştirFare hippocampusu. Nöronlar yama pipet ile sodyum duyarlı floresan boya SBFI ile dolu, ve SBFI çoklu foton uyarma dendritler ve komşu dikenler görselleştirme sağlanmıştır. UV yol açtığı fokal uncaging oluşturmak için, ışık yoğunluğu, UV ışın Uncaging etkilenen hacmi, ışının pozisyonu ile kafesli bileşik konsantrasyonuna dahil olmak üzere birçok parametre olarak test edilmiş ve optimize edilmiştir. Bizim sonuçlar kafesli glutamat (MNI-Glutamat) ile yerel perfüzyon ve dendritler ve dikenler içe akımlar ve sodyum geçici onun odak UV-Uncaging sonuç gösterebilir. Bir zaman ve içeri doğru akımlar ve sodyum sinyalleri hem genlik Uncaging palsın süresi ile ilişkilidir. Ayrıca, sonuçlar, bu yolun da sodyum girmesi aracılık ettiğini gösteren hücre içi sinyaller sodyum iyonotropik glutamat reseptörleri için bloker varlığında bloke olduğunu göstermektedir. Özetle, bizim yöntem için güvenilir bir araç sağlarsağlam beyin dokusunda fokal reseptör aktivasyonu tarafından uyarılan hücre içi sodyum sinyallerinin incelenmesi.
Bu tür çoklu foton mikroskopi gibi hafif mikroskobik tekniklerindeki son gelişmeler, yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlüğe sahip sağlam doku beyin hücrelerinin morfolojik ve fizyolojik parametrelerin çalışma sağlamıştır. Elektrofizyoloji ile birlikte, bu teknikler artık yaygın yani ince dendritler ve dendritik dikenler, küçük subselüler bölümlerinde nöronlar üzerinde etkinlik ile ilgili elektrik sinyalleri yanı sıra eşlik eden kalsiyum sinyalleri analiz etmek için kullanılır. Kalsiyum geçici ek olarak, sinaptik etkinliği de dendrit ve omurga içinde sodyum sinyalleri uyarır özellikleri büyük oranda araştırılmamıştır. Bu tür sinyaller [Na +] önemli boya ağartma veya foto-hasarı 1,2 vermeden uzun süre i Transientlerin on-line ölçüm sağlar hücre içi sodyum iki-foton görüntüleme ([Na +] i) ile analiz edilebilir.
[Na +] i görüntüleme için </> alt sadece birkaç kimyasal gösterge boya maddeleri, örneğin korona Yeşil veya Asante Sodyum yeşil 3,4 mevcuttur. Na görüntüleme için en yaygın biçimde kullanılan flüoresan prob sodyum bağlayıcı benzofuran izoftalat (SBFI) 'dir. Bu iyi bilinen kalsiyuma duyarlı boya Fura-2'ye benzer bir oran ölçer, UV ile uyarılmış ve boya (örneğin, 5,6), birçok hücre tipinde, geleneksel Na görüntüleme için kullanılmıştır. Heyecan verici boya ve floresan toplama farklı olasılıklar vardır. Yüksek temporal çözünürlük (yani yüksek görüntüleme kare hızı) mekansal bilgi ile birlikte gerekiyorsa, SBFI yüksek hızlı şarj ile tespit ksenon ark lambasından veya yüksek güç ışık yayan diyot (LED) cihaz ve emisyon ile heyecanlı olabilir -coupled cihaz (CCD) kamera 7,8. Derin doku, maksimal uzamsal çözünürlük için, çoklu foton lazer tarama mikroskobu tercih 9 yöntemdir. Nispeten düşük kuantum efficie(- 2 mM 0.5) ve keskin bir mikroelektrot 10 veya yama pipet 1 ile SBFI membran geçirmeyen biçiminin doğrudan yükleme SBFI arasında ncy nispeten yüksek boya konsantrasyonları gerektirir.
SBFI kullanarak, kemirgen hipokampus akut doku dilimleri yapılan önceki çalışmaları ağırlıklı olarak 1,2 reseptörleri İyonotropik NMDA ile sodyum akını kaynaklanır CA1 piramidal nöronların dendrit ve dikenler etkinlik ile ilgili sodyum transientler gösterdi. Daha ayrıntılı olarak, yerel sodyum sinyallerin özelliklerinin çalışma için, reseptör agonistlerinin uygulanması ile postsinaptik reseptör özgü aktivasyon tercih edilen bir çok uygun bir yöntemdir. Presinaptik aktivite ve verici salınımını taklit etmek, uygulama nispeten kısa olması ve yerel uyarımı sağlamak için odaklı olmalıdır. Ancak bu, sağlam dokularda oldukça zor olduğu kanıtlanmıştır. Ince uçlu bir pipet kullanarak reseptör agonistlerinin lokal basınç uygulanması çok odak ap sağlarkatmer, ama (böyle bir dendrit ve dendritik dikenler gibi örneğin) ilgi yapısının hareketini üretmek için potansiyel risk barındıran ve böylece yüksek çözünürlüklü görüntüleme engellemektedir. Nöro-aktif maddelerin iyontoforez uygunluğu elektrik durumuna bağlıdır ve yüksek akım genlikleri, hem de hücresel eserler üretebilir.
Bu engelleri aşmak için bir yol fotoğraf aktive bileşiklerin ve bunların flaş photolysis istihdam olduğunu. Temel olarak iki farklı prensipler kafesli maddeler foto-aktivasyon için kullanılır: 12 ile birlikte lazer tarama modülleri kullanılarak I) 'in geniş alan flaş fotoliz ve 11 II)' fokal Uncaging. Geniş alan flaş potoliz ilgi geniş bölgelerini aktive etmek için kullanılır iken, örneğin bütün bir hücre, odak Uncaging özellikle küçük hücresel bölmeleri uyarmak için kullanılır. Bu çalışmada biz tüm hücre yama-kelepçe ve çok p bir prosedür göstermekDokuda, glutamat reseptörlerinin, güvenilir ve fokal hareketliliğe olanak tanıyan glutamat UV ışık kaynaklı uncaging, modifiye edilmiş bir prosedür ile birlikte dendrit ve merkezi nöron dikenler hoton sodyum görüntüleme.
Bu çalışma, SBFI küçük hücresel bölümlerinde Hücre içi sodyum transient iki foton görüntüleme için uygun olduğunu göstermektedir. Bu SBFI kuantum etkinliği, sodyum konsantrasyonu oldukça azdır, 15 ve nispi değişikliklerin fizyolojik aktiviteye sahip oldukça küçük olduğu, ancak, akılda tutulmalıdır. Böylece, ince süreçlerin Na + Transientlerin yüksek çözünürlüklü ölçüm nispeten sıkıcı bir iştir, ve birkaç deneme binning veya ortalama tatmin edici sinyalleri elde etmek için gerekli olabilir. Ayrıca, sodyum Transientlerin kinetik uzun süreler için kayıt zorunlu hale şaşırtıcı yavaş. Bu gözlem, nöronal dendritler ve astrositlerin sodyum transient monoexponential bozunma oda sıcaklığında 1,2,6 10 saniye aralığındaki büyük bozulma süresi sabiti ile karakterize edilir burada daha önceki çalışmalarda, olanlara karşılık gelir. Sodyum geçici Bu şekilde çok daha düşük bir zaman co gösterir gibi görünürURSE ve kalsiyum geçici 16 oranla çok daha büyük bozulma zaman sabitleri.
Bu sakıncaları bir kenara, sodyum görüntüleme nöronal alt etki fizyolojik özelliklerinin araştırılması için değerli bir araç olduğunu kanıtlıyor. Örneğin, sodyum görüntüleme ya da yakın aktif sinaps uyarıcı sinaptik aktivitesini izlemek için hizmet edebilir. Sodyum esas 8,17 tamponlanmamış için, aktivitesi ile uyarılan geçici sodyum doğrusal sinaptik glutamat salınımı geniş bir ilişkili ya da dışsal olarak glutamat uygulanır. Bu nedenle bir nöronal Glutamaterjik aktivitenin doğrudan ve tarafsız göstergeleri temsil eder. Ayrıca, sodyum göstergesi boyalar yüksek K d '(SBFI en Kd 25 aralığında mM 1 ise) sergilerler. (- 1 mM genellikle 0.5), yüksek Kd 'nin boyaları kendileri s tampon olarak hareket yok olduğunu ima bile yeterli bir parlaklık elde etmek için kullanılan nispeten yüksek hücre içi boya konsantrasyonlardaiğrençlik. Sonuç olarak, onlar kalsiyum duyarlı boyalar hücrelere 18 sokulur her zaman bir endişe olduğu, sodyum Transientlerin genlik ne zaman ders bozmaz. Bu nedenle bulgulanan sinyaller, hücre içi sodyum, "gerçek" değişiklikleri iyi bir ölçümünü temsil ettiği kabul edilebilir. Bunların yavaş olan süreçleri nöron sodyum için hücre içi difüzyon hızı önceden tahmin 19 daha küçük olduğu anlamına gelir.
Dikenler ve dendritler içine uyarıcı sinaptik iletim ve sodyum akını yolların özelliklerini ele deneylerin başarılı bir şekilde yürütülmesi için önemli bir gereklilik postsinaptik yapıların hızlı ve son derece lokalize aktivasyon indüksiyon olduğunu. Bu, bir omurga bölgesinin hemen yakınında ya da kafes bileşiklerin flaş fotoliz dendritlerin glutamat glutamat agonistleri ve hızlı yerel uygulanması ile elde edilebilir. Flaş potoliz değil mekanik Dama yokge doku, hareket eserler ücretsiz ve bununla ilgili sorular soruşturma için (örneğin, yerel kalsiyum sinyalizasyonu) kuruldu. Uncaging spot çapı xy düzleminde 1,5 um idi. Uncaging hem dikenleri bir dikenli dendrit kaynaklı sodyum sinyalleri yakın ve ana dendrit. Sinyalleri Uncaging noktaya en yakın dikenler büyük olma eğilimi ise, ana dendrit amplitüdleri ve omurgaları daha uzakta hala Uncaging noktasının hemen yakınında kişilerce oldukça benzerdi. Uncaging içeri doğru akımlar amplitüdünün artış sırasında 300 milisaniye boyunca uygulandı. Uncaged glutamat daha uzakta Uncaging yerden dendritik bölgelere ve dikenler üzerinde İyonotropik glutamat reseptörleri ve sodyum akışını aktive aynı dönemde dokuda yayılmış olabilir.
Hücre banyo çözümü aracılığıyla uygulanan kafesli bileşiklerin photolysis için UV lazer kullanılarak oluşur içsel bir sorun'İç filtreleme' olduğunu. Çünkü kafesin yüksek emme oranı, UV ışığı uyarım siteye 20,21 için hedeften yol boyunca güçlü zayıflatılmaktadır. Bunu önlemek için bir uygun yol, sadece, ayrıca en az bir kafes için gerekli bileşik miktarını azaltır uyarı bölgesinden, sınırlıdır kafes yerel bir perfüzyon. UV lazer tarama aracılı Uncaging, yakın enfraruj, iki foton ile karşılaştırıldığında, 22 Uncaging stimülasyon doğruluğu z ekseni artar çünkü esas olarak, uzaysal olarak daha hassas. Diğer taraftan nedeniyle, iki foton uyarılması ile birlikte kullanılan bir yüksek kafesli bileşik konsantrasyonu ya da çok yüksek olmak üzere, potansiyel olarak fototoksik ışık yoğunlukları gereken daha uzun dalga boyları için yaygın olarak kullanılan kafeslerin küçük kesitine. Ayrıca, iki foton Uncaging ekipman çok daha yüksek bir yatırım gerektirir; diğerlerinin yanı sıra, ek bir kızılötesi lazer artı gerekli olan optik bileşenler ihtiyaç vardır.
SBFI ve MNI-glutamat ikisi de aynı dalga boyu aralığında uyarılabilir bulunmaktadır. Bu, flaş Uncaging ve / veya kızılötesi ışın ile glutamat sürekli uncaging ile SBFI ağartılmasında sonuçlanan UV Uncaging lazer ve SBFI veya kızılötesi görüntüleme lazer ve MNI-glutamat istenmeyen bir ara bağımlılığı yol açabilir. Şekil 6C'de gösterildiği gibi Ne var ki, tek başına veya çoklu foton görüntüleme ile, UV flaş bizim deney koşulları altında, bu karşılıklı etkilere neden olmuştur.
Burada açıklanan benzer UV flaş sistemler, pek çok diğer laboratuarlarda rutin olarak kullanılır ve nispeten kolay herhangi mevcut bir foton görüntüleme mikroskop içine dahil edilebilir. Bu fotoliz için lazer ışını görüş alanında serbestçe konumlandırılabilir avantajını sunmaktadır. Buna ek olarak, sistem bir deney sırasında, görüş alanı sırasıyla lazer ışınının hızlı ve otomatik yeniden konumlandırılması ve serbest hacmi, sağlar. OuR modifikasyon kolaylaştırır ve görüntüleme yazılımı çerçeveleri örtüşecek görüntüleme ve Uncaging çerçeveleri ayarlamak üzere iş görmektedirler, böylece Uncaging noktasının doğru konumlandırma artırır.
Birlikte ele alındığında, glutamat UV ışık kaynaklı uncaging için modifiye edilmiş bir prosedür ile birlikte dendrit ve merkezi nöron dikenler tam hücre patch-clamp ve çoklu foton sodyum görüntüleme, doku glutamat reseptörlerinin, güvenilir ve fokal aktivasyonunu sağlar. Böylece, sağlam doku nöronların uyarıcı sinirsel iletimin ve postsinaptik sodyum sinyallerin özelliklerini analiz etmek için hizmet edebilir.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma Yazarlar S. Durry ve C. Roderigo uzman teknik yardım için, ve M. Dubbert (Elektronik Laboratuvarı, Zooloji Enstitüsü'ne teşekkür isteyen CRR için Alman Bilim Vakfı (DFG, Ro2327 / 6-1) bir hibe ile desteklenen Pockels hücresi denetleyicisi ve HF anahtarı uygulanmasında yardım için Köln Üniversitesi, Almanya).
Hadrware/Software Component | Manufacturer | Type | Comment |
Borosilicate-glass capillaries | Hilgenberg | 1405059 | 75 mm x 2 mm, wall thickness 0.3 mm |
Camera | Jenoptik | ProgRes MF | IR-DIC compatible camera |
Deconvolution software | SVI | Huygens Pofessional X11 | |
Fiber optic spectrometer | Ocean Optics | USB 4000 | Miniature fiber optic spectrometer |
Filter tubes | VWR | cenrifugal filter, 0.2 µm | |
Imaging software | Olympus Europe | Flowview Ver 5.0c, Tiempo | |
IR beam power controller | Custom built | Laser beam intensity control + fast switch to zero on flyback via pockels cell | |
IR laser | SpectraPhysics | Mai-Tai VF-N1S | fs-pulsed Ti:Sa tunable laser (710-990 nm); CAUTION |
IR power monitor | Custom built | ||
Micromanipulator | Burleigh | PCS 5000 | |
Microscope/Imaging System | Olympus Europe | BX51WI/FV300 | Both, the microscope and the imaging systems were strongly modified |
ND filter wheel | Newport | 50Q04AV.2 | UV fused silica, optical density 0.05-2.0 |
Objective | Nikon Instruments Europe | NIR Apo 60x/1.0w | |
Patch clamp amplifier | HEKA | EPC-10 | |
Pipette puller | Narishige | Model PP-830 | |
Pneumatic drug ejection system | NPI Electronic | PDES-DXH | |
Pockels cell | Conoptics | 350-80 LA-BK | EOM, used as fast switch and for power adjustment |
Pockels cell driver | Conoptics | M302-RM | High voltage differential amplifier |
Shutter | Vincent Associates | LS6ZM2 | ALMgF2-coated BeCu blades |
Shutter controller | Custom built | ||
Shutter driver | Vincent Associates | Uniblitz VCM D1 | |
Slicer / Vibratome | Thermo Scientific | Microm HM 650 V | |
Uncaging software | Rapp OptoElectronic | UGA40 1.1.2.6 + NetCam | |
UV laser | Rapp OptoElectronic | DL-355/10 | cw DPSSL Laser, 355 nm; 10 mW; CAUTION |
UV laser scanning system | Rapp OptoElectronic | UGA 40 | Galvanometric scanning system |
Name of Compound | Catalog Number | Comments/Description | |
CNQX | Sigma Aldrich | C-127 | AMPA receptor antagonist; CAUTION |
DL-AP5 | Alfa Aesar | J64210 | NMDA receptor antagonist; CAUTION |
SBFI K+ Salt | Teflabs | OO32 | |
TTX | Ascent Scientific | Asc-055 | Inhibitor of voltage-dependent Na+ channels; CAUTION |
NMI-caged-L-Glutamate | Torcis | 1490 | Caged glutamatereleased upon UV absobtion |