Vi beskriver kombinationen af brændvidde UV-induceret foto-aktivering af neuro-aktive forbindelser med hel-celle patch-clamp og multi-foton billeddannelse af intracellulære natrium transienter i dendritter og pigge af hippocampusneuroner i akutte vævssnit med musen hjernen.
Multi-foton fluorescens mikroskopi har gjort det muligt at analysere morfologiske og fysiologiske parametre for hjerneceller i ubeskadiget væv med høj rumlig og tidsmæssig opløsning. Kombineret med elektrofysiologi, er det almindeligt brugt til at studere aktivitetsrelaterede calcium-signaler i små subcellulære rum såsom dendritter og dendritiske pigge. Ud over calcium transienter, synaptisk aktivitet inducerer også postsynaptiske natrium signaler, hvis egenskaber som kun er marginalt forstået. Her beskriver vi en metode til kombineret hel-celle patch-clamp og multi-foton natrium billeddannelse i cellulære mikro domæner af centrale neuroner. Endvidere introduceres en modificeret procedure for ultraviolet (UV)-lys-induceret uncaging af glutamat, som giver pålidelig og fokal aktivering af glutamatreceptorer i vævet. Til dette formål blev helcelle-optagelser udført på Cornu Ammonis underafsnit 1 (CA1) pyramidale neuroner i akutte vævssnit afmusehippocampus. Neuroner blev fyldt med natrium-fluorescensfarvestof SBFI gennem patch-pipette og multi-foton excitation af SBFI aktiveret visualisering af dendritter og tilstødende pigge. At etablere UV-induceret fokal uncaging blev adskillige parametre, herunder lysintensitet, volumen påvirkes af UV uncaging stråle, anbringelse af strålen samt koncentrationen af den bur forbindelsen testet og optimeret. Vores resultater viser, at den lokale perfusion med bur glutamat (MNI-glutamat) og dens brændvidde UV-uncaging resultat i indadgående strømme og natrium transienter i dendritter og pigge. Tidsforløb og amplituden af både aktiv strømme og natrium signaler korrelerer med varigheden af uncaging puls. Vores resultater viser endvidere, at intracellulære natrium signaler er blokeret i nærvær af blokkere til ionotropiske glutamatreceptorer, viser, at de er medieret af natrium tilstrømning selvom denne vej. Sammenfattende vores metode giver et pålideligt værktøj tilundersøgelse af intracellulære natrium signaler induceret af fokal receptoraktivering i intakt hjernevæv.
Seneste forbedringer i lysmikroskopiske teknikker såsom multi-foton mikroskopi har gjort det muligt at studere morfologiske og fysiologiske parametre for hjerneceller i ubeskadiget væv med høj rumlig og tidsmæssig opløsning. Kombineret med elektrofysiologi, er disse teknikker nu i vid udstrækning anvendes til at analysere aktivitetsafhængige elektriske signaler på neuroner samt ledsagende calcium-signaler i små subcellulære rum, nemlig i fine dendritter og dendritiske pigge. Ud over calcium transienter, synaptisk aktivitet inducerer også natrium signaler i dendritter og pigge, hvis egenskaber er stort set uudforsket. Sådanne signaler kan analyseres ved to-foton billeddannelse af intracellulære natrium ([Na +] i), som gør det muligt on-line måling af [Na +] i transienter i længere perioder uden væsentlig farvestof blegning eller foto-skade 1,2.
Til billeddannelse af [Na +] i </sub>, findes kun et par kemisk indikatorfarvestoffer, fx corona Grøn eller Asante Natrium Green 3,4. Den mest almindeligt anvendte fluorescerende probe til Na + billeddannelse er natrium-bindende benzofuran isophthalat (SBFI). Det er en ratiometrisk, UV-ophidset farvestof ligner den velkendte calcium-sensitive farvestof fura-2 og har været ansat til konventionel Na + billeddannelse i mange celletyper (fx 5,6). Der er forskellige muligheder for spændende farvestoffet og indsamle dets fluorescens. Hvis høj tidsmæssig opløsning (dvs. en høj billeddannelse frame rate) er påkrævet i kombination med geografisk information, kan SBFI være ophidset med en xenon bue lampe eller en høj effekt lys-dioder (LED) enhed og dens emission detekteres med en høj hastighed afgift -coupled enhed (CCD) kamera 7,8. For at opnå maksimal rumlig opløsning dybt i vævet, multi-foton laser scanning mikroskopi er den foretrukne metode 9. Den relativt lave kvante efficieNCY af SBFI kræver relativt høje farvestofkoncentrationer (0,5 – 2 mm), og direkte belastning af membran-uigennemtrængelige form af SBFI via en skarp mikroelektrode 10 eller patch pipette 1.
Brug SBFI, tidligere arbejde udført i akutte vævssnit af gnaver hippocampus demonstrerede aktivitetsrelaterede natrium transienter i dendritter og pigge af CA1 pyramideneuroner som hovedsageligt forårsaget af tilstrømningen af natrium gennem ionotropiske NMDA-receptorer 1,2. Til undersøgelse af egenskaberne af sådanne lokale natrium signaler i mere detaljeret, specifik aktivering af postsynaptiske receptorer ved anvendelse af receptoragonister er en velegnet metode til valg. At efterligne præsynaptiske aktivitet og transmitterfrigivelse må anvendelse være relativt kortfattet og fokuseret på at muliggøre lokal stimulation. Dette viser sig dog at være ganske udfordrende i ubeskadiget væv. Lokalt pres anvendelse af receptoragonister hjælp af en spids pipette gør meget omdrejningspunkt apdelsen, men er vært den potentielle risiko for at producere bevægelse af strukturen af interesse (f.eks såsom en dendritceller eller dendritiske spidser), og hindrer således høj opløsning billeddannelse. Egnethed iontoforese af neuro-aktive stoffer afhænger af deres elektriske egenskaber og høje aktuelle amplituder kan producere cellulære artefakter så godt.
En måde at omgå disse hindringer er ansættelse af foto-aktiverede forbindelser og deres flash-fotolyse. Dybest set, er to forskellige principper, der anvendes til foto-aktivering af bur stoffer: I) Wide-field flash fotolyse 11 og II) brændvidde uncaging anvender scanning moduler i kombination med lasere 12. Mens bredt felt flash fotolyse anvendes til at aktivere større regioner af interesse, fx en hel celle, omdrejningspunkt uncaging ansat til specifikt at stimulere små cellulære rum. I den foreliggende undersøgelse viser vi en fremgangsmåde til helcelle-patch-clamp og mulHoton natrium billeddannelse i dendritter og udløberne af centrale neuroner, kombineret med en modificeret procedure UV-lysinduceret uncaging af glutamat, som giver pålidelig og fokal aktivering af glutamatreceptorer i vævet.
Den foreliggende undersøgelse viser, at SBFI er velegnet til to-foton-billeddannelse af intracellulære natrium transienter i små cellulære rum. Det skal holdes for øje, dog, at kvante effektivitet SBFI er temmelig lav 15 og relative ændringer i natrium koncentrationen er ganske små med fysiologisk aktivitet. Således høj opløsning måling af Na + transienter i fine processer er en relativt kedelig opgave, og Binning eller gennemsnitsberegning af flere forsøg, kan være nødvendig for at opnå tilfredsstillende signaler. Desuden kinetik natrium transienter er overraskende langsomt, hvilket gør det obligatorisk at optage i længere tidsperioder. Denne observation svarer til dem, der i tidligere studier, hvor monoeksponentiel henfald af natrium transienter i neuronale dendritter og i astrocytter blev præget af store henfald tidskonstanter i størrelsesordenen 10 sekunder ved stuetemperatur 1,2,6. Natrium transienter synes således at lægge en meget langsommere tid coUrse og meget større henfald tidskonstanter sammenlignet med calcium transienter 16.
Braklægning disse ulemper, natrium billeddannelse viser sig at være et værdifuldt værktøj til undersøgelse af fysiologiske egenskaber af neuronale underdomæner. For eksempel kan natrium billeddannelse tjene til at overvåge excitatorisk synaptisk aktivitet ved eller tæt på aktive synapser. Fordi natrium i det væsentlige ikke bufferet 8,17, er aktivitet-induceret natrium transienter lineært relateret til en bred vifte af synaptisk glutamatfrigivelse eller eksogent anvendt glutamat. De repræsenterer dermed direkte og upartiske indikatorer for neuronal glutamaterg aktivitet. Desuden natrium indikatorfarvestoffer udviser høj Kd 's (SBFI s Kd er i området fra 25 mM 1). Selv ved de relativt høje intracellulære farvestofkoncentrationer anvendes til at opnå tilstrækkelig lysstyrke (sædvanligvis 0,5-1 mM), den høje K d 's betyde, at farvestofferne ikke selv fungere som buffere til sodium. Derfor har de ikke fordrejer amplituden eller tidsforløbet af natrium transienter, som er altid en bekymring, når calcium-følsomme farvestoffer indføres i cellerne 18. Det kan således antages, at de påviste signaler repræsenterer en god målestok for den "rigtige" ændringer i intracellulær natrium. Deres langsomme tidsforløb så indebærer, at hastigheden til intracellulær diffusion for natrium i neuroner er meget mindre end tidligere antaget 19.
En kritisk forudsætning for en vellykket gennemførelse af forsøg omhandler egenskaberne af excitatoriske synaptiske transmission og natrium tilstrømning veje i pigge og dendritter er induktion af en hurtig og meget lokal aktivering af postsynaptiske strukturer. Dette kan opnås ved hurtig og lokal anvendelse af glutamat eller glutamat agonister i umiddelbar nærhed af en rygrad eller en dendritceller ved flash fotolyse af bur forbindelser. Flash fotolyse ikke mekanisk damage vævet, er fri bevægelighed artefakter og er veletableret til undersøgelse af relaterede spørgsmål (f.eks lokale calcium signalering). Diameteren af uncaging stedet var 1,5 um i xy-planet. Uncaging tæt på et tornede dendritceller inducerede natrium-signaler i begge pigge og moderselskabet dendritceller. Betragtninger signalerne tendens til at være størst i pigge tættest på uncaging stedet, amplituder i moderselskabet dendritceller og pigge længere væk var stadig temmelig ligner dem i umiddelbar nærhed af uncaging stedet. Uncaging blev udført i 300 msek hvorunder indadgående strømme steg i amplitude. Uncaged glutamat kan have spredt i vævet i den samme periode, aktivering ionotrope glutamatreceptorer og natrium tilstrømning på dendritiske regioner og udløberne længere væk fra uncaging stedet.
Et iboende problem, der opstår ved brug af en UV-laser til fotolyse bur indgivne forbindelser gennem cellen badopløsningener "indre filtrering". På grund af den høje absorptionshastighed af buret, er UV-lys dæmpes kraftigt undervejs fra målet til stimulering webstedet 20,21. En mulig måde at undgå dette er lokal perfusion med buret, der er begrænset kun til stimulering site, som desuden nedsætter mængden af bur forbindelse, der behøves til et minimum. I forhold til UV-laser-scanning-medieret uncaging, nær-infrarød to-foton uncaging 22 er rumligt mere præcist, navnlig fordi nøjagtigheden af stimulering øges i z-aksen. På den anden side, på grund af det lille tværsnit af almindeligt anvendte bure til længere bølgelængder, som er beskæftiget med to-foton excitering, enten en høj koncentration af det bur forbindelsen eller meget høj, der er brug for potentielt fototoksiske lysintensiteter. Også to-foton uncaging nødvendiggør en langt større investeringer i udstyr; blandt andre, er en yderligere IR-laser plus de nødvendige optiske komponenter, som er nødvendige.
Både SBFI og MNI-glutamat er samledes i samme bølgelængdeområde. Dette kan føre til en utilsigtet indbyrdes afhængighed af UV uncaging laser og SBFI eller IR-billeddannelse laser og MNI-glutamat, hvilket resulterer i blegning af SBFI af uncaging flash og / eller en kontinuerlig uncaging af glutamat ved den infrarøde stråle. Som vist i figur 6C, hverken UV-blitz med sig selv eller multi foton billeddannelse forårsaget sådanne gensidige virkninger under vore eksperimentelle betingelser.
UV-flash-systemer ligner den her beskrevne, anvendes rutinemæssigt i mange andre laboratorier og kan relativt let kan inkorporeres i en eksisterende multi-foton billedbehandling mikroskop. Det giver den fordel, at laserstrålen til fotolyse kan placeres frit i synsfeltet. Desuden er systemet giver mulighed for en hurtig og automatisk positionering af laserstrålen og frigivelse volumen, henholdsvis i synsfeltet i et eksperiment. Our modifikation forenkler og forbedrer præcis positionering af uncaging stedet, således at rammerne for den billeddannende software kan tjene til at justere billedbehandling og uncaging rammer coach.
Taget sammen helcelle-patch-clamp og multi-foton natrium billeddannelse i dendritter og udløberne af centrale neuroner, kombineret med en modificeret procedure UV-lysinduceret uncaging af glutamat, giver pålidelig og fokal aktivering af glutamatreceptorer i vævet. Det kan således tjene til at analysere egenskaberne af excitatorisk synaptisk transmission og postsynaptiske natrium-signaler i neuroner i den intakte væv.
The authors have nothing to disclose.
Denne undersøgelse blev støttet af en bevilling fra den tyske Science Foundation (DFG, Ro2327 / 6-1) til CRR Forfatterne ønsker at takke S. Durry og C. Roderigo for teknisk assistance, og M. Dübbert (Elektronik Laboratory, Zoologisk Institut , University of Köln, Tyskland) som hjælp i gennemførelsen af Pockets cellen controlleren og hf.
Hadrware/Software Component | Manufacturer | Type | Comment |
Borosilicate-glass capillaries | Hilgenberg | 1405059 | 75 mm x 2 mm, wall thickness 0.3 mm |
Camera | Jenoptik | ProgRes MF | IR-DIC compatible camera |
Deconvolution software | SVI | Huygens Pofessional X11 | |
Fiber optic spectrometer | Ocean Optics | USB 4000 | Miniature fiber optic spectrometer |
Filter tubes | VWR | cenrifugal filter, 0.2 µm | |
Imaging software | Olympus Europe | Flowview Ver 5.0c, Tiempo | |
IR beam power controller | Custom built | Laser beam intensity control + fast switch to zero on flyback via pockels cell | |
IR laser | SpectraPhysics | Mai-Tai VF-N1S | fs-pulsed Ti:Sa tunable laser (710-990 nm); CAUTION |
IR power monitor | Custom built | ||
Micromanipulator | Burleigh | PCS 5000 | |
Microscope/Imaging System | Olympus Europe | BX51WI/FV300 | Both, the microscope and the imaging systems were strongly modified |
ND filter wheel | Newport | 50Q04AV.2 | UV fused silica, optical density 0.05-2.0 |
Objective | Nikon Instruments Europe | NIR Apo 60x/1.0w | |
Patch clamp amplifier | HEKA | EPC-10 | |
Pipette puller | Narishige | Model PP-830 | |
Pneumatic drug ejection system | NPI Electronic | PDES-DXH | |
Pockels cell | Conoptics | 350-80 LA-BK | EOM, used as fast switch and for power adjustment |
Pockels cell driver | Conoptics | M302-RM | High voltage differential amplifier |
Shutter | Vincent Associates | LS6ZM2 | ALMgF2-coated BeCu blades |
Shutter controller | Custom built | ||
Shutter driver | Vincent Associates | Uniblitz VCM D1 | |
Slicer / Vibratome | Thermo Scientific | Microm HM 650 V | |
Uncaging software | Rapp OptoElectronic | UGA40 1.1.2.6 + NetCam | |
UV laser | Rapp OptoElectronic | DL-355/10 | cw DPSSL Laser, 355 nm; 10 mW; CAUTION |
UV laser scanning system | Rapp OptoElectronic | UGA 40 | Galvanometric scanning system |
Name of Compound | Catalog Number | Comments/Description | |
CNQX | Sigma Aldrich | C-127 | AMPA receptor antagonist; CAUTION |
DL-AP5 | Alfa Aesar | J64210 | NMDA receptor antagonist; CAUTION |
SBFI K+ Salt | Teflabs | OO32 | |
TTX | Ascent Scientific | Asc-055 | Inhibitor of voltage-dependent Na+ channels; CAUTION |
NMI-caged-L-Glutamate | Torcis | 1490 | Caged glutamatereleased upon UV absobtion |