Nous décrivons la combinaison de l'effet des UV focal photo-activation de composés neuro-actif avec la cellule entière de patch-clamp et de l'imagerie multi-photons de transitoires de sodium intracellulaire dans les dendrites et les épines de neurones de l'hippocampe dans les tranches de tissu aiguë du cerveau de la souris.
Multi-photon microscopie à fluorescence a permis l'analyse de paramètres morphologiques et physiologiques des cellules du cerveau dans du tissu intact avec une résolution spatiale et temporelle élevée. Combiné avec l'électrophysiologie, il est largement utilisé pour étudier signaux calciques liées à l'activité dans de petits compartiments sous-cellulaires tels que des dendrites et des épines dendritiques. En plus des transitoires calciques, l'activité synaptique induit également des signaux de sodium post-synaptiques, dont les propriétés ne sont que peu compris. Ici, nous décrivons un procédé de cellule entière de patch-clamp et de l'image combinée sodium multi-photons dans les domaines de la micro-cellulaires des neurones centraux. En outre, on introduit une procédure modifiée de l'ultra-violet (UV) uncaging -light induite par du glutamate, qui permet une activation fiable et focale des récepteurs du glutamate dans le tissu. A cet effet, des enregistrements de cellules entières ont été effectués sur une subdivision corne d'Ammon (CA1) des neurones pyramidaux dans des coupes tissulaires aiguës de l'hippocampe de souris. Les neurones ont été remplis avec le colorant fluorescent SBFI sensible du sodium à travers le patch-pipette, et multi-photon excitation de SBFI permis la visualisation des dendrites et des épines adjacentes. Pour établir uncaging focal induite par les UV, de plusieurs paramètres, y compris l'intensité de la lumière, le volume affecté par le faisceau de uncaging UV, le positionnement de la poutre ainsi que la concentration du composé en cage ont été testés et optimisés. Nos résultats montrent que la perfusion locale avec le glutamate cage (INM-glutamate) et son résultat uncaging-UV focal courants entrants et les transitoires de sodium dans les dendrites et des épines. Evolution dans le temps et l'amplitude des deux courants entrants et des signaux de sodium sont en corrélation avec la durée de l'impulsion uncaging. De plus, nos résultats montrent que les signaux de sodium intracellulaires sont bloquées, en présence d'inhibiteurs de récepteurs ionotropiques du glutamate, ce qui montre qu'ils sont médiés par l'influx de sodium bien que cette voie. En résumé, notre méthode fournit un outil fiable pour larecherche de signaux de sodium intracellulaires induits par l'activation du récepteur correspondant dans le tissu cérébral intact.
Les améliorations récentes des techniques de microscopie optique telles que la microscopie multi-photons ont permis l'étude des paramètres morphologiques et physiologiques de cellules du cerveau dans le tissu intact avec une résolution spatiale et temporelle. Combiné avec l'électrophysiologie, ces techniques sont aujourd'hui largement utilisés pour analyser les signaux électriques liés à l'activité de neurones ainsi que des signaux de calcium concomitants dans de petits compartiments sous-cellulaires, à savoir dans les dendrites fines et épines dendritiques. En plus de transitoires de calcium, l'activité synaptique induit également des signaux de sodium dans les dendrites et des épines, dont les propriétés sont en grande partie inexploré. De tels signaux peuvent être analysés par imagerie à deux photons de sodium intracellulaire ([Na +] i) qui permet la mesure en ligne de la [Na +] i transitoires pendant des périodes prolongées sans décoloration significative de colorant ou photo-endommagement 1,2.
Pour l'imagerie de i [Na +] </sub>, à seulement quelques colorants indicateurs chimiques sont disponibles, par exemple Corona vert ou Asante Natrium vert 3,4. La sonde fluorescente le plus couramment utilisé pour Na + est de l'isophtalate de benzofurane imagerie (SBFI) de liaison du sodium. C'est un quotientométrique, excité-UV colorant similaire à la célèbre colorant sensible au calcium fura-2 et a été utilisé pour l'imagerie conventionnelle Na + dans de nombreux types de cellules (par exemple 5,6). Il existe différentes possibilités d'exciter le colorant et la perception de sa fluorescence. Si une haute résolution temporelle (ie un taux de rafraîchissement élevé d'imagerie) est nécessaire en combinaison avec l'information spatiale, SBFI peut être excité par une lampe à arc au xénon ou une diode (LED) dispositif émettant de la lumière de forte puissance et son émission détectée avec une charge à haute vitesse dispositif -coupled (CCD) de 7,8. Pour une résolution spatiale maximale en profondeur dans le tissu, la microscopie à balayage laser multi-photonique est la méthode de choix 9. La relativement faible véhicu quantiquence de SBFI nécessite des concentrations relativement élevées de colorant (0,5 à 2 mm), et un chargement direct de la forme de SBFI membrane imperméable par une forte microélectrodes 10 ou la pipette en patch 1.
Utilisation SBFI, des travaux antérieurs effectués dans des tranches de tissu aigus de l'hippocampe de rongeurs démontré transitoires de sodium liées à l'activité dans les dendrites et les épines des neurones pyramidaux CA1 qui sont principalement causées par des afflux de sodium par ionotropique récepteurs NMDA 1,2. Pour l'étude des propriétés de ces signaux locaux de sodium de façon plus détaillée, l'activation spécifique des récepteurs post-synaptiques par application d'agonistes du récepteur est un procédé bien adapté de choix. Pour imiter l'activité présynaptique et la libération du transmetteur, l'application devrait être relativement brève et ciblée pour permettre la stimulation locale. Ceci, toutefois, se révèle être très difficile dans le tissu intact. Application d'une pression locale d'agonistes des récepteurs à l'aide d'une pipette à pointe fine permet ap très focalplication, mais accueille le risque potentiel pour produire le mouvement de la structure d'intérêt (par exemple, comme une dendrite ou épines dendritiques), et donc empêche l'imagerie haute résolution. La pertinence de l'ionophorèse de substances neuro-actif dépend de leurs propriétés électriques et amplitudes de courant élevées peut produire des artefacts cellulaires ainsi.
Une façon de contourner ces obstacles est l'emploi des composés photo-actif et leur photolyse flash. Fondamentalement, deux principes différents sont utilisés pour la photo-activation des substances en cage: I) grand champ photolyse éclair 11 et II) uncaging focale utilisant des modules de balayage en combinaison avec des lasers 12. Bien que grand champ photolyse éclair est utilisé pour activer les grandes régions d'intérêt, par exemple une cellule entière, uncaging focal est utilisé pour stimuler spécifiquement les petits compartiments cellulaires. Dans la présente étude, nous démontrons une procédure de cellules entières de patch-clamp et multi-pimagerie de sodium dans Hoton dendrites et des épines de neurones centraux, combinée à une procédure modifiée pour uncaging induite à la lumière UV-de glutamate, ce qui permet l'activation et fiable focal des récepteurs du glutamate dans le tissu.
La présente étude montre que SBFI est bien adapté pour l'imagerie à deux photons des transitoires de sodium intracellulaire dans de petits compartiments cellulaires. Il doit être gardé à l'esprit, cependant, que le rendement quantique de SBFI est plutôt faible et 15 par rapport l'évolution de la concentration de sodium sont assez petites avec une activité physiologique. Ainsi, la mesure haute résolution des transitoires Na + dans les processus de qualité est une tâche relativement fastidieuse, et binning ou moyenne de plusieurs essais peuvent être nécessaires pour obtenir des signaux satisfaisants. En outre, la cinétique des phénomènes transitoires de sodium sont étonnamment faible, ce qui rend obligatoire à enregistrer pendant des périodes de temps prolongées. Cette observation correspond à ceux d'études antérieures, où la pourriture monoexponentielle des transitoires de sodium dans les dendrites neuronales et dans les astrocytes a été caractérisée par de grandes constantes de temps de décroissance de l'ordre de 10 secondes à la température ambiante 1,2,6. transitoires de sodium semblent donc exercer une coopérative de temps beaucoup plus lenturse et beaucoup plus grandes constantes de temps de décroissance par rapport à des transitoires de calcium 16.
Mettez de côté ces inconvénients, l'imagerie de sodium se révèle être un outil précieux pour l'étude des propriétés physiologiques des sous-domaines neuronales. Par exemple, l'imagerie de sodium peut servir à surveiller l'activité synaptique excitatrice au niveau ou à proximité de synapses actives. Parce que le sodium est essentiellement non tamponnée 8,17, transitoires de sodium induite par l'activité-sont liés de façon linéaire à un large éventail de la libération de glutamate synaptique ou exogène glutamate appliquées. Ils représentent donc des indicateurs directs et impartiaux sur l'activité glutamatergique des neurones. En outre, l'indicateur de sodium colorants présentent de haute K d (K le d de SBFI est de l'ordre de 25 mM 1). Même à des concentrations de colorant intracellulaires relativement élevées utilisées pour obtenir suffisamment de luminosité (en général 0,5 à 1 mM), la K élevé d 's impliquent que les colorants eux-mêmes n'agissent pas comme des tampons pour sodieux. Par conséquent, ils ne faussent pas le cours de l'amplitude, ni le temps de transitoires de sodium, qui est toujours un sujet de préoccupation quand colorants sensibles au calcium sont introduits dans les cellules 18. On peut donc supposer que les signaux détectés représentent un bon indicateur des changements «réels» en sodium intracellulaire. Leur évolution temporelle lente implique alors que la vitesse de diffusion de sodium intracellulaire dans les neurones est beaucoup plus faible que précédemment supposé 19.
Une exigence essentielle pour la bonne exécution des expériences portant sur les propriétés de transmission et afflux de sodium voies synaptiques excitateurs dans les épines et les dendrites est l'induction d'une activation rapide et très localisée des structures post-synaptiques. Ceci peut être obtenu par l'application rapide et locale de glutamate ou agonistes à proximité immédiate d'une colonne vertébrale ou une dendrite par la photolyse flash de composés en cage. Photolyse éclair ne dama pas mécaniquementge le tissu, est libre d'artefacts de mouvement et est bien établie pour l'enquête de questions connexes (par exemple la signalisation calcique locale). Le diamètre de la tache uncaging était de 1,5 um dans le plan xy. Uncaging près d'un des signaux de sodium épineux dendrites induites dans les deux épines et la dendrite mère. Alors que les signaux ont tendance à être plus grand dans les épines les plus proches de l'endroit uncaging, les amplitudes dans la dendrite mère et les épines les plus éloignées étaient encore assez semblables à ceux à proximité directe de la place uncaging. Uncaging a été effectuée pour 300 ms au cours de laquelle courants entrants ont augmenté en amplitude. Glutamate Uncaged aurait diffusé dans le tissu au cours de la même période, l'activation de récepteurs ionotropiques du glutamate et afflux de sodium sur les régions et les épines dendritiques plus loin de la place uncaging.
Un problème intrinsèque qui se produit lors de l'utilisation d'un laser UV pour la photolyse de composés en cage administrés à travers la solution de bain de celluleest «filtrage interne. En raison de la vitesse de la cage d'absorption élevée, une lumière UV est atténué fortement le long de la voie à partir de l'objectif vers le site de stimulation 20,21. Une façon possible d'éviter cela est perfusion locale de la cage qui est limité seulement au site de stimulation, ce qui réduit en outre la quantité de composé nécessaire pour une cage minimum. Par rapport à uncaging UV à balayage laser à médiation, proche infra-rouge à deux photons uncaging 22 est spatialement plus précise, principalement parce que la précision de la stimulation est augmentée dans l'axe z. D'autre part, en raison de la faible section des cages couramment utilisés pour des longueurs d'onde utilisées comme avec excitation à deux photons, soit une forte concentration du composé en cage ou très élevée, des intensités de lumière potentiellement phototoxiques sont nécessaires. En outre, deux photons uncaging nécessite un investissement beaucoup plus élevé dans l'équipement; entre autres, un laser IR supplémentaire en plus des composants optiques nécessaires, il faut.
Les deux SBFI et MNI-glutamate sont excitables dans la gamme de longueur d'onde identique. Cela peut conduire à une interdépendance involontaire du laser UV et uncaging SBFI laser ou d'imagerie infrarouge et MNI-glutamate, ce qui entraîne le blanchiment de SBFI uncaging par le flash et / ou un uncaging continu de glutamate par les rayons infrarouges. Cependant, comme le montre la figure 6C, ni un flash UV par lui-même, ni d'imagerie photonique plusieurs causé ces effets réciproques dans nos conditions expérimentales.
Systèmes UV-flash similaires à celle décrite ici sont utilisées en routine dans de nombreux autres laboratoires et peuvent assez facilement être incorporés dans n'importe quel multi-photons imagerie microscope existant. Il offre l'avantage que le faisceau laser pour la photolyse peut être positionné librement dans le champ de vision. En outre, le système permet un repositionnement rapide et automatique du faisceau laser et le volume de sortie, respectivement, dans le champ de vision au cours de l'expérience. Oumodification de r simplifie et améliore le positionnement précis de l'endroit uncaging, de sorte que les images du logiciel d'imagerie peuvent servir à ajuster imagerie et uncaging cadres congruente.
L'ensemble de cellule entière de patch-clamp et d'imagerie de sodium à plusieurs photons dans les dendrites et les épines de neurones centraux, combiné avec un mode opératoire modifié pour uncaging induite par la lumière UV de glutamate, permet une activation fiable et focale des récepteurs du glutamate dans le tissu. Il peut donc servir à analyser les propriétés de la transmission synaptique excitatrice et de signaux de sodium dans les neurones post-synaptiques dans le tissu intact.
The authors have nothing to disclose.
Cette étude a été financée par une subvention de la Fondation allemande pour la science (DFG, Ro2327 / 6-1) à CRR Les auteurs tiennent à remercier S. Durry et C. Rodrigue pour l'assistance technique d'experts, et M. Dubbert (Laboratoire d'Electronique, Institut de zoologie , Université de Cologne, Allemagne) pour l'aider à mettre en œuvre le contrôleur de cellule de Pockels et le commutateur HF.
Hadrware/Software Component | Manufacturer | Type | Comment |
Borosilicate-glass capillaries | Hilgenberg | 1405059 | 75 mm x 2 mm, wall thickness 0.3 mm |
Camera | Jenoptik | ProgRes MF | IR-DIC compatible camera |
Deconvolution software | SVI | Huygens Pofessional X11 | |
Fiber optic spectrometer | Ocean Optics | USB 4000 | Miniature fiber optic spectrometer |
Filter tubes | VWR | cenrifugal filter, 0.2 µm | |
Imaging software | Olympus Europe | Flowview Ver 5.0c, Tiempo | |
IR beam power controller | Custom built | Laser beam intensity control + fast switch to zero on flyback via pockels cell | |
IR laser | SpectraPhysics | Mai-Tai VF-N1S | fs-pulsed Ti:Sa tunable laser (710-990 nm); CAUTION |
IR power monitor | Custom built | ||
Micromanipulator | Burleigh | PCS 5000 | |
Microscope/Imaging System | Olympus Europe | BX51WI/FV300 | Both, the microscope and the imaging systems were strongly modified |
ND filter wheel | Newport | 50Q04AV.2 | UV fused silica, optical density 0.05-2.0 |
Objective | Nikon Instruments Europe | NIR Apo 60x/1.0w | |
Patch clamp amplifier | HEKA | EPC-10 | |
Pipette puller | Narishige | Model PP-830 | |
Pneumatic drug ejection system | NPI Electronic | PDES-DXH | |
Pockels cell | Conoptics | 350-80 LA-BK | EOM, used as fast switch and for power adjustment |
Pockels cell driver | Conoptics | M302-RM | High voltage differential amplifier |
Shutter | Vincent Associates | LS6ZM2 | ALMgF2-coated BeCu blades |
Shutter controller | Custom built | ||
Shutter driver | Vincent Associates | Uniblitz VCM D1 | |
Slicer / Vibratome | Thermo Scientific | Microm HM 650 V | |
Uncaging software | Rapp OptoElectronic | UGA40 1.1.2.6 + NetCam | |
UV laser | Rapp OptoElectronic | DL-355/10 | cw DPSSL Laser, 355 nm; 10 mW; CAUTION |
UV laser scanning system | Rapp OptoElectronic | UGA 40 | Galvanometric scanning system |
Name of Compound | Catalog Number | Comments/Description | |
CNQX | Sigma Aldrich | C-127 | AMPA receptor antagonist; CAUTION |
DL-AP5 | Alfa Aesar | J64210 | NMDA receptor antagonist; CAUTION |
SBFI K+ Salt | Teflabs | OO32 | |
TTX | Ascent Scientific | Asc-055 | Inhibitor of voltage-dependent Na+ channels; CAUTION |
NMI-caged-L-Glutamate | Torcis | 1490 | Caged glutamatereleased upon UV absobtion |