हम पूरे सेल पैच दबाना और माउस मस्तिष्क के तीव्र ऊतक स्लाइस में डेन्ड्राइट और hippocampal न्यूरॉन्स का कांटा में intracellular सोडियम यात्रियों की बहु फोटॉन इमेजिंग के साथ न्यूरो सक्रिय यौगिकों का केन्द्र यूवी प्रेरित फोटो सक्रियण के संयोजन का वर्णन.
मल्टी फोटॉन प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी उच्च स्थानिक और लौकिक संकल्प के साथ बरकरार ऊतक में मस्तिष्क कोशिकाओं के रूपात्मक और शारीरिक मापदंडों का विश्लेषण सक्षम है. इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के साथ संयुक्त, यह व्यापक रूप से dendrites और वृक्ष के समान spines के रूप में छोटे subcellular डिब्बों में गतिविधि से संबंधित कैल्शियम संकेतों का अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है. कैल्शियम यात्रियों के अलावा, synaptic गतिविधि भी पोस्टअन्तर्ग्रथनी सोडियम संकेत, केवल मामूली समझ रहे हैं, जिनमें से गुण लाती है. यहाँ, हम केंद्रीय न्यूरॉन्स के सेलुलर सूक्ष्म डोमेन में संयुक्त पूरे सेल पैच दबाना और बहु फोटॉन सोडियम इमेजिंग के लिए एक विधि का वर्णन. इसके अलावा, हम ऊतक में ग्लूटामेट रिसेप्टर्स की विश्वसनीय और फोकल सक्रियण की अनुमति देता है जो अल्ट्रा वायलेट (यूवी) ग्लूटामेट की -light प्रेरित uncaging, के लिए एक संशोधित प्रक्रिया परिचय. इसके लिए पूरे सेल रिकॉर्डिंग कोर्नु एम्मोनिस उपखंड 1 (सीए 1) के तीव्र ऊतक स्लाइस में पिरामिड न्यूरॉन्स पर प्रदर्शन किया गयामाउस हिप्पोकैम्पस. न्यूरॉन्स पैच विंदुक के माध्यम से सोडियम के प्रति संवेदनशील फ्लोरोसेंट रंजक SBFI से भरा है, और SBFI की बहु फोटॉन उत्तेजना डेन्ड्राइट और आसन्न कांटा के दृश्य सक्षम थे. यूवी प्रेरित फोकल uncaging स्थापित करने के लिए, प्रकाश तीव्रता, यूवी uncaging किरण से प्रभावित मात्रा बीम की स्थिति के साथ ही बंदी परिसर की एकाग्रता सहित कई मानकों का परीक्षण किया और अनुकूलित किया गया. हमारे परिणाम बंदी ग्लूटामेट (MNI-ग्लूटामेट) के साथ कि स्थानीय छिड़काव और dendrites और कांटा में आवक धाराओं और सोडियम यात्रियों में अपने फोकल यूवी uncaging परिणाम दिखाते हैं. टाइम कोर्स और आवक धाराओं और सोडियम संकेतों दोनों के आयाम uncaging नाड़ी की अवधि के साथ सहसंबंधी. इसके अलावा, हमारे परिणाम है कि वे इस मार्ग हालांकि सोडियम बाढ़ से मध्यस्थता कर रहे हैं कि प्रदर्शन, intracellular सोडियम संकेतों ionotropic ग्लूटामेट रिसेप्टर्स के लिए ब्लॉकर्स की उपस्थिति में अवरुद्ध कर रहे हैं कि दिखा. संक्षेप में, हमारे विधि के लिए एक विश्वसनीय उपकरण प्रदान करता हैबरकरार मस्तिष्क के ऊतकों में फोकल रिसेप्टर सक्रियण द्वारा प्रेरित intracellular सोडियम संकेतों की जांच.
ऐसे बहु फोटॉन माइक्रोस्कोपी के रूप में प्रकाश सूक्ष्म तकनीक में हाल ही के सुधार उच्च स्थानिक और लौकिक संकल्प के साथ बरकरार ऊतक में मस्तिष्क कोशिकाओं के रूपात्मक और शारीरिक मापदंड के अध्ययन के लिए सक्षम है. इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के साथ संयुक्त, इन तकनीकों अब व्यापक रूप से अर्थात् ठीक dendrites और वृक्ष के समान spines में, छोटे subcellular डिब्बों में न्यूरॉन्स पर गतिविधि से संबंधित विद्युत संकेतों के साथ ही सहवर्ती कैल्शियम संकेतों का विश्लेषण करने के लिए उपयोग किया जाता है. कैल्शियम यात्रियों के अलावा, synaptic गतिविधि भी dendrites और कांटा में सोडियम संकेत लाती है, जिनमें से गुण बड़े पैमाने पर बेरोज़गार हैं. ऐसे संकेत [ना +] महत्वपूर्ण डाई विरंजन या तस्वीर वाली क्षति 1,2 के बिना लंबी अवधि के लिए मैं यात्रियों की ऑन लाइन माप में सक्षम बनाता है जो intracellular सोडियम की दो photon इमेजिंग ([ना +] मैं) द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है.
[ना +] मैं की इमेजिंग के लिए </> उप, केवल कुछ रासायनिक सूचक रंजक, जैसे कोरोना ग्रीन या Asante नाट्रियम ग्रीन 3,4 उपलब्ध हैं. ना + इमेजिंग के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया फ्लोरोसेंट जांच सोडियम बाध्यकारी benzofuran isophthalate (SBFI) है. यह अच्छी तरह से ज्ञात कैल्शियम के प्रति संवेदनशील डाई Fura-2 के लिए इसी तरह की एक ratiometric, यूवी उत्साहित डाई और (जैसे 5,6) कई प्रकार की कोशिकाओं में पारंपरिक ना + इमेजिंग के लिए नियोजित किया गया है. रोमांचक डाई और उसके प्रतिदीप्ति इकट्ठा करने का अलग संभावनाएं हैं. उच्च अस्थायी समाधान (यानी एक उच्च इमेजिंग फ्रेम दर) स्थानिक जानकारी के साथ संयोजन में की आवश्यकता है, SBFI एक उच्च गति प्रभारी के साथ पकड़ा एक क्सीनन चाप दीपक या एक उच्च शक्ति प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एलईडी) डिवाइस और अपने उत्सर्जन के साथ उत्साहित हो सकते हैं -coupled डिवाइस (सीसीडी) कैमरा 7,8. गहरी ऊतक में अधिक से अधिक स्थानिक संकल्प के लिए, बहु फोटॉन लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी चुनाव 9 की विधि है. अपेक्षाकृत कम क्वांटम कुशल(- 2 मिमी 0.5), और एक तेज microelectrode 10 या पैच पिपेट 1 के माध्यम से SBFI की झिल्ली अभेद्य फार्म का सीधा लोडिंग SBFI की ncy अपेक्षाकृत उच्च डाई सांद्रता जरूरी.
SBFI का प्रयोग, कृंतक हिप्पोकैम्पस की तीव्र ऊतक स्लाइस में प्रदर्शन के पहले काम मुख्य रूप से 1,2 रिसेप्टर्स ionotropic NMDA के माध्यम से सोडियम की आमद की वजह से हैं जो CA1 पिरामिड न्यूरॉन्स की dendrites और कांटा में गतिविधि से संबंधित सोडियम यात्रियों का प्रदर्शन किया. और अधिक विस्तार में इस तरह के स्थानीय सोडियम संकेतों के गुणों के अध्ययन के लिए, रिसेप्टर एगोनिस्ट के आवेदन के द्वारा पोस्टअन्तर्ग्रथनी रिसेप्टर्स की विशिष्ट सक्रियण पसंद की एक अच्छी तरह से अनुकूल विधि है. Presynaptic गतिविधि और ट्रांसमीटर रिहाई की नकल करने के लिए, आवेदन अपेक्षाकृत संक्षिप्त होना और स्थानीय उत्तेजना सक्षम करने के लिए ध्यान केंद्रित करना चाहिए. यह, हालांकि, बरकरार ऊतक में काफी चुनौतीपूर्ण साबित होता है. एक ठीक इत्तला दे दी पिपेट का उपयोग रिसेप्टर एगोनिस्ट के स्थानीय दबाव आवेदन बहुत फोकल एपी सक्षम बनाता हैतह, लेकिन (जैसे एक डेन्ड्राइट या वृक्ष के समान spines के रूप में उदाहरण के लिए) ब्याज की संरचना के आंदोलन के उत्पादन के लिए संभावित जोखिम मेजबान, और इस प्रकार उच्च संकल्प इमेजिंग hinders. न्यूरो सक्रिय पदार्थों के योणोगिनेसिस की उपयुक्तता उनके बिजली के गुणों पर निर्भर करता है और उच्च वर्तमान आयाम के रूप में अच्छी तरह से सेलुलर कलाकृतियों का उत्पादन हो सकता है.
इन बाधाओं को नाकाम करने के लिए एक तरह से तस्वीर सक्रिय यौगिकों और उनके फ़्लैश photolysis का रोजगार है. असल में, दो अलग सिद्धांतों बंदी पदार्थों की तस्वीर वाली सक्रियण के लिए उपयोग किया जाता है: लेजर 12 के साथ संयोजन में स्कैनिंग मॉड्यूल को रोजगार आई) चौड़े क्षेत्र फ्लैश photolysis 11 और द्वितीय) फोकल uncaging. व्यापक क्षेत्र फ्लैश photolysis हित के व्यापक क्षेत्रों को सक्रिय करने के लिए प्रयोग किया जाता है, जैसे एक पूरे सेल, फोकल uncaging विशेष रूप से छोटे सेलुलर डिब्बों को प्रोत्साहित करने के लिए कार्यरत है. वर्तमान अध्ययन में हम पूरे सेल पैच दबाना और बहु पी के लिए एक प्रक्रिया का प्रदर्शनऊतक में ग्लूटामेट रिसेप्टर्स की विश्वसनीय और फोकल सक्रियण की अनुमति देता है जो ग्लूटामेट की यूवी प्रकाश प्रेरित uncaging, के लिए एक संशोधित प्रक्रिया के साथ संयुक्त डेन्ड्राइट और केंद्रीय न्यूरॉन्स का कांटा में hoton सोडियम इमेजिंग,.
वर्तमान अध्ययन SBFI छोटे सेलुलर डिब्बों में intracellular सोडियम यात्रियों की दो photon इमेजिंग के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है कि पता चलता है. यह SBFI की मात्रा दक्षता सोडियम एकाग्रता में जगह कम 15 और रिश्तेदार परिवर्तन शारीरिक गतिविधि के साथ काफी छोटे होते है, तथापि, कि ध्यान में रखा जाना है. इस प्रकार, ठीक प्रक्रियाओं में ना + यात्रियों के उच्च संकल्प माप एक अपेक्षाकृत कठिन काम है, और कई परीक्षणों के binning या औसत संतोषजनक संकेतों को प्राप्त करने के लिए आवश्यक हो सकता है. इसके अलावा, सोडियम यात्रियों के कैनेटीक्स विस्तारित समय अवधि के लिए रिकॉर्ड करने के लिए यह अनिवार्य बना, आश्चर्यजनक रूप से धीमी गति से कर रहे हैं. इस अवलोकन न्यूरोनल डेन्ड्राइट में और astrocytes में सोडियम यात्रियों की monoexponential क्षय कमरे के तापमान 1,2,6 पर 10 सेकंड की सीमा में बड़ी क्षय समय स्थिरांक की विशेषता थी जहां पहले के अध्ययनों में उन से मेल खाती है. सोडियम यात्रियों इस प्रकार एक बहुत धीमी समय सह लागू करने लगते हैंurse और कैल्शियम यात्रियों में 16 की तुलना में ज्यादा बड़ा क्षय समय स्थायी.
इन कमियों के अलग सेट, सोडियम इमेजिंग न्यूरोनल उप डोमेन के शारीरिक गुणों की जांच के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण साबित होता है. उदाहरण के लिए, सोडियम इमेजिंग में या करीबी सक्रिय synapses को उत्तेजक synaptic गतिविधि पर नजर रखने के लिए सेवा कर सकते हैं. सोडियम अनिवार्य रूप से 8,17 बफर नहीं है, क्योंकि गतिविधि प्रेरित सोडियम यात्रियों रैखिक synaptic ग्लूटामेट रिहाई की एक विस्तृत श्रृंखला से संबंधित या exogenously ग्लूटामेट लागू कर रहे हैं. वे इसलिए न्यूरोनल glutamatergic गतिविधि के प्रत्यक्ष और निष्पक्ष संकेतक का प्रतिनिधित्व करते हैं. इसके अलावा, सोडियम सूचक रंजक उच्च कश्मीर डी '(SBFI कश्मीर डी 25 की सीमा मिमी 1 में है) दिखा रहे हैं. (- 1 मिमी आमतौर पर 0.5), उच्च कश्मीर डी के रंगों को खुद S के लिए buffers के रूप में कार्य नहीं है मतलब है कि यहां तक कि पर्याप्त चमक को प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल अपेक्षाकृत उच्च intracellular डाई सांद्रता मेंघृणा. नतीजतन, वे कैल्शियम के प्रति संवेदनशील रंगों कोशिकाओं 18 में शुरू कर रहे हैं जब हमेशा एक चिंता का विषय है, जो सोडियम यात्रियों के आयाम और न ही समय पाठ्यक्रम बिगाड़ना नहीं है. यह इस प्रकार का पता चला संकेत intracellular सोडियम में "असली" परिवर्तन का एक अच्छा उपाय का प्रतिनिधित्व करते हैं कि माना जा सकता है. अपनी धीमी समय पाठ्यक्रम तो न्यूरॉन्स में सोडियम के लिए intracellular प्रसार के लिए वेग पहले 19 ग्रहण की तुलना में काफी छोटा होता है कि निकलता है.
कांटा और dendrites में उत्तेजक synaptic प्रसारण और सोडियम बाढ़ रास्ते के गुणों को संबोधित प्रयोगों के सफल क्रियान्वयन के लिए एक महत्वपूर्ण आवश्यकता पोस्टअन्तर्ग्रथनी संरचनाओं की एक तेजी से और अत्यधिक स्थानीयकृत सक्रियण के शामिल है. यह एक रीढ़ की प्रत्यक्ष आसपास या बंदी यौगिकों के फ्लैश photolysis द्वारा एक डेन्ड्राइट में ग्लूटामेट या ग्लूटामेट एगोनिस्ट की तेजी और स्थानीय आवेदन के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. फ्लैश photolysis नहीं यंत्रवत् दामा करता हैजीई ऊतक, आंदोलन कलाकृतियों से मुक्त है और अच्छी तरह से संबंधित सवालों की जांच के लिए (जैसे स्थानीय कैल्शियम संकेतन) की स्थापना की है. uncaging मौके का व्यास XY विमान में 1.5 माइक्रोन था. Uncaging दोनों कांटा में एक काँटेदार डेन्ड्राइट प्रेरित सोडियम संकेतों के करीब है और माता पिता डेन्ड्राइट. संकेत uncaging हाजिर करने के लिए करीब कांटा में सबसे बड़ा होने की प्रवृत्ति जबकि, माता पिता डेन्ड्राइट में आयाम और कांटा आगे भी दूर uncaging स्थान के प्रत्यक्ष आसपास के क्षेत्र में उन लोगों के लिए नहीं बल्कि इसी तरह के थे. Uncaging आवक धाराओं आयाम में वृद्धि हुई जिसके दौरान 300 मिसे के लिए प्रदर्शन किया था. Uncaged ग्लूटामेट आगे दूर uncaging मौके से वृक्ष के समान क्षेत्रों और कांटा पर ionotropic ग्लूटामेट रिसेप्टर्स और सोडियम बाढ़ को सक्रिय करने, एक ही समय अवधि के दौरान ऊतकों में दूर तक फैला हुआ है हो सकता है.
सेल स्नान समाधान के माध्यम से प्रशासित बंदी यौगिकों के photolysis के लिए एक यूवी लेजर का उपयोग तब होती है जब एक आंतरिक समस्या'आंतरिक छानने' है. क्योंकि पिंजरे के उच्च अवशोषण की दर से, पराबैंगनी प्रकाश उत्तेजना साइट 20,21 करने के उद्देश्य से जिस तरह से साथ दृढ़ता से तनु है. इस से बचने के लिए एक व्यवहार्य तरीका ही इसके अलावा कम से कम करने के लिए जरूरी बंदी यौगिक की मात्रा कम हो जाती है जो उत्तेजना साइट के लिए प्रतिबंधित है कि पिंजरे के साथ स्थानीय छिड़काव है. यूवी लेजर स्कैनिंग की मध्यस्थता uncaging, पास बुनियादी लाल दो फोटोन की तुलना में uncaging 22 उत्तेजना की सटीकता Z-अक्ष में वृद्धि हुई है, जिसका मुख्य कारण स्थानिक अधिक सटीक है. दूसरी ओर, कारण, दो photon उत्तेजना के साथ कार्यरत एक उच्च बंदी परिसर की एकाग्रता या बहुत अधिक है, या तो संभावित phototoxic प्रकाश तीव्रता आवश्यक हैं के रूप में लंबे समय तक तरंग दैर्ध्य के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किया पिंजरों के छोटे पार अनुभाग के लिए. इसके अलावा, दो photon uncaging उपकरण में एक बहुत अधिक निवेश जरूरी है; दूसरों के बीच में, एक अतिरिक्त आईआर लेजर प्लस आवश्यक ऑप्टिकल घटकों की जरूरत है,.
SBFI और MNI-ग्लूटामेट दोनों समान तरंगदैर्ध्य रेंज में उत्तेजनीय हैं. इस uncaging फ्लैश और / या आईआर किरण द्वारा ग्लूटामेट की एक सतत uncaging द्वारा SBFI की विरंजन, जिसके परिणामस्वरूप पराबैंगनी uncaging लेजर और SBFI या आईआर इमेजिंग लेजर और MNI-ग्लूटामेट की एक अनपेक्षित परस्पर निर्भरता को जन्म दे सकती है. चित्रा 6C में दिखाया गया है हालांकि, न तो खुद और न ही बहु फोटॉन इमेजिंग द्वारा एक यूवी फ्लैश हमारे प्रयोगात्मक शर्तों के तहत इस तरह के पारस्परिक प्रभाव के कारण होता है.
यहाँ वर्णित एक के समान यूवी फ़्लैश प्रणाली कई अन्य प्रयोगशालाओं में नियमित तौर पर इस्तेमाल कर रहे हैं और अपेक्षाकृत आसानी से किसी भी मौजूदा बहु फोटॉन इमेजिंग माइक्रोस्कोप में शामिल किया जा सकता है. यह photolysis के लिए लेजर बीम को देखने के क्षेत्र में स्वतंत्र रूप से तैनात किया जा सकता है कि लाभ प्रदान करता है. इसके अलावा, प्रणाली एक प्रयोग के दौरान देखने के क्षेत्र में क्रमश: लेजर बीम की एक तेजी से और स्वचालित repositioning और रिहाई मात्रा, सक्षम बनाता है. कहांआर संशोधन को सरल और इमेजिंग सॉफ्टवेयर के तख्ते congruently इमेजिंग और uncaging फ्रेम को समायोजित करने की सेवा कर सकते हैं, ताकि uncaging स्थान की सटीक स्थिति में सुधार.
साथ में ले ली, ग्लूटामेट की यूवी प्रकाश प्रेरित uncaging के लिए एक संशोधित प्रक्रिया के साथ संयुक्त डेन्ड्राइट और केंद्रीय न्यूरॉन्स का कांटा में पूरे सेल पैच दबाना और बहु फोटॉन सोडियम इमेजिंग,, ऊतक में ग्लूटामेट रिसेप्टर्स की विश्वसनीय और फोकल सक्रियण की अनुमति देता है. यह इस प्रकार बरकरार ऊतक में न्यूरॉन्स में उत्तेजक synaptic प्रसारण की और पोस्टअन्तर्ग्रथनी सोडियम संकेतों के गुणों का विश्लेषण करने के लिए सेवा कर सकते हैं.
The authors have nothing to disclose.
इस अध्ययन के लेखकों एस Durry और सी Roderigo विशेषज्ञ तकनीकी सहायता के लिए, और एम Dübbert (इलेक्ट्रॉनिक्स प्रयोगशाला, प्राणी संस्थान का शुक्रिया अदा करना चाहते सीआरआर को जर्मन विज्ञान फाउंडेशन (DFG, Ro2327 / 6-1) का अनुदान द्वारा समर्थित किया गया Pockels सेल नियंत्रक और HF स्विच को लागू करने में मदद के लिए कोलोन विश्वविद्यालय, जर्मनी).
Hadrware/Software Component | Manufacturer | Type | Comment |
Borosilicate-glass capillaries | Hilgenberg | 1405059 | 75 mm x 2 mm, wall thickness 0.3 mm |
Camera | Jenoptik | ProgRes MF | IR-DIC compatible camera |
Deconvolution software | SVI | Huygens Pofessional X11 | |
Fiber optic spectrometer | Ocean Optics | USB 4000 | Miniature fiber optic spectrometer |
Filter tubes | VWR | cenrifugal filter, 0.2 µm | |
Imaging software | Olympus Europe | Flowview Ver 5.0c, Tiempo | |
IR beam power controller | Custom built | Laser beam intensity control + fast switch to zero on flyback via pockels cell | |
IR laser | SpectraPhysics | Mai-Tai VF-N1S | fs-pulsed Ti:Sa tunable laser (710-990 nm); CAUTION |
IR power monitor | Custom built | ||
Micromanipulator | Burleigh | PCS 5000 | |
Microscope/Imaging System | Olympus Europe | BX51WI/FV300 | Both, the microscope and the imaging systems were strongly modified |
ND filter wheel | Newport | 50Q04AV.2 | UV fused silica, optical density 0.05-2.0 |
Objective | Nikon Instruments Europe | NIR Apo 60x/1.0w | |
Patch clamp amplifier | HEKA | EPC-10 | |
Pipette puller | Narishige | Model PP-830 | |
Pneumatic drug ejection system | NPI Electronic | PDES-DXH | |
Pockels cell | Conoptics | 350-80 LA-BK | EOM, used as fast switch and for power adjustment |
Pockels cell driver | Conoptics | M302-RM | High voltage differential amplifier |
Shutter | Vincent Associates | LS6ZM2 | ALMgF2-coated BeCu blades |
Shutter controller | Custom built | ||
Shutter driver | Vincent Associates | Uniblitz VCM D1 | |
Slicer / Vibratome | Thermo Scientific | Microm HM 650 V | |
Uncaging software | Rapp OptoElectronic | UGA40 1.1.2.6 + NetCam | |
UV laser | Rapp OptoElectronic | DL-355/10 | cw DPSSL Laser, 355 nm; 10 mW; CAUTION |
UV laser scanning system | Rapp OptoElectronic | UGA 40 | Galvanometric scanning system |
Name of Compound | Catalog Number | Comments/Description | |
CNQX | Sigma Aldrich | C-127 | AMPA receptor antagonist; CAUTION |
DL-AP5 | Alfa Aesar | J64210 | NMDA receptor antagonist; CAUTION |
SBFI K+ Salt | Teflabs | OO32 | |
TTX | Ascent Scientific | Asc-055 | Inhibitor of voltage-dependent Na+ channels; CAUTION |
NMI-caged-L-Glutamate | Torcis | 1490 | Caged glutamatereleased upon UV absobtion |