Introduction
O transplante hepático (transplante hepático ortotópico) é a única opção de tratamento para pacientes com doença hepática em estágio final ou carcinoma hepatocelular avançado. Para os últimos 25 anos, o número de candidatos na lista de espera tem aumentado gradualmente e agora excede em muito o número de enxertos disponíveis. Na maioria das regiões de transplante, de 20 a 30% dos pacientes em lista de espera para transplante de fígado morrem sem receber um transplante de órgão ou são excluídos devido à progressão da doença. Estratégias para aumentar a lista de dadores e, assim, o número de enxertos disponíveis, são desesperadamente necessários. Critérios de alocação de órgãos estendidas, de preservação do enxerto prolongado, e de indução de tolerância imunológica ainda representam grandes desafios clínicos 1-3. Por isso, a investigação experimental transplante hepático ortotópico é fundamental, a fim de otimizar a prática clínica transplante hepático ortotópico.
Porcina transplante hepático ortotópico é um modelo experimental bem estabelecido que se assemelha o transplante hepático ortotópico humana em muitos aspectos, incluindo a Ltamanho iver, anatomia, fisiologia e 4-6. Assim, tornou-se um método experimental padrão em campos de pesquisa, tais como técnicas cirúrgicas, fisiologia, imunologia, preservação e lesão de isquemia-reperfusão. Numerosas técnicas de aquisição de enxerto, hepatectomia destinatário e, em particular, a reconstrução vascular, foram descritos na literatura 5. A escolha da técnica apropriada varia de acordo com a preferência do pesquisador e capacidade técnica.
Em contraste com a situação humana, congestão splanchnic durante a fase anepática representa um problema importante no transplante hepático ortotópico porcino. Isquemia intestinal subsequente e dano vascular congestiva pode causar instabilidade hemodinâmica grave, comprometendo a sobrevivência de porco e, assim, o sucesso da experiência 7-9. Portanto, a descompressão intestinal suficiente é obrigatória, especialmente em ambientes experimentais tecnicamente menos refinados.
Nósing um ativo shunt porto-cava-jugular para a duração da fase de anepática é uma opção confiável para evitar o congestionamento intestinal. O sistema pode ser usado para as experiências iniciais de reperfusão, bem como cenários de sobrevivência a longo prazo. O protocolo a seguir contém todas as informações para um modelo estável e reprodutível transplante de fígado em suínos, incluindo os contratos fígado do doador, operação destinatário, incluindo hepatectomia e técnicas de reconstrução navio end-to-end, e cuidados pós-operatórios.
Protocol
Todos os animais receberam cuidados de acordo com os '' Princípios do Laboratório Animal Care '' formuladas pela Sociedade Nacional de Pesquisa Médica e da '' Guia para o Cuidado de Animais de Laboratório '' publicado pelo National Institutes of Health, Ontario, Canada . O Comité do Instituto Geral de Toronto Research Animal Care aprovado todos os estudos.
1. Órgão Retrieval
- Casa do sexo masculino porcos Yorkshire entre 30 e 35 kg no centro de pesquisa para uma semana antes do transplante para evitar uma reação física induzida por estresse (que pode alterar o resultado da perfusão 10,11) e para aclimatar os animais para as condições de habitação. Jejuar o porco por um período mínimo de 6 horas antes da indução da anestesia.
- Anestesiar do porco dador por uma injecção intramuscular (im) injecção de uma mistura de cetamina (25 mg / kg), a atropina (0,04 mg / kg) e midazolam (0,15 mg / kg). Antes de intubação, garantir o porco respira espontaneamente 2 L de oxigênio doseado com 5% de isoflurano. Em decúbito dorsal, pulverizar as cordas vocais com lidocaína a 2% 2 min antes da intubação para evitar espasmos nas cordas vocais. Para um 35 kg porco, usar um tubo traqueal 6,5 Fr. Bloquear o tubo traqueal com 3-5 ml de ar ambiente.
- Após a intubação, use capnometria para confirmar a intubação correta. Monitorar a freqüência cardíaca e saturação de oxigênio por oximetria de pulso em rabo de porco. Abaixe o vaporizador isoflurano a 2%.
- Ajustar a profundidade de anestesia por valores de concentração alveolar mínima (MAC); apontar para 2-2,5 MAC. Definir o ventilador para 14-16 respirações / min e um volume corrente de 10 - 15 ml / kg de peso corporal.
- Inserir um 18 L intravenosa (iv) do cateter numa das veias da orelha para permitir a infusão de solução de Lactato de Ringer (200 ml / h). Esfregue o porco e cobri-lo com campos estéreis.
- Depois de garantir condições estéreis, fazer uma laparotomia mediana folloconduzido por uma extensão lateral esquerda. Use uma toalha para cobrir grandes e pequenas intestinos antes de movê-los para o lado esquerdo.
- Divida o ligamento falciforme eo ligamento triangular usando um cautério.
- Solte o fígado a partir do diafragma do lado direito usando um eletro-cautério; usar a tesoura para a parte superior, entre a veia e diafragma. Dissecar a veia infrahepatic baixo para o ramo da veia adrenal no lado direito ea veia renal do lado esquerdo.
- Separa-se a cava e na aorta distai infrahepatic um do outro; ligadura ramos da aorta para a coluna; isolar e artérias renais livres do tecido aderente. Cerque cada artéria renal com um empate 2-0.
- Craniana à veia renal esquerda, dissecção da aorta e da artéria mesentérica. Cerque a artéria mesentérica com um empate 2-0.
- Depois de abrir o crânio peritônio à artéria mesentérica, siga com atenção a aorta para o tronco celíaco. Dissecar o tronco celíaco caudalmente ao portal veno; rodeiam as artérias esplênica e gástrica esquerda, que posteriormente sucursal fora do tronco celíaco. Dissecar o tronco celíaco fora da veia portal.
- Solte a veia porta por uma incisão peritoneal entre o pâncreas ea veia portal. Tie fora veias de drenagem do pâncreas para a veia porta.
- Separe o ducto biliar do ligamento hepatoduodenal e dividi-lo distally após a ligadura.
- Ligadura dos vasos linfáticos dentro do ligamento hepatoduodenal para evitar vazamento linfático. Divida a artéria gastroduodenal e artérias gástrica direita entre laços. Ligadura veias menores.
- Dissecar a aorta por trás do diafragma entre o coração eo tronco celíaco. Coloque um empate 2-0 ao redor da aorta cranial para o tronco celíaco.
- Remover a vesícula biliar e cauterizar o sangramento do leito da vesícula biliar.
- Abra o diafragma. Administrar 1000 UI / kg de peso do dador de heparina intracardial ou iv Definir isoflurano a 5% (> 2,5 MAC), a fim de alcançarum nível maior do anestésico. Para um doador após a morte circulatório (DCD) modelo, induzir uma parada cardíaca por injeção intracardíaca de 40 mval KCl 3 min após a administração de heparina. Definir parada cardíaca como o ponto de partida da isquemia quente.
- Amarre os laços previamente definidos em todo o renal, baço, mesentérica, e artérias gástricas esquerdas. Tie fora da aorta, distalmente entre renais e artérias ilíacas e canular a aorta com uma linha de limpeza de órgãos.
- Tie fora da veia porta como proximal possível e canular-lo com outro órgão resplendor linha.
- Depois de fechar o empate pré-definido ao redor da aorta proximal, lave o fígado com 2 L de frio Universidade de solução (UW) Wisconsin usando dupla perfusão via aorta (saco de pressão) e veia porta (orientada por gravidade).
- Extirpar o fígado, deixando os restantes navios de comprimento. Deixe um aro diafragmática generoso ao redor da veia supra-hepática. Inserir o fígado para um saco estéril de órgãos em gelo.
- Durante back-mesa preparação, clamplificar a veia suprahepática usando uma braçadeira Satinsky e lave o fígado uma segunda vez com cerca de 0,5 L de solução de UW retrogradamente através da veia cava inferior até que a saída inferior da veia portal é clara.
- Empate fora todos os ramos arteriais da aorta e tronco celíaco. Executar uma perfusão pressão arterial back-mesa com os restantes 0,5 L de solução UW 12.
- Lave o ducto biliar usando solução UW.
- Apare o patch diafragmática para um tamanho decente. Feche todas as veias frênico - geralmente 3, 1 cada esquerda e direita, e um posterior - usando 4-0 pontos de monofilamento de polipropileno.
- Feche o saco e armazenar o órgão fígado em gelo.
2. Destinatário Hepatectomia
- Anestesiar do porco receptor através de uma injecção intramuscular de uma mistura de cetamina (25 mg / kg), a atropina (0,04 mg / kg) e midazolam (0,15 mg / kg).
- Coloque o porco em posição supina numa mesa cirúrgica em cima de um tapete de aquecimento. Cubra o wi-gusath um cobertor de circulação de calor.
- Antes de intubação, garantir o porco respira espontaneamente 2 L de oxigênio doseado com 5% de isoflurano. Pulverizar as cordas vocais com lidocaína a 2% 2 min antes da intubação para evitar espasmos nas cordas vocais. Para um 35 kg porco, usar um tubo traqueal 6,5 Fr. Bloquear o tubo traqueal com 3-5 ml de ar ambiente.
- Após a intubação, use capnometria para confirmar a intubação correta. Monitorar a freqüência cardíaca e saturação de oxigênio por oximetria de pulso em rabo de porco. Coloque e fixar uma sonda de temperatura no focinho do porco. Abaixe o vaporizador isoflurano a 2% (o objectivo para 2-2,5 MAC). Definir o ventilador para 14-16 respirações / min e um volume corrente de 10 - 15 ml / kg de peso corporal.
- Use pomada nos olhos para evitar a secura sob anestesia.
- Utilize uma técnica de Seldinger 13 para inserir um indutor bainha (8,5 Fr) na veia jugular externa esquerda. Utilize este cateter mais tarde para uma derivação portal-cava-jugular ativa.
- Use Seldinger technique inserir uma nutrição parentérica (NPT) cateter total (9,5 Fr) na veia jugular externa direita.
- Sob condições estéreis, dissecção da artéria carótida direita e inserir um cateter de polipropileno (18 L) para monitorização da pressão arterial invasivo. Cerque a artéria com um empate 2-0 seda para permitir a ligação de emergência.
- Desligar o vaporizador isoflurano a 1% (1,5-2 MAC) e adicionar o propofol (5-8 mg / kg / h IV) para manter a profundidade da anestesia. Para analgesia, utilização em infusão contínua iv de citrato de fentanil (mais preferido, 2 ug / kg / h) ou de remifentanil (segunda escolha, 15 ug / kg / h).
- Antes de incisão na pele, dar 1,000 mg de cefuroxima e 500 mg de metronidazol iv. Configurar uma bomba de infusão usando Lactato de Ringer com glicose a 5% em 150 ml / hr.
- Coloque o cobertor de circulação de calor para a área da cabeça e pescoço. Esfregue o porco e cobri-lo com campos estéreis.
- Sob condições estéreis, fazer uma laparotomia mediana. Insira um r abdominaletractor para ter acesso suficiente para o quadrante superior direito.
- Divida o ligamento falciforme eo ligamento triangular com bisturi.
- Em várias etapas, dividir o ligamento hepatoduodenal perto do fígado entre laços. Identificar, dividir, e marcar os ramos da artéria e ducto biliar hepática.
- Dissecar a artéria hepática retrógrado até à divisão da artéria gastroduodenal. Certifique-se que uma braçadeira bulldog se encaixa em torno do comum proximal da artéria hepática com a artéria gastroduodenal para mais tarde aperto.
- Liberte a veia portal a partir de tecido aderente.
- Mobilizar a veia cava do retroperitônio no lado direito usando um eletro-cautério. Use a tesoura para a parte superior, entre a veia e diafragma. Dissecar a veia infrahepatic baixo para o ramo da veia adrenal no lado direito ea veia renal do lado esquerdo.
- Exponha o hilo do baço. Aproximadamente a meio caminho ao longo do comprimento do baço, cuidadosamente clara def a artéria e veia esplênicas de camadas peritoneal aderiram. Cerque tanto artéria e veia esplênicas com 4 2-0 gravatas de seda.
- Insira um 8,5 Fr indutor bainha com dois furos adicionais na ponta do cateter na veia esplênica, apontando para distal para a veia portal. Fixe o cateter distal à sua inserção com uma das 2-0 laços e fechar a veia próxima à inserção com outro 2-0 empate. Deixe os outros dois vínculos aberto.
- Extrair sangue do cateter, lavá-la com 10 ml de solução salina, e fechar a braçadeira do cateter.
- Encha salina num desvio constituído por uma cabeça da bomba centrífuga, um tubo jugular (3/16 "), e uma entrada de ambos ramo portal (3/16") e um ramo da veia cava (1/4 ", um conector Luer Lock em proximal abertura). Coloque um grampo tubagem sobre a extremidade proximal do tubo de cava.
- Ligue o portal e a abertura do canal de derivação jugular para ambos os cateteres bainha (Figura 1) e selar o connecção com um anel braçadeira metálica. Coloque a cabeça da bomba centrífuga para a sua posição da bomba.
- Dê 1.000 mg de ácido tranexâmico e 10.000 UI de heparina 3 min iv antes de pinçamento. Reduzir a taxa de perfusão de propofol a 2 mg / kg / h durante o tempo da fase de anepática. Ajuste a concentração de isoflurano para a pressão arterial ea reatividade do porco.
- Abra os grampos de ambos os cateteres bainha do introdutor e de pinçamento da veia portal. Certifique-se de que o sangue está correndo através do desvio passivamente.
- Inicie a bomba centrífuga a cerca de 1.500 rounds / min. Continue pinçamento se a) o porco é cardiovascularly estável e b) o desvio está sendo executado em cerca de 500 ml / min. Se o porco não tolera o pinçamento, o volume substituto (cristalóides ou colóides) e agentes inotrópicos (norepinefrina no pequeno bolo).
- Cruz braçadeira veia cava infrahepatic apenas craniano para as veias renais, usando uma braçadeira De Bakey-Beck. Aplique uma pressão firme sobre as tiss fígadoue para espremer uma porção do sangue remanescente. Cross-braçadeira veia cava supra-hepática incluindo um aro diafragmática utilizando uma braçadeira Satinsky enquanto retraindo o fígado caudalmente.
- Corte a veia cava suprahepática diretamente na sua fronteira com o tecido do fígado. Em seguida, corte a veia portal perto do hilo hepático.
- Aproximadamente 4 cm cranial do grampo infrahepatic cava, cortado um furo na parede anterior da veia cava. Dentro deste buraco, posicione o conector da abertura de bypass da veia cava 'com o bloqueio Luer enfrentando anteriormente.
- Prenda o conector na veia infrahepatic com 1-0 gravatas de seda. Em seguida, abra a braçadeira de tubulação do ramo da veia cava do bypass.
- Finalmente, abrir o grampo infrahepatic cava para permitir um desvio cava-jugular, para além do desvio-jugular existente. Aumentar a velocidade da bomba de cerca de 2500 voltas / min de modo a que a saída de desvio no lado da jugular é entre 900 - 1100 ml / min.
- Extirpar o fígado no seu c remanescenteONEXÃO cranial ao conector de desvio infrahepatic, garantindo que os laços que prendem a ligação de desvio não são cortadas. Posicione o desvio de tubagem com cuidado para evitar vincada. Dar 500 mg de metilprednisolona para inicializar imunossupressão.
Reconstrução 3. Vessel
- Usando 4-0 polipropileno monofilamento, feche todos os 3 óstios das veias frênico do lado do destinatário na abertura da cava supra-hepática. Costure suturas duplas-armado polipropileno monofilamento 4-0 de dentro para fora em ambos os cantos da veia supra-hepática no lado do destinatário.
- Retire o saco de órgãos de doadores da caixa de gelo. Abrir o saco de órgãos, remover o fígado doador, e colocá-lo dentro da cavidade abdominal.
- Para uma anastomose fim-de-final da veia supra-hepática, aparar o doador da veia cava supra-hepática para caber lado do destinatário. Usando as agulhas para dentro dos pontos de canto do lado receptor, fazer um ponto de canto interior-fora em cada um dos lados do suprahcava doador epatic.
- Tiro ambas as extremidades da sutura juntos direita. Aproximar ambos os óstios de receptor e doador cava, em seguida, amarre as duas finais da sutura esquerda.
- Tiro o final mais curto e fazer um ponto fora-dentro da cava destinatário volta parede ao lado do empate. Correr sobre a parede de trás, idealmente eversão das paredes da veia cava.
- Adicionar 2-3 pontos da parede frontal com a mesma sutura uma vez que o lado direito foi alcançado, em seguida, atirou esse final de sutura. Correr sobre a parede frontal usando a sutura restante do canto esquerdo. Unir ambas as suturas utilizadas para as costas e paredes frontais. Amarre os outros dois finais de sutura no canto direito.
- Após o corte da veia portal de dador para um comprimento adequado, a anastomose veia porta extremidade-a-extremidade do mesmo modo, utilizando suturas 6-0 de monofilamento de polipropileno. Pouco antes de terminar com a parede frontal, entubar o lúmen da veia infrahepatic com outra linha de limpeza e lavar a solução UW com 1 L de solução salinaà TA através da veia cavaportal infrahepatic.
- Complete a anastomose e amarre as suturas, deixando aproximadamente 0,5 cm de fator de crescimento. Dito de outra De Bakey- Beck são fixados na parte cava doador infrahepatic.
- Abra a braçadeira cava supra-hepática e verificar se há sangramento. Em seguida, reperfundir o fígado através da abertura do grampo de portal.
- Utilize suturas de polipropileno monofilamento 6-0 para pontos hemostáticos. Diminuir a velocidade da bomba manual para cerca de 1.500 rounds / min e feche a braçadeira do introdutor de cateter portal bainha.
- Reclamp lado o destinatário da veia cava infrahepatic e colocar uma braçadeira de tubulação por parte cava do bypass. Parar a bomba centrífuga.
- Cortar os laços do conector cava e removê-lo. Devolver o sangue restante do manual para o porco através do cateter jugular.
- Feche a braçadeira do cateter jugular e desconecte o desvio. Dar 100 mg de sulfato de protamina para antagonizar a heparina. Tome especial cuidado do pihemodinâmica do g durante estes passos; usar catecolaminas para suporte de pressão e bicarbonato de sódio substituto para a acidose metabólica.
- Executar uma anastomose extremidade-a-extremidade da veia infrahepatic novamente do modo descrito acima, utilizando 5-0 suturas de monofilamento de polipropileno. Reperfundir a cava inferior infrahepatic liberando ambas as braçadeiras.
- Apare um remendo da aorta ao redor do tronco celíaco do doador. Tie fora da artéria gastroduodenal destinatário junto à artéria hepática comum. Coloque um grampo de bulldog para a artéria hepática comum proximal à junção da artéria gastroduodenal. Cortar um pequeno pedaço arterial com uma tesoura Potts, usando o tecido vascular em torno da junção.
- Lave a artéria hepática doador com 10 ml de solução salina heparinizada e colocar outro bulldog apertar ainda mais distalmente para evitar voltar a sangrar. Anastomosar o fim-de-final óstios arterial em uma técnica de pára-quedas em execução, usando um fio de polipropileno monofilamento 6-0. Reperfundir pela primeira opeNing distal e, em seguida, os grampos de buldogue proximais.
- Anastomose extremidade a extremidade-para-dois do ducto biliar com 6-0 suturas de monofilamento de polipropileno, utilizando a técnica de execução acima descrito. Certifique-se que grandes porções de tecido peribiliary estão incluídas porque o ducto biliar suíno é muito frágil e rasga facilmente.
- Depois de verificar para hemostasia, remover o cateter introdutor da veia esplênica. Feche as extremidades proximais e distais com os restantes 2 empates.
- Feche a parede abdominal com uma sutura absorvível monofilamentos tamanho 1. Feche a pele ou com um grampeador pele ou qualquer executando 2-0 sutura.
Fase 4. Pós-operatório
- Use a almofada de aquecimento e cobertor de circulação de calor para aquecer o porco.
- Gases sanguíneos de exemplo a cada hora. Ajustar a desidratação através do aumento da taxa de infusão.
- Desmamar a anestesia. Ventilar o porco por mais 2 horas.
- Remover o introdutor de cateter da jugular esquerda ve. Pressione firmemente por alguns minutos para evitar sangramento.
- Túnel do cateter por via subcutânea TPN para o lado do pescoço do porco. Prenda-o com 2-0 suturas.
- Remova a linha arterial após 2 horas se o porco é estável hemodinamicamente, sem apoio de catecolaminas. Certifique-se de que o lado da punção não está sangrando. Caso contrário, fazer um 6-0 bolsa-corda ponto em torno do buraco arterial sem fechar a artéria. Feche o local da incisão.
- Parar a ventilação assim que o porco é capaz de respirar de forma independente. Desconecte o tubo de ventilação do tubo traqueal. Repetidamente verificar se o porco está respirando suficientemente.
- Coloque o porco em uma posição propensa em um único curral provido de uma lâmpada de aquecimento. Extubação uma vez que o porco é capaz de manter-se a cabeça de forma independente. Não deixe um animal sem supervisão até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter decúbito esternal. Casa do porco separadamente para todo o período pós-operatório.
- Forneceriv medicação para a dor suficiente no pós-operatório (por exemplo, buprenorfina 0,01-0,05 mg / kg a cada 6 horas).
- Se o porco não bebe de forma independente, substituir o suficiente iv de volume
- Continue metilprednisolona como imunossupressão (dia 250 mg de pós-operatório (POD) uma manhã e, em seguida, 125 mg diariamente). Iniciar a cefalosporina de 2 mg / kg PO duas vezes por dia a partir POD2 diante.
- Administrar 500 mg de metronidazole e 1000 mg duas vezes por dia de cefazolina, bem como 20 mg de pantoprazole de uma vez por dia até Pod3.
- Monitorar o porco de perto. Não hesite em sacrificar-lo se ele mostra sinais de sofrimento (por exemplo, letargia, refusion para beber, acidose persistente ou hipoglicemia, ou sinais de hemorragia ou peritonite). Por eutanásia, desangrar o porco sob anestesia profunda isoflurano (5%,> 2,5 MAC) cortando a veia supra-hepática.
Representative Results
Em um primeiro estudo de transplante, um modelo de dador bater-coração (HBD, n = 5) foi comparado com um modelo TDC (n = 10) expostas a 45 min de isquemia quente in situ. Em ambos os grupos, os enxertos foram preservados em gelo durante 10 horas após a aquisição.
No grupo HBD, 100% dos porcos receptores sobreviveu até ao fim do acompanhamento no dia 5 após o transplante. No grupo DCD, apenas 50% dos receptores sobreviveu porcos durante 5 dias, devido a problemas de coagulação ou descompensação metabólica, como resultado da diminuição da função do fígado pós-operatório.
Todas as amostras de sangue foram coletadas a partir do cateter venoso central. Após centrifugação, as amostras de soro foram obtidas e analisadas para a lesão hepatocelular (aspartato aminotransferase, AST), a função biliar (bilirrubina e fosfatase alcalina total), e função hepática (INR). O curso de tempo de cada marcador é mostrado nas Figuras 2-5.
Figura 1. Esquema do shunt porto-cava-jugular. O bypass é preenchido com solução de Ringer com lactato. Em seguida, a parte da veia cava é presa com uma pinça tubulação, as partes jugulares e esplênicos estão ligados aos cateteres pré-estabelecidos, o desvio é aberto, e da bomba centrífuga é iniciado após o pinçamento da veia porta. Após a ressecção do fígado, a parte da veia cava do bypass é inserido e fixado na infrahepatic coto da veia cava, cranial para as veias renais. A braçadeira de tubo é libertado para permitir a descompressão da veia cava, para além da descompressão porta.
Figura 2. aspartato aminotransferase (AST) (HBD n = 5, n = 10 DCD). AST é um marcador sensível da lesão hepatocelular. A ré picoer 24 horas é inferior no HBD do que no grupo DCD, sugerindo lesão de reperfusão menos hepática; o menor desvio padrão mostra resultados mais homogêneos no grupo HBD.
Figura 3. A bilirrubina total (HBD n = 5, n = 10 DCD). A bilirrubina total, como um marcador de depuração biliar e integridade do ducto biliar, mostra uma tendência estável e homogénea com valores inferiores a 10 mmol / L no grupo de HBD. A curva de bilirrubina no grupo DCD aumenta gradualmente ao longo do tempo e mostra um desvio-padrão elevado, sugerindo lesão biliar em apenas uma porção do grupo experimental.
Figura 4. A fosfatase alcalina (HBD n = 5, n = 10 DCD). A fosfatase alcalina ié um indicador de lesão biliar. Os valores para o grupo de HBD são mais baixas do que a do grupo DCD, o que implica menos lesão biliar.
Figura 5. INR (HBD n = 5, DCD n = 10). Um valor alto indica INR função hepatocelular diminuída devido à diminuição da liberação de fatores de coagulação. Em ambos os grupos HBD e DCD, os valores de INR regresso aos valores normais de 5 dias após o transplante, sugerindo que a recuperação da função do fígado. Os valores para o grupo de HBD aparecem inferior.
Discussion
Experimental suína transplante hepático ortotópico é um procedimento desafiador para um ambiente de pesquisa, sem os recursos de terapia intensiva de um cenário clínico. Complicações possíveis incluem instabilidade hemodinâmica, hemorragia, isquemia de órgãos, hipotermia, e metabólica, bem como respiratória, descompensação. Para qualquer grupo de pesquisa, formação processual suficiente da técnica cirúrgica 5, bem como a anestesia 14,15 porco é obrigatória a fim de alcançar resultados representativos e reprodutíveis.
Muitos subtilezas técnicas têm sido descritos na literatura, especialmente em relação à fase de reconstrução vascular 5. O protocolo de transplante hepático ortotópico descrito acima fornece as informações necessárias para um modelo de substituição de cava que assemelha-se o transplante hepático ortotópico humano. Os resultados fornecidos demonstrar sobrevivência do animal confiável e recuperação do enxerto em ambos os modelos HBD e DCD. O protocolo é aplicável em cenários de sobrevivência de curto prazo utilizados na reperfusão do enxerto experiments, por exemplo, bem como em modelos de sobrevivência a longo prazo, tais como estudos de tolerância.
Um grande obstáculo de suíno transplante hepático ortotópico é relativamente pobre tolerância de cava e da veia portal pinçamento. Congestão esplâncnica durante a fase anepática provoca hipertensão venosa capilar e danos que podem levar à isquemia intestinal major e instabilidade hemodinâmica, a ponto de um choque irreversível mesmo após reperfusão de órgãos 7. Desde a veia cava é completamente imersos em parênquima hepático, um procedimento piggy-back-preservando cava não é viável. A oclusão total da veia cava, durante a fase de reconstrução cava prejudica a estabilidade hemodinâmica do porco. Embora alguns relatos mostram que o transplante hepático ortotópico suína pode ser realizado durante a cava e da veia portal oclusão total de menos de 25 min 16,17, uma técnica de bypass porto-cava-jugular para o tempo de reconstrução vascular é a opção mais segura e mais prática 7- 9,18. Em thexperiência e dos autores, uma derivação porto-jugular passivo não é o ideal para manter o hemodinamicamente estável porco durante a fase anepática. O modelo de bypass, incluindo descompressão ativa de ambos cava infrahepatic e veia portal, permite uma fase de reconstrução calma das anastomoses cava e portal supra-hepáticas, mesmo com tempo de pinçamento prolongado devido a complicações imprevistas. Ao contrário do que relatórios anteriores 7, uma esplenectomia não é obrigatória quando o cateter de derivação portal é removido. Ambos artéria e veia esplênicas estão fechados sobre a meio caminho ao longo do comprimento do baço deixando a metade proximal suficientemente perfusão. Complicações como hemorragia ou embolia devido a desvio de desconexão são evitáveis, garantindo que o desvio é colocada com cuidado e protegido adequadamente.
Em sobrevivência a longo prazo transplante hepático ortotópico experimentos, a anastomose do ducto biliar é considerado um ponto fraco, devido à sua alta taxa de complicações 19. O tecido biliar é muito frágil e needs cuidado especial quando está sendo manipulado. Muitas técnicas de anastomose diferentes têm sido descritas 5,19. Uma anastomose end-to-end é tecnicamente fácil e associado com o mínimo de complicações 19. Uma sutura contínua com uma agulha de não corte, incluindo grandes secções do tecido conjuntivo peribiliary parece ser superior a um sutura interrompida. O ducto biliar é colocado sob tensão desnecessária quando os pontos únicos de sutura interrompida estão atadas. Isso pode resultar em lágrimas de tecidos e vazamentos biliares consecutivos. O material de sutura - absorvível ou não absorvível - geralmente não é importante, dada a sua duração limitada até que o porco é encerrado. Para os modelos de sobrevivência a longo prazo ao longo de vários meses, suturas absorvíveis - como no transplante hepático ortotópico humano - são preferíveis.
Cuidados específicos devem ser tomados com o pós-operatório follow-up. Alimentação suficiente e de fornecimento de fluido, um protocolo de alívio da dor de confiança, e uma imunossupressão adequadaregime são obrigatórios. Para as experiências de longo prazo, a imunossupressão parece particularmente importante. Em comparação com outros mamíferos, os porcos mostram uma surpreendentemente baixa taxa de rejeição imunológica após o transplante hepático ortotópico 20,21. Infiltrações de células redondas são máxima durante a segunda semana após o transplante e diminuir espontaneamente, mesmo sem imunossupressão. Rejeição é raramente a causa da morte após o transplante hepático ortotópico suíno 22. No entanto, mesmo com o protocolo de imunossupressão, envolvendo a administração de esteróides IV e inibidores da calcineurina po mencionado aqui, a rejeição do enxerto é indicado por um ligeiro aumento de transaminases a partir de cerca de 4 dias após o transplante hepático ortotópico e confirmada por aparente campo portal de infiltração de células redondas. Inibidores da calcineurina pode ser dada, quer po 23,24 ou iv 25,26; Ambos os métodos têm desvantagens. Mesmo com ajudas aplicação oral, a quantidade real de atingir o trato gastro-intestinal permanece indefinida. Por outro lado, a infusão intravenosa contínua, emcaneta de um porco com um animal ativo é difícil. Assim, a aplicação iv deve ser realizada como um bolus, o que resulta em picos de concentração de droga elevada, juntamente com os potenciais efeitos tóxicos. No entanto, ambos os métodos de aplicação parece permitir a sobrevivência a longo prazo.
Semelhante a um ambiente clínico, recomenda a profilaxia pós-operatório úlcera de estresse. Sangramento pós-operatório de úlceras pépticas é um problema freqüente e pode estar relacionada com uma disfunção hepática 27. Depois de alguns casos de hemorragia digestiva em ambos os grupos transplante hepático ortotópico, os autores começaram a profilaxia regular com pantoprazol e não experimentar qualquer hemorragia gastrointestinal desde então.
Manutenção rigorosa de condições estéreis no intra-operatório, comparáveis com as condições de uma sala de cirurgia, clínica e consequentes profilaxia antibiótica, diminui o risco de complicações infecciosas.
Em conclusão, este artigo pferece informações práticas para o estabelecimento de um programa de transplante hepático ortotópico suína em um ambiente de pesquisa. Dedicação suficiente, prática, e trabalho de equipa é importante, a fim de diminuir o período de aprendizagem, para produzir resultados fiáveis, e para reduzir os custos e o número de animais de pesquisa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Atropine Sulphate 15 mg/30ml | Rafter 8 Products | 238481 | |
| Buprenorphine 0.3 mg/ml | RB Pharmaceuticals LDT | N/A | |
| Cefazolin 1 g | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | 2237138 | |
| Cyclosporin Oral Solution 5,000 mg/50 ml | Novartis Pharmaceuticals Canada Inc. | 2150697 | |
| Fentanyl Citrate 0.25 mg/5 ml | Sandoz Canada Inc. | 2240434 | |
| Heparin 10,000 iU/10 ml | Leo Pharma A/S | 453811 | |
| Isoflurane 99.9%, 250 ml | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | 2231929 | |
| Ketamine Hydrochloride 5000 mg/50 ml | Bimeda-MTC Animal Health Inc. | 612316 | |
| Lactated Ringer’s + 5% Dextrose, 0.5 L | Baxter Corporation | 61131 | |
| Lacteted Ringer’s, 1 L | Baxter Corporation | 61085 | |
| Metronidazole 500 mg/100 ml | Baxter Corporation | 870420 | |
| Midazolam 50 mg/10 ml | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | 2242905 | |
| Pantoprazole 40 mg | Sandoz Canada Inc. | 2306727 | |
| Potassium Chloride 40 mEq/20 ml | Hospira Healthcare Corporation | 37869 | |
| Propofol 1,000 mg/100 ml | Pharmascience Inc. | 2244379 | |
| Protamine Sulfate 50 mg/5 ml | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | 2139537 | |
| Saline 0.9%, 1 L | Baxter Corporation | 60208 | |
| Sodium Bicarbonate 50 mEq/50 ml | Hospira Healthcare Corporation | 261998 | |
| Solu-Medrol 500 mg | Pfizer Canada Inc. | 2367963 | |
| Tranexamic Acid 1,000 mg/10 ml | Pfizer Canada Inc. | 2064413 | |
| University of Wisconsin Solution, SPS-1 | Organ Recovery Systems | SPS-1 | |
| Xylocaine Endotracheal 10 mg/50 ml | AstraZeneca | 2003767 | |
| Appose ULC 35 W skin stapler | Covidien Canada | 803712 | |
| Maxon, 1 | Covidien Canada | 606173 | |
| Sofsilk, 0 | Covidien Canada | S606 | |
| Sofsilk, 2-0 | Covidien Canada | S405 | |
| Sofsilk, 3-0 | Covidien Canada | S404 | |
| Surgipro II, 4-0 | Covidien Canada | VP581X | |
| Surgipro II, 5-0 | Covidien Canada | VP725X | |
| Surgipro II, 6-0 | Covidien Canada | VP733X | |
| Catheter i.v, 18 G | BD Canada | 381147 | |
| Cook TPN catheter, 9.5 Fr | Cook Medical Company | C-TPNS-9.5-90 | |
| PSI Kit for sheath catheter, 8.5 Fr | Arrow International | ASK-09803-UHN | |
| Infusion Pump Line | Smith Medical ASD Inc. | 21-0442-25 | |
| Liver Admin Set (flush line) | CardioMed Supplies Inc | 17175 | |
| Mallinckrodt, Tracheal Tube, 6.5 mm | Covidien Canada | 86449 | |
| Med-Rx Suction Connecting Tube | Benlan Inc. | 70-8120 | |
| Organ Bag | CardioMed Supplies Inc | 2990 | |
| Suction Tip | Tyco Healthcare Group LP | 8888501023 | |
| Valleylab, Cautery Pencil | Covidien Canada | E2515H | |
| Valleylab, Patient Return Electrode | Covidien Canada | E7507 | |
| Bypass Connector 3/8” x 1/4“ | Raumedic AG | 955083-001 | |
| Bypass Connector 3/8” x 3/8” Luer Lock | Raumedic AG | 955163-001 | |
| Bypass Connector Y 3/8” x 3/8” x 1/4” | Raumedic AG | 961360-002 | |
| Bypass Tubing 1/4” x 1/16” | Raumedic AG | 039505-010 | |
| Bypass Tubing 3/8” x 3/32” | Raumedic AG | 039535-005 | |
| Rotaflow Centrifugal Pump | Maquet-Dynamed | HC 2821 | |
| Stainless Steel Hose Clamp Ring, 5mm | Oetiker | 16700007 | |
| Abdominal Retractor | Medite GmbH | N/A | |
| De Bakey – Beck, Infrahepatic Cava Clamp | Aesculap Inc. | FB519R | |
| Deithrich, Atraumatic Clamp (Portal Vein) | Aesculap Inc. | FB525R | |
| Gregory Bulldog Clamp, curved | Aesculap Inc. | FB382R | |
| Gregory Bulldog Clamp, straight | Aesculap Inc. | FB381R | |
| Potts – De Martel, Scissors | Aesculap Inc. | BC648R | |
| Satinsky, Suprahepatic Cava Clamp | Aesculap Inc. | FB605R | |
| Symetrical Tubing Clamp | Codman Instruments | 198010 | |
| Anesthesia Machine, Optimax | Moduflex Anesthesia Equipment | SN5180 | |
| Bypass Flow meter, HT 110 | Transonic Systems Inc. | HT110B11106 | |
| Flow meter probe, H6XL | Transonic Systems Inc. | H6Xl689 | |
| Heat Therapy Pump, T/Pump | Gaymar Industries Inc | TP500-G89D19 | |
| Infusion Pump 3,000 | SIMS Graseby LTD. | SN300050447 | |
| Isoflurane Vapor 19.1 | Draeger Medical Canada Inc. | N/A | |
| Monitor, Datex AS 3 | Instrumentarium Corp./ Hitachi | D-VHC14-23-02 | |
| Rotaflow Centrifugal Drive Unit | Maquet-Dynamed | 952301 | |
| Rotaflow Console | Maquet-Dynamed | 706035 | |
| Temperature Therapy Pad | Gaymar Industries Inc | TP26E | |
| Valleylab Force Tx | Valleylab Inc. | 216151480 | |
| Ventilator, AV 800 | DRE Medical Equipment | 40800AVV | |
| Warm Touch, Patient Warming System | Nellcor/ Covidien Canada | 5015300A |
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