Summary
Entrega continua a ser o principal desafio para a aplicação terapêutica de RNA de interferência pequeno (siRNA). Este protocolo envolve a utilização de uma plataforma de entrega de siRNA multifuncional e biocompativel, que consiste de arginina e polietilenoimina enxertado micropartículas de silício poroso.
Introduction
RNAs interferentes (siRNAs) são moléculas de ARN de cadeia dupla que podem suprimir a expressão dos genes. Nos últimos anos, os siRNAs foram desenvolvidos como uma nova geração de biofármacos que mostram um potencial terapêutico para uso futuro em aplicações clínicas 1-5. No entanto, o sucesso da implementação da terapia siRNA continua a ser um desafio considerável, devido à degradação por nucleases, captação intracelular pobres, de baixa eficiência de transfecção e liberação ineficiente do endosome / lisossoma 5. Muitas destas dificuldades podem ser ultrapassadas pelo desenvolvimento de plataformas de entrega, que pode com segurança e eficientemente entregar siRNA para o tecido doente. Em comparação com as transportadoras virais, as plataformas não-virais apresentam várias vantagens, como a segurança, baixo custo e facilidade de alfaiataria. Em particular, as nanopartículas catiónicos, tais como polímeros e lípidos, provaram ser úteis para a entrega de siRNA 3.
Anteriormente, temos desenvolvido um dr discoidalug sistema de entrega, o vector denominado de vários estágios (MSV). Esta plataforma é baseada em fases sequenciais, em que um veículo é libertado a partir de uma outra. A primeira fase do veículo é feita a partir de uma micropartícula biodegradável silício poroso (psi), enquanto a segunda fase de veículos são nanopartículas carregadas com drogas ou de agentes de contraste de 6,7. As nanopartículas, que são incorporados no material PSI, estão gradualmente lançado como o Si degrada 8. Uma vantagem de utilizar partículas de Si é que as características de morfologia e de superfície pode ser facilmente ajustada para a obtenção biodistribuição óptimo e libertação da droga. Recentemente, a utilização com sucesso da plataforma MSV para a entrega de lipossomas de siRNA para o tecido do tumor foi demonstrado num modelo de rato do ovário e do cancro da mama 9, 10.
Neste trabalho, nós fabricamos um sistema de entrega universal para siRNA com base nos princípios da plataforma MSV. A eficácia deste sistema de entrega tem sido anteriormente demonstrado nósing siRNA diferentes moléculas 11. O sistema é um de silício poroso (PCPS) transportadora funcionalizada-policatião, que consiste em psi enxertado com polietilenimina (PEI) e a arginina (Arg). PEI pode auxiliar na formação de interacções electrostáticas com siRNA, enquanto Arg psi e pode servir para reduzir a toxicidade de PEI, como anteriormente demonstarted 11. Além disso, a presença de PEI pode auxiliar na absorção intracelular e endossomal fuga, ao passo que as micropartículas psi permitir protecção siRNA e de libertação sustentada. As partículas psi degradam gradualmente, sob condições fisiológicas, resultando assim na formação de nanopartículas Arg-PEI / siRNA (Figura 1), que têm uma morfologia distinta e uma distribuição de tamanhos estreita 11. Os dados referentes à estabilidade do sistema PCPS / siRNA, consulte o estudo de Shen et al. 11. Esta plataforma de PCPS difere do MSV convencional, uma vez que as nanopartículas segundo estágio não são inicialmente present no veículo, mas são formados ao longo do tempo como o transportador de primeira fase degrada 11, 12. A eficiência de carregamento de siRNA eficiência, citotoxicidade e silenciamento de genes do sistema PCPS foi avaliada in vitro. A eficiência de transfecção foi medida utilizando siRNA contra a ataxia telangiectasia mutada (ATM) oncogene, que está envolvido na reparação do ADN 10. Previamente, a supressão da ATM foi demonstrado para diminuir o crescimento do tumor em um modelo de cancro da mama 10.
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Protocol
1. PCPS Particle Preparação
- Oxidar partículas de silício poroso não funcionalizados em uma solução a 30% de peróxido de hidrogénio a 95 ° C durante 2 horas. Aminar as partículas oxidadas em 2% (3- aminopropil) trietoxissilano solução em álcool isopropílico durante 2 dias a 65 ° C com agitação suave.
- Centrifuga-se a solução durante 30 min a 18.800 x g e as partículas de lavar duas vezes em álcool isopropílico e três vezes em etanol, utilizando sonicação breve para suspender o sedimento. Deixar as partículas em solução de etanol, quando a execução da etapa 1.3 e 1.4.
- Adicionar um volume conhecido de uma suspensão de partículas (por exemplo, 10 uL) a 10 ml de isótono diluente e contar as partículas com um analisador de contagem de partículas para determinar a concentração de partículas na solução estoque.
- Activa o grupo ácido de L-arginina (0,1 nmol) com a N - (3-dimetilaminopropil) - etilcarbodiimida N '(EDC, 0,1 nmol) / N
- Resumidamente sonicar a solução estoque de partículas e adicionar 1 bilhão de partículas à solução de L-arginina e deixar a mistura reaccional durante 18 horas à temperatura ambiente com agitação suave.
- Activa o primeiro grupo ácido aspártico de N - (terc-butoxicarbonil) -L-aspártico (Boc-Asp-OH, 1 nmol) com EDC (0,1 nmol) / NHS (0,1 nmol) em 20 ml de etanol durante 4 horas a 4 ° C com agitação suave.
- Dissolve-se 50 mg de polietilenimina em 10 ml de etanol e adicionar a solução à mistura de Boc-Asp-OH. Deixe que a reacção prosseguir durante 24 horas à temperatura ambiente com agitação suave.
- Activa o segundo grupo ácido aspártico da solução de Boc-Asp-OH / PEI com EDC (0,1 nmol) / NHS (0,1 nmol) a 4 ° C durante 6 horas com agitação suave.
- Para obter partículas de PCPS, adicionar a solução de partículas a partir do passo 1.5 em solução de Boc-Asp-OH / PEI a partir do passo 1.8. Permitir que a reacção prosseguir durante 18 horas à temperatura ambiente com suave r irring.
- Centrifuga-se a solução durante 30 minutos a 18.800 xg e lava-se a solução de partícula três vezes com etanol, utilizando sonicação breve para suspender o sedimento.
2. PCPS Particle Caracterização
- Medir o tamanho das partículas utilizando um microscópio electrónico de varrimento (SEM).
- Colocar uma gota de suspensão de partículas (partículas de 10.000 / uL em etanol) em uma amostra de sílica limpa SEM topo e deixar secar à temperatura ambiente sob vácuo.
- Meça MEV a 8 kV com uma distância de trabalho de 3-5 mm, utilizando um detector na lente.
- Medir o potencial zeta das partículas usando um sistema de analisador de partículas.
- Misturar 10 ul de suspensão de partículas (partículas de 10.000 / uL) em etanol com 1 ml de tampão fosfato 10 mM (pH 7,4).
- Carregar a amostra em células capilares dobradas e medir o potencial zeta de acordo com as instruções do fabricante.
- Seque as partículas PCPS (de partícula PCPS preparação passo 1.9) sob vácuo O / N.
- Adicionar siRNA (4 mg) em água livre de nuclease (20 l) para as partículas PCPS secas e brevemente sonicate. Use o seguinte partícula com as taxas de siRNA: 2 × 10 5 partículas / 0,2 ug siRNA, 4 × 10 5 partículas / 0,2 ug siRNA, 6 × 10 5 partículas / 0,2 ug siRNA, 8 × 10 5 partículas / 0,2 mg de siRNA, 10 × 10 5 partículas / 0,2 ug de siRNA e 12 × 10 5 partículas / 0,2 ug de siRNA.
- Incubar durante 3 horas a 4 ° C num agitador (1.000 rpm) para permitir a ligação do siRNA para as partículas.
4. Optimização de siRNA / PCPS Rácio de Partícula
- Adicione corante DNA para 20 l de partículas siRNA PCPS / controle com partículas diferentes relações siRNA (veja carregamento de siRNA em partículas PCPS).
- Coloque o samples em um gel de agarose 2% contendo mancha gel DNA.
- Efectuar a electroforese a uma voltagem constante de 120 V durante 20 min em tampão de corrida.
- Analisar o gel com aquisição de imagem e software de análise.
5. Lançamento de siRNA de PCPS Particles
- Misturar 20 ul de partículas de siRNA PCPS / controlo com partículas diferentes relações de siRNA (ver etapa 3) em dodecil sulfato de sódio (SDS, 2%) e deixar repousar durante 1 hora à TA.
- Adicionar corante de carga de ADN para as amostras.
- Amostras de carregar em um gel de agarose 2% contendo mancha gel DNA.
- Execute eletroforese em uma tensão constante de 120 V durante 20 minutos em tampão de corrida usando o equipamento de eletroforese de DNA e uma fonte de alimentação.
- Analisar o gel com aquisição de imagem e software de análise.
6. Microscopia Confocal de PCPS Partículas
- Adicionar 5 mL de partículas fluorescentes siRNA controle PCPS / (10 × 10 5 partículas / 0.2 mg siRNA / 20 l) para uma lamela de vidro.
- Visualize camadas de partículas por microscopia confocal.
7. Caracterização de Arg-PEI / controle siRNA Nanopartículas
- Para degradar o material de silício e formar Arg-PEI nanopartículas / siRNA de controlo, adicionar partículas PCPS / siRNA (10 × 10 6 partículas PCPS / 2 ug) siRNA para 100 ul de solução salina tamponada com fosfato e agitar (1000 rpm) a 37 ° C durante 2 dias.
- Centrifuga-se a amostra durante 30 minutos a 18.800 xg e recolher o sobrenadante.
- Medir o tamanho das nanopartículas Arg-PEI / siRNA formados com dispersão de luz dinâmica (DLS).
- Misturar 10 ul de sobrenadante com tampão de fosfato 1 ml de 10 mM (pH 7,4) e colocar numa cuvete de plástico.
- Medir o tamanho das partículas através de um sistema analisador de partículas de acordo com as instruções do fabricante.
- Determinar o tamanho e a morfologia do formado Arg / PEI siRNAnanopartículas com microscopia de força atômica.
- Tomar 10 ul do sobrenadante e no lugar de uma bolacha de silício.
- Visualize as partículas com microscopia de força atômica (AFM).
Cultura 8. celular
- Culturas MDA-MB-231 de cancro da mama humano em meio de cultura celular suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina-estreptomicina a 5% de CO 2, 95% de humidade e 37 ° C.
9. microscopia confocal de células vivas com PCPS Particles
- Células da placa em dois poços de cultura desliza a uma densidade de sementeira de 3 x 10 5 células / poço, durante 24 h.
- Adicionar PCPS partículas carregadas com siRNA controlo fluorescente (10 × 10 5 partículas / 0,2 ug a proporção de partículas de siRNA, 50 nM de ARNsi) para as células.
- Gravar um filme das células com um microscópio confocal (fornecido com uma câmara, 5% de CO2, 95% de humidade e 37 ° C) durante 12 horas seguindo partícula expocerteza.
10. microscopia confocal de células fixadas com PCPS Particles
- Células da placa em dois poços de cultura desliza a uma densidade de sementeira de 3 x 10 5 células / poço, durante 24 h.
- Adicionar partículas PCPS carregados com siRNA controle fluorescente (10 × 10 5 partículas / 0,2 mg de partículas à relação de siRNA, 50 nM siRNA) para as células e incubar por 1 dia, 7 dias e 10 dias.
- Lavar as células duas vezes com solução salina tamponada com fosfato e depois fixá-los com uma solução de paraformaldeído a 4% durante 10 min.
- Lavam-se as células com solução salina tamponada com fosfato.
- Permeabilizar as células com 0,1% de octil fenol etoxilado durante 10 min e, em seguida, lavar três vezes com solução salina tamponada com fosfato.
- Bloquear as células com albumina de soro de bovino (10 mg / ml) em solução salina tamponada com fosfato durante 10 minutos à temperatura ambiente com agitação suave.
- Para visualizar a actina filamentosa, incubar as células com faloidina marcada fluorescentemente (1 ul / 40 ulsolução) durante 20 min à TA bloqueio com agitação suave e em seguida lavar com solução salina tamponada com fosfato.
- Retirar as lâminas a partir da moldura e adicionar antifade reagente com 4 ', 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) para visualizar o núcleo.
- Adicionar uma tampa de vidro em cima e tomar imagens das células com microscopia confocal.
11. Citometria de Fluxo de células com PCPS / fluorescentes siRNA controle Particles
- Células da placa em uma placa de 6 poços a uma densidade de sementeira de 3 x 10 5 células / poço, durante 24 h.
- Adicionar PCPS partículas carregadas com siRNA controlo fluorescente (10 × 10 5 partículas / 0,2 ug a proporção de partículas de siRNA, 50 nM de ARNsi) às células e incuba-se durante 24 horas.
- Lavam-se as células com solução salina tamponada com fosfato e raspe-los com um raspador de células.
- Armazenar as células em solução salina tamponada com fosfato com 2% de soro fetal de bovino antes da análise. Utilização de células não tratadas como um controlo negativo.
- Execute cy fluxotometry.
12. A viabilidade celular das células com PCPS Partículas e PCPS / controle siRNA Particles
- Células da placa em uma placa de 96 poços a uma densidade de células de 3 x 3 10 células / poço, durante 24 h.
- Tratar as células com partículas de PCPS (1,5 x 10 5 / poço e 6 x 10 5 / po) ou partículas de siRNA PCPS / controlo (10 × 10 5 partículas / 0,2 ug a proporção de partículas de siRNA, 10 nM e 100 nM) por 48 siRNA hr e 72 hr. Utilização de células não tratadas e células tratadas com solução salina de fosfato tamponada (mesmo volume que as partículas adicionadas) como controlos. Ensaiar cada amostra em triplicado.
- Realizar um ensaio de proliferação celular de acordo com as instruções do fabricante.
- Representar dados como a média ± desvio padrão.
13. Western Blot de células com PCPS / ATM Mutantes siRNA Particles
- Células da placa em uma placa de 6 poços, a uma densidade celular de 2 x 10 5 células / well durante 24 h.
- Incubar as células com siRNA PCPS / controle (50 nM) partículas ou PCPS / ATM siRNA (50 Nm) partículas para 72 hr. Utilização de células não tratadas como controle.
- Lisar as células, utilizando um reagente de extracção de proteína suplementado com um cocktail inibidor de protease.
- Centrifuga-se os lisados celulares durante 10 minutos a 14000 xg e recuperar o sobrenadante.
- Determinar a concentração de proteína com um ensaio de quantificação de proteína de acordo com as instruções do fabricante.
- Adicionar tampão de carregamento de amostra (com 5 ul de 2-mercaptoetanol / ml de tampão) para as amostras e aquecê-los durante 6 minutos a 99 ° C.
- Coloque as amostras de proteína (20 ug / ul) num gel de 12% SDS-poliacrilamida em tampão de corrida e efectuar a electroforese em gel de poliacrilamida (1 h, 120 V) usando o equipamento de electroforese e um fonte de alimentação.
- Transferir o gel em tampão de transferência (com 20% de metanol) para uma membrana de nitrocelulose (1 h, 100 V) usando o equipamento de electroforese euma fonte de alimentação.
- Bloquear a membrana com leite em pó a 5% durante 1 hora.
- Incubar a membrana com o anticorpo primário ATM (de coelho) em solução (a partir do passo 13.9) de bloqueio numa concentração de 1: 1000 de diluição O / N.
- Lava-se a membrana com tampão fosfato salino contendo 0,1% de polietileno-glicol-sorbitano e depois incubar com o anticorpo secundário (anti-coelho) em solução (a partir do passo 13.9) de bloqueio a uma diluição de 1: 2500 durante 1 hora.
- Lava-se a membrana com tampão fosfato salino contendo 0,1% de polietileno-glicol-sorbitano e detectar as bandas de proteína com reagente de detecção de Western blot, utilizando software de aquisição de imagem e análise.
- Para o controlo da carga, lava-se a membrana e repetir os passos 13,9-13,12 utilizando um anticorpo primário β-actina (de ratinho, diluição 1: 10.000) e um anticorpo secundário (anti-rato de 1: 4000 de diluição).
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Representative Results
Este protocolo descreve o uso de um sistema de entrega n viral para a segura e eficiente transfecção siRNA. Os resultados de SEM revelam que as partículas de PCPS são de forma cilíndrica e têm um diâmetro de 2,6 mm (Figura 2A). As partículas são carregadas positivamente com um potencial zeta de cerca de 8,21 (Figura 2B), permitindo desse modo electrostático de ligação com os nucleótidos carregados negativamente. Imagens confocais de diferentes camadas de partículas de PCPS demonstram que o controlo fluorescente siRNA é carregado no interior das partículas de silício poroso (Figura 2C). A formação e liberação de nanopartículas Arg-PEI / siRNA das partículas PSI foi confirmada com DLS e AFM. A distribuição do tamanho das partículas variou 70-120 nm, com um tamanho médio de 94 nm (Figura 2D). Imagens de AFM ilustram que as nanopartículas têm uma forma esférica (Figura 2E).
O ratio das partículas para siARN foi optimizado por electroforese em gel de agarose para garantir a elevada afinidade de ligação (Figura 3A). Uma vasta gama de proporções de partículas de siRNA foi usada (2 x 10 5, 4 x 10 5, 6 x 10 5, 8 × 10 5, 10 × 10 × 12 5 e 10 5 /0.2? g de siRNA). Os resultados indicam que o siARN pode ligar-se fortemente com as partículas quando a quantidade de partículas é superior a 8 × 10 5. Uma razão de 10 x 10 5 PCPS / 0,2 ug siARN foi seleccionado para mais experiências. Além disso, siARN foi libertada com sucesso a partir do transportador, quando tratados com SDS, como ilustrado na Figura 3B.
Em seguida, a internalização adega de PCPS / partículas fluorescentes siRNA de controlo foi avaliada em células MDA-MB-231. Imagens confocais tomadas após 24 horas de tratamento mostram que as partículas são eficazmente internalizado em células (Figura 4 a Figura 5 demonstra que 89% das células que incorporaram PCPS / partículas siRNA após 24 h de incubação. Além disso, o processo de internalização foi registado durante 12 horas (Vídeo 1). Estes resultados indicam que as partículas de PCPS pode entregar eficientemente siRNA em células. A acumulação de longo prazo de siRNA dentro das células também foi avaliada por microscopia confocal. No dia 7 e no dia 10, o siARN foi ainda detectado no interior das células (Figura 6).
Um dos fatores mais importantes a considerar quando se desenvolve um sistema de entrega de siRNA é a segurança da transportadora 13. PEI é conhecida por formar poliplexos com siRNA, ajuda na absorção celular e liberação do gatilho da endosome / lisossoma. No entanto, PEI pode ter efeitos tóxicos, devido à presença de grupos amino primários carregados positivamente na espinha dorsal 14,15. Por exemplo, a ligação de PEI para o glicocálice na superfície da célula pode resultar na formação de grandes aglomerados 16. A fim de eliminar essa toxicidade induzida por carga, PEI foi conjugado covalentemente com arginina através de uma ponte de ligação, para reduzir o número de grupos amino primários. A viabilidade celular manteve-se mais de 95% após 48 h e 72 h, quando as partículas e siRNA foram utilizados a uma concentração de até 6 x 10 5 / poço e 100 nM, respectivamente (Figura 7A). Em seguida, a eficácia de transfecção de siRNA contra o oncogene ATM foi avaliada em células MDA-MB-231. Os resultados do Western blot demonstrar que os níveis de proteína de ATM são diminuídas após tratamento com PCPS / ATM siRNA (Figura 7B). Os resultados sugerem a plataforma PCPS é um sistema de entrega segura e eficiente para siRNA.
Figura 1. Representação esquemática do silício poroso (PCPS) partículas funcionalizadas-policatião. forte> Arginina (Arg) -polyethylenimine (PEI) / pequenos ARN interferente (siRNA) nanopartículas são formados após a degradação de silício (Si).
Figura 2. Caracterização de partículas PCPS. (A) microscopia eletrônica de varredura (SEM) imagem de partículas PCPS. (B) potencial Zeta das partículas de PCPS. (C) confocal imagens de diferentes camadas dos PCPS / fluorescente partículas de controlo de siRNA. Distribuição (D) Tamanho das arginina Arg-PEI / controle de nanopartículas siRNA libertado das micropartículas de silício poroso. Imagens (E) microscopia de força atômica (AFM) de Arg-PEI / controle de nanopartículas de siRNA. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. agarose gel para a optimização do sistema de entrega de PCPS / siRNA. (A) A afinidade de ligação entre as partículas de PCPS e controlar siRNA. As bandas representam não ligado siRNA. (B) libertação do siRNA após a incubação com SDS a 2% durante 1 h. As bandas representam siRNA total (não ligado e ligado). Exemplo 1: siRNA; amostra 2: 2 × 10 5 partículas de PCPS / 0,2 ug siRNA; Exemplo 3: 4 x 10 5 partículas de PCPS / 0,2 ug siRNA; amostra 4: 6 x 10 5 partículas de PCPS / 0,2 ug siRNA; amostra 5: 8 × 10 5 partículas de PCPS / 0,2 ug siRNA; amostra 6: 10 × 10 5 partículas de PCPS / 0,2 ug siRNA; Amostra 7: 12 × 10 5 partículas / PCPS 0,2 ug de siRNA.
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Figura 4. imagens de microscopia confocal de PCPS / partículas fluorescentes siRNA (vermelho) em células MDA-MB-231 (24 hr de incubação). O núcleo e a actina filamentosa foi visualizada com 4 ', 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI, azul ) e phalloidin (verde), respectivamente. Três camadas diferentes foram fotografadas (superior, médio e basal). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. fluxo quantitativa de citometria análise fluorescentes MDA-MB-231 células após incubação com PCPS / controlo partículas siRNA fluorescente. As células não tratadas foram usadas como um controlo negativo. 89% de células tinham internalizado as partículas.
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Figura 6. imagens confocal de controle fluorescente siRNA (vermelho) dentro MDA-MB-231. As células foram incubadas com PCPS / fluorescentes partículas siRNA controle por 1 dia, 7 dias e 10 dias. As células foram então visualizadas por microscopia confocal. O núcleo e filamentosas actina foi visualizada com 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, azul) e phalloidin (verde), respectivamente. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7. A viabilidade celular e o silenciamento de genes in vitro. (A) um ensaio de viabilidade celular de células incubadas com partículas de PCPS e partículas de PCPS / controlo siRNA (SCR). O experimento foi realizado em viagemlicate e os resultados são apresentados como média ± desvio padrão. As células não tratadas (em branco) e as células incubadas com PBS foram utilizados como controlos. (B) Western blot de telangiectasia PCPS / ataxia mutado (ATM) partículas de siRNA. As células foram expostas a PCPS / siRNA de controlo (SCR) PCPS partículas e / ATM siRNA. As células não tratadas (simuladas) foram usadas como controlo. β-actina foi utilizado como um controlo de carga.
Vídeo 1 absorção. dependente do tempo de PCPS / partículas fluorescentes siRNA de controlo em células MDA-MB-231 de células vivas. O vídeo foi registada durante 12 horas após exposição das células a partículas.
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Discussion
Este protocolo descreve um método para a entrega com sucesso e transfecção em células de siRNA. Em particular, a entrega de siRNA é conseguido através de uma plataforma multifuncional que consiste em partículas funcionalizadas psi-policatião. O uso de terapia de siRNA tem grande potencial, por exemplo, o tratamento do cancro, como vários oncogenes pode ser alvo com elevada especificidade. Portanto, existe uma procura para o desenvolvimento de veículos de entrega de siRNA, que pode mitigar os desafios de terapia siRNA. Em conclusão, nós esboçamos um protocolo que mostra a promessa para a entrega segura e eficiente de siRNA. No entanto, existem alguns fatores importantes que devem ser levados em consideração quando executar a técnica descrita. Por exemplo, uma consideração importante aquando da preparação das partículas de PCPS é para lidar com o siRNA cuidadosamente, a fim de evitar a degradação por nucleases. Em particular, as luvas limpas e RNAse tubos livres e água deve ser usada em todas as vezes quando se trabalha comsiRNA. Se a eficácia de transfecção siRNA é baixo, um spray que remove a contaminação de RNAse pode ser usado para pulverizar luvas e áreas de trabalho. Além disso, se a transfecção não for bem sucedida, o siRNA deve ser testado com um reagente de transfecção comercial, para determinar se o problema é causado pelo siRNA ou as partículas. Outra consideração crítica para a implementação bem sucedida do sistema de entrega / siRNA PCPS é tomar cuidado ao realizar centrifugação e lavagem passos. Ou seja, o sobrenadante deve ser totalmente eliminados para remover o excesso de reagentes que são necessários durante os passos de preparação de partículas.
Uma vantagem importante do sistema de PCPS / entrega siRNA é a segurança. Vários agentes de transfecção siRNA ter uma carga catiónica elevada, o que contribui para a toxicidade celular 13,15. Na verdade, a maioria dos protocolos comerciais indicam que os reagentes devem ser incubadas com as células durante apenas algumas horas, a fim de evitar a morte celular. Pelo contrário, cells pode ser exposta às partículas de PCPS para vários dias, sem quaisquer sinais de toxicidade, como é evidente a partir dos resultados de viabilidade celular. As partículas de PCPS pode ligar siRNA com elevada afinidade, devido à presença de PEI. No entanto, a toxicidade induzida por carga de PEI é impedido pela configuração original da plataforma de entrega. Especialmente a ligação de Arg em PEI covalente e o encapsulamento de PEI no interior do Si poros contribuir para a toxicidade reduzida. Outra vantagem da plataforma PCPS é que siRNA transfecção pode ter lugar na presença de soro. Outros métodos existentes geralmente requerem a utilização de meios de cultura celular isento de soro, adicionando assim passos adicionais para o processo de transfecção, podendo interferir com vias de sinalização celular regulares.
Um benefício adicional do sistema de PCPS é que não exige qualquer modificação das moléculas de siRNA. Enquanto alguns métodos atuais exigem etapas de conjugação complicadas para estabilizar o siRNA ou para permitir cinternalização ellular 13, o sistema de PCPS depende de mistura simples para siRNA carregamento. A ligação a PEI e os poros no material de Si em proporcionar um ambiente protector para o siRNA, reduzindo assim o contacto com nucleases. As partículas de PCPS pode ser armazenado por períodos de tempo prolongados como material seco ou em álcool isopropílico. Além disso, se as partículas de PCPS / siRNA são liofilizados podem ser armazenados durante pelo menos três meses a 4 ° C. As partículas liofilizadas PCPS deve ser suspenso em água livre de RNase, pouco antes de transfecção, e não deve ser armazenado em solução. Finalmente, as permissões de plataforma PCPS a libertação sustentada de siARN, como relatado anteriormente 11, aumentando consequentemente o período de tempo em que os genes-alvo permanecer suprimida. Por conseguinte, após a internalização celular, as partículas de Si degrada gradualmente, resultando na formação de nanopartículas Arg-PEI / siRNA. Subsequentemente, o siRNA é libertado lentamente no citoplasma, onde pode ligar-se messenger ARN (ARNm), exercendo assim a actividade biológica. Embora, as partículas de PCPS proporcionar diversas vantagens em comparação com os métodos existentes para a entrega de siRNA, uma limitação da técnica é que as micropartículas não-funcionalizado psi são necessários como material de partida. Enquanto as partículas podem ser sintetizados utilizando fotolitografia e ataque corrosivo electroquímico 17, estas técnicas não são prontamente disponíveis em todas as instituições.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polyethylenimine (PEI), branched | Sigma-Aldrich | 408727 | Average molecular weight ~25,000 Da |
| L-Arginine | Sigma-Aldrich | A5006 | Reagent grade, ≥98% |
| Boc-Asp-OH | Sigma-Aldrich | 408-468 | 99% |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763 | 30 wt. % in H2O |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 339741 | 100.00% |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907 | ≥99.7% |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 459844 | ≥99.5% |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) | Sigma-Aldrich | 03449 | ≥99% |
| Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A7030-10G | Blocking agent |
| Ataxia-telangiectasia mutated siRNA | Sigma-Aldrich | Designed in-house | |
| Tris Acetate-EDTA buffer | Sigma-Aldrich | T9650 | For DNA agarose gel electrophoresis |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | Polyethylene glycol sorbitan monolaurate |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250 | For Western blot |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 71496 | For making phosphate buffer |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 71640 | For making phosphate buffer |
| Anti-Mouse IgG | Sigma-Aldrich | A4416 | Secondary antibody (anti-mouse) for Western blot |
| N-Hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 130672 | 98% |
| CELLSTAR 96W Microplate Tissue Culture Treated Clear w/ Lid | Greiner Bio-One | 655182 | 96-well plate |
| 10x Tris-Glycine Liquid | Li-Cor | 928-40010 | Transfer buffer for Western blot |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | Santa Cruz | Sc-281692 | Fixation of cells |
| CellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (MTS) | Promega | G5421 | Proliferation assay |
| Phosphate buffered saline | Fisher Scientific | BP399-500 | 10x Solution |
| Corning cellgro Dulbecco's Modification of Eagle's (Mod.) | Fisher Scientific | MT-15-017-CM | Cell culture media, 1x solution |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | AC21568-2500 | Octyl phenol ethoxylate, permeabilization agent |
| Cover glass | Fisher Scientific | 12-530C | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-1 | For Western blot transfer buffer |
| Plastic Cuvettes | Fisher Scientific | 14-377-010 | For size measurements using Zetasizer Nano ZS |
| Molecular BioProducts RNase AWAY Surface Decontaminant | Fisher Scientific | 14-754-34 | Spray for removing RNAse contamination |
| Agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | Low melting point, for running RNA samples |
| ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | Antifade reagent with DAPI, nucelus detection |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen | A12379 | Dissolve 300 units in 1.5 ml methanol, detection of filamentous actin |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | Invitrogen | S33102 | Visualization of RNA |
| Negative Control siRNA | Qiagen | 1022076 | Control siRNA |
| AllStars Neg. siRNA AF 555 | Qiagen | 1027294 | Fluorescent control siRNA |
| Cell scraper | Celltreat | 229310 | |
| BioLite Multidishes and Microwell Plates | Thermo Scientific | 130184 | 6-well plate |
| Pierce LDS Sample Loading Buffer (4x) | Thermo Scientific | 84788 | Sample loading buffer for Western blot |
| Pierce BCS Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | Protein quantification assay |
| Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktails (100x) | Thermo Scientific | 78430 | Protease inhibitor cocktail, use at 1x |
| M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent | Thermo Scientific | 78501 | Protein extraction reagent |
| Sorvall Legend Micro 21R | Thermo Scientific | 75002440 | Centrifuge |
| Beta Actin Antibody | Thermo Scientific | MA1-91399 | β-actin primary antibody (from mouse) for western blot |
| 6x TriTrack DNA Loading Dye | Thermo Scientific | R1161 | DNA loading dye |
| Nuclease-Free Water | Life Technologies | AM9938 | |
| Non-Fat Dry Milk | Lab Scientific | M0841 | For Western blot |
| 2-well BD Falcon culture slides | BD Biosciences | 354102 | 2-well culture slides |
| Amersham ECL Western blot detection reagent | GE Healthcare Life Sciences | RPN2106 | Western blot detection reagent |
| BA Membranes | GE Healthcare Life Sciences | 10402096 | Nitrocellulose membrane for Wester blot |
| ATM (D2E2) Rabbit mAb | Cell Signaling | 2873S | ATM primary antibody (from rabbit) for Western blot |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7074 | Secondary antibody (anti-rabbit) for Western blot |
| Folded capillary cells | Malvern | DTS 1061 | For zeta potentail measurements using Zetasizer Nano ZS |
| MDA-MB-231 cell line | ATCC | HTB-26 | Mammary Gland/Breast |
| 12% Mini-PROTEAN TGX Gel | Bio-rad | 456-1043 | For Western blot |
| Biorad PowerPac HC | Bio-rad | 164-5052 | Power supply for electrophoresis |
| 10x Tris/Glycine/SDS Buffer | Bio-rad | 161-0732 | Running buffer for Western blot |
| Wide Mini-Sub Cell GT Cell | Bio-rad | 170-4405 | Electrophoresis equipment for DNA agarose gel |
| Mini-PROTEAN Tetra cell | Bio-rad | 165-8000 | Electrophoresis equipment for Western blot |
| ChemiDoc XRS+ System with Image Lab Software | Bio-rad | 170-8265 | Image acquisition and analysis software for gels and blots |
| 4" (10 cm) dia., 5 x 7 mm diced Silicon Wafer | Ted Pella | 16007 | Silicon waferfor scanning electron microscopy and atomic force microscopy |
| Thermomixer R | Eppendorf | 22670107 | Shaker |
| Isoton II diluent | Beckman Coulter | 8546719 | Isoton diluent |
| Multisizer 4 Coulter Counter | Beckman Coulter | A63076 | Particle counting analyzer |
| Non-functionalized porous silicon particles | Microelectronics Research Center, University of Texas at Austin | Dicoidal shape. 2.6 μm (diameter) x 0.7 μm (height), provided in isopropyl alcohol | |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | Particle analyzer system for size and zeta potential | |
| Scanning Electron Microscope | FEI | Particle size and shape | |
| Atomic Force Microscope | Bruker | Particle size and shape | |
| Fluo ViewTM 1000 Confocal Microscope | Olympus | Visualization of fixed and live cells |
References
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