Summary
Leverans är fortfarande den största utmaningen för den terapeutiska genomföra små störande RNA (siRNA). Detta protokoll förutsätter användning av en multifunktionell och biokompatibel siRNA leveransplattform, som består av arginin och polyetylenimin ympade porösa kiselmikropartiklar.
Introduction
Små störande RNA (siRNA) är dubbelsträngade RNA-molekyler som kan undertrycka uttrycket av gener. Under de senaste åren har siRNA utvecklats som en ny generation biodrugs som visar terapeutisk potential för framtida användning i kliniska tillämpningar 1-5. Dock kvarstår ett framgångsrikt genomförande av siRNA terapi en betydande utmaning, på grund av nedbrytning av nukleaser, dålig intracellulär upptag, låg transfektionseffektivitet och ineffektiv frigivning från endosomen / lysosome 5. Många av dessa hinder kan övervinnas genom utveckling av leveransplattformar, vilket säkert och effektivt kan leverera siRNA till sjuk vävnad. Jämfört med virusbärare, icke-virala plattformar ger flera fördelar, såsom säkerhet, låg kostnad och enkel skrädderi. I synnerhet katjoniska nanopartiklar, såsom polymerer och lipider, har visat sig vara användbart för siRNA leverans 3.
Tidigare har vi tagit fram en skivformig drug leveranssystem, kallade flerstegs vektorn (MSV). Denna plattform är baserad på varandra följande steg, i vilket ett fordon är frigjorda från en annan. Det första steget fordonet är en mikropartikel tillverkad av biologiskt nedbrytbar poröst kisel (PSI), medan den andra etappen fordon är nanopartiklar laddade med läkemedel eller kontrastmedel 6,7. Nanopartiklarna, som är inbäddade i PSI materialet, gradvis släppt som Si degraderar 8. En fördel med att använda Si-partiklar är att morfologin och ytegenskaperna enkelt kan skräddarsys för att uppnå optimal biofördelning och läkemedelsfrisättning. Nyligen var en framgångsrik användning av MSV plattform för leverans av siRNA liposomer till tumörvävnad som visas i en äggstocks och bröstcancer musmodell 9, 10.
I detta arbete har vi tillverkat ett universellt leveranssystem för siRNA baserat på huvudmännen i MSV-plattformen. Effekten av detta leveranssystem har tidigare visats ossing olika siRNA-molekyler 11. Systemet är en polykatjon-functionalized poröst kisel (PCPS) bärare, som består av psi ympad med polyetylenimin (PEI) och arginin (Arg). PEI kan hjälpa till vid bildande av elektrostatiska interaktioner med siRNA, medan Arg och Psi kan tjäna till att reducera toxiciteten av PEI, som tidigare demonstarted 11. Dessutom kan närvaron av PEI hjälpa intracellulär upptag och endosomal fly, medan PSI mikro möjliggör siRNA skydd och fördröjd frisättning. Psi partiklarna successivt försämra under fysiologiska förhållanden, vilket resulterar i bildandet av Arg-PEI / siRNA nanopartiklar (Figur 1), som har en distinkt morfologi och en snäv storleksfördelning 11. För detaljer om stabiliteten i PCPS / siRNA-systemet, se studien av Shen et al. 11. Denna PCPS plattform skiljer sig från den konventionella MSV, eftersom andra steget nanopartiklar inte initialt present i bäraren, men bildas med tiden som den första etappen bäraren degraderar 11, 12. Den siRNA lastning effektivitet, cytotoxicitet och gen tysta effektivitet PCPS systemet har utvärderats in vitro. Transfektionseffektivitet mättes med användning siRNA mot ataxia telangiectasia mutated (ATM) onkogenen, som är involverat i DNA-reparation 10. Tidigare har undertryckandet av ATM visats minska tumörtillväxt i en bröstcancermodell 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. PCPS Partikel Förberedelse
- Oxidera icke-funktionaliserade porösa kiselpartiklar i en 30% lösning av väteperoxid vid 95 ° C under 2 h. Aminera de oxiderade partiklarna i 2% (3- aminopropyl) trietoxisilan lösning i isopropylalkohol under 2 dagar vid 65 ° C med försiktig omröring.
- Centrifugera lösningen under 30 minuter vid 18.800 xg och tvätta partiklarna två gånger i isopropylalkohol och tre gånger i etanol, med användning av kortvarig sonikering för att suspendera pelleten. Lämna partiklarna i etanollösning när du utför steg 1.3 och 1.4.
- Lägg en känd volym partikelsuspension (t.ex. 10 ^ il) till 10 ml isoton utspädningsmedel och räkna partiklarna med en partikelräkning analysator för att bestämma koncentrationen av partiklar i förrådslösningen.
- Aktivera syragruppen av L-arginin (0,1 nmol) med N - (3-dimetylaminopropyl) - N '-ethylcarbodiimide klorid (EDC, 0,1 nmol) / N
- Sonikera kort på partikelstamlösningen och tillsätt 1 miljard partiklar till L-arginin lösning och låt reaktionen under 18 timmar vid RT med försiktig omrörning.
- Aktivera första asparaginsyra grupp av N - (tert-butoxikarbonyl) -L-asparaginsyra (Boc-Asp-OH, 1 nmol) med EDC (0,1 nmol) / NHS (0,1 nmol) i 20 ml etanol under 4 h vid 4 ° C under försiktig omröring.
- Lös 50 mg polyetylenimin i 10 ml etanol och tillsätt lösningen till Boc-Asp-OH blandning. Låt reaktionen fortgå under 24 h vid RT under försiktig omröring.
- Aktivera andra asparaginsyra grupp av Boc-Asp-OH / PEI-lösning med EDC (0,1 nmol) / NHS (0,1 nmol) vid 4 ° C under 6 h med försiktig omröring.
- För att erhålla PCPS partiklar, tillpartikellösningen från steg 1,5 till Boc-Asp-OH / PEI-lösning från steg 1,8. Låt reaktionen fortgå under 18 h vid RT med mild st irring.
- Centrifugera lösningen under 30 minuter vid 18.800 xg och tvätta partikellösningen tre gånger med etanol, med användning av kortvarig sonikering för att suspendera pelleten.
2. PCPS Particle Characterization
- Mät storleken av partiklarna med användning av ett svepelektronmikroskop (SEM).
- Placera en droppe partikelsuspension (10.000 partiklar / ul i etanol) på en ren kiseldioxid SEM prov påbörjad och låt torka vid RT under vakuum.
- Mät SEM-bilder på 8 kV med en 3-5 mm arbetsavstånd med hjälp av en in-lins detektor.
- Mät zeta-potentialen för partiklarna med användning av ett partikelanalyssystem.
- Blanda 10 pl av partikelsuspension (10000 partiklar / | il i etanol) med 1 ml av 10 mM fosfatbuffert (pH 7,4).
- Fyll på provet i vikta kapilärceller och mäta zeta-potentialen i enlighet med tillverkarens instruktioner.
- Torka PCPS partiklar (från PCPS partikel förberedelse steg 1,9) under vakuum O / N.
- Lägg siRNA (4 | ig) i nukleasfritt vatten (20 | il) till de torkade PCPS partiklarna och sonikera ett ögonblick. Använd följande partikeln till siRNA förhållanden: 2 × 10 5 partiklar / 0,2 mikrogram siRNA, 4 × 10 5 partiklar / 0,2 mikrogram siRNA, 6 × 10 5 partiklar / 0,2 mikrogram siRNA, 8 × 10 5 partiklar / 0,2 mikrogram siRNA, 10 × 10 5 partiklar / 0.2 ug siRNA och 12 × 10 5 partiklar / 0.2 ug siRNA.
- Inkubera under 3 h vid 4 ° C på en skakanordning (1000 rpm) för att tillåta siRNA bindning till partiklarna.
4. Optimering av siRNA / PCPS Partikel Ratio
- Lägg DNA laddningsfärg till 20 pl av siRNA partiklarna PCPS / kontroll med olika partikel till siRNA-förhållanden (se lastning av siRNA in PCPS partiklar).
- Fyll på sampel i en 2% agarosgel innehållande DNA gel fläcken.
- Utför elektrofores vid en konstant spänning av 120 V under 20 min i rinnande buffert.
- Analysera gelen med bild förvärv och analysprogram.
5. Utsläpp av siRNA från PCPS Partiklar
- Blanda 20 l av siRNA partiklarna PCPS / kontroll med olika partikel till siRNA förhållanden (se steg 3) i natriumdodecylsulfat (SDS, 2%) och låt stå i 1 timme vid RT.
- Lägg DNA laddningsfärg till proverna.
- Last prov till en 2% agarosgel innehållande DNA gel fläck.
- Utför elektrofores vid en konstant spänning av 120 V under 20 min i rinnande buffert med användning av DNA-elektroforesutrustningen och en strömkälla.
- Analysera gelen med bild förvärv och analysprogram.
6. konfokalmikroskopi av PCPS Partiklar
- Tillsätt 5 pl PCPS / fluorescerande siRNA partiklar kontroll (10 × 10 5 partiklar / 0.2 ug siRNA / 20 ^) till en glaskupa halka.
- Visualisera partikellager av konfokalmikroskopi.
7. Karakterisering av Arg-PEI / kontroll siRNA Nanopartiklar
- För att bryta ned kiselmaterialet och bilda Arg-PEI / kontroll siRNA nanopartiklar, till PCPS / siRNA partiklar (10 × 10 6 PCPS partiklar / 2 ^ g siRNA) till 100 | il av fosfatbuffrad saltlösning och skaka (1000 rpm) vid 37 ° C under 2 dagar.
- Centrifugera provet under 30 min vid 18800 xg och samla supernatanten.
- Mät storleken av de bildade Arg-PEI / siRNA nanopartiklar med dynamisk ljusspridning (DLS).
- Blanda 10 pl av supernatanten med 1 ml 10 mM fosfatbuffert (pH 7,4) och placera i en plastkyvett.
- Mät storleken av partiklarna med användning av ett partikelanalyssystem enligt tillverkarens instruktioner.
- Bestäm storlek och morfologi bildade Arg / PEI-siRNAnanopartiklar med atomkraftsmikroskopi.
- Ta 10 | j, l av supernatanten och placera på en kiselskiva.
- Visualisera partiklarna med atomkraftsmikroskopi (AFM).
8. Cell Culture
- Kultur MDA-MB-231 humana bröstcancerceller i cellodlingsmedia kompletterat med 10% fetalt bovint serum och 1% penicillin-streptomycin vid 5% CO2, 95% fuktighet och 37 ° C.
9. konfokalmikroskopi av levande celler med PCPS Partiklar
- Plate celler i 2-brunnars odlings glider med en såddtäthet av 3 x 10 5 celler / brunn under 24 h.
- Lägg PCPS partiklar laddade med fluorescerande kontroll siRNA (10 × 10 5 partiklar / 0,2 mikrogram partikel till siRNA-förhållande, 50 nM siRNA) till celler.
- Spela in en film av cellerna med ett konfokalmikroskop (levereras med en kammare, 5% CO2, 95% fuktighet och 37 ° C) under 12 h följande partikel exposäker.
10. konfokalmikroskopi av fixerade celler med PCPS Partiklar
- Plate celler i 2-brunnars odlings glider med en såddtäthet av 3 x 10 5 celler / brunn under 24 h.
- Lägg PCPS partiklar laddade med fluorescerande kontroll siRNA (10 × 10 5 partiklar / 0,2 mikrogram partikel till siRNA-förhållande, 50 nM siRNA) till celler och inkubera i 1 dag, 7 dagar och 10 dagar.
- Tvätta cellerna två gånger med fosfatbuffrad saltlösning och därefter fixera dem med 4% paraformaldehydlösning under 10 min.
- Tvätta cellerna med fosfatbuffrad saltlösning.
- Permeabilisera cellerna med 0,1% oktylfenol-etoxylat till 10 min och sedan tvätta dem tre gånger med fosfatbuffrad saltlösning.
- Blockera cellerna med albumin från bovint serum (10 mg / ml) i fosfatbuffrad saltlösning under 10 min vid RT under försiktig omröring.
- Att visualisera fintrådiga aktin, inkubera cellerna med fluorescerande phalloidin (1 pl / 40 ^blockeringslösning) under 20 min vid RT under försiktig omröring och sedan tvätta i fosfatbuffrad saltlösning.
- Ta bilderna från ramen och lägga antifade reagens med 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) för att visualisera kärnan.
- Lägg ett täckglas på toppen och ta bilder av de celler med konfokalmikroskopi.
11. Flödescytometri av celler med PCPS / fluorescerande Kontroll siRNA Partiklar
- Plate celler i en 6-brunnsplatta med en såddtäthet av 3 x 10 5 celler / brunn under 24 h.
- Lägg PCPS partiklar laddade med fluorescerande kontroll siRNA (10 × 10 5 partiklar / 0,2 mikrogram partikel till siRNA-förhållande, 50 nM siRNA) till cellerna och inkubera i 24 timmar.
- Tvätta cellerna med fosfatbuffrad saltlösning och skrapa dem med en cellskrapa.
- Förvara cellerna i fosfatbuffrad saltlösning med 2% fetalt bovint serum före analys. Använd obehandlade celler som en negativ kontroll.
- Utför flödes cytometry.
12. Cell livskraft celler med PCPS Partiklar och PCPS / kontroll siRNA Partiklar
- Plate celler i en 96-brunnsplatta vid en celldensitet av 3 x 10 3 celler / brunn under 24 h.
- Behandla cellerna med PCPS partiklar (1,5 × 10 5 / brunn och 6 × 10 5 / brunn) eller siRNA partiklar PCPS / kontroll (10 × 10 5 partiklar / 0,2 mikrogram partikel till siRNA-förhållande, 10 nM och 100 nM siRNA) för 48 h och 72 h. Använd obehandlade celler och celler behandlade med fosfatbuffrad saltlösning (samma volym som de tillsatta partiklarna) som kontroller. Analysera varje prov i tre exemplar.
- Utför en cellproliferationsanalys i enlighet med tillverkarens instruktioner.
- Representera data som medelvärde ± standardavvikelse.
13. Western Blot av celler med PCPS / ATM Mutated siRNA Partiklar
- Plate celler i en 6-brunnsplatta vid en celldensitet 2 x 10 5 celler / viktell för 24 h.
- Inkubera cellerna med PCPS / kontroll siRNA (50 nM) partiklar eller PCPS / ATM siRNA (50 nM) partiklar för 72 timmar. Använd obehandlade celler som kontroll.
- Lyse cellerna med användning av en protein extraktion reagens kompletterat med en proteasinhibitorcocktail.
- Centrifugera cellysaten för 10 min vid 14000 x g och återvinna supernatanten.
- Bestäm proteinkoncentrationen med ett protein kvantifiering analys enligt tillverkarens instruktioner.
- Lägg provladdningsbuffert (med 5 ^ il 2-merkaptoetanol / ml buffert) till proverna och värma dem för 6 min vid 99 ° C.
- Ladda de proteinprover (20 ^ g / | il) i en 12% SDS-polyakrylamidgel i rinnande buffert och utför polyakrylamidgelelektrofores (1 h, 120 V) med användning av elektroforesutrustning och en strömkälla.
- Överför gelén i överföringsbuffert (med 20% metanol) till ett nitrocellulosamembran (1 h, 100 V) med användning av elektroforesutrustning ochen strömförsörjning.
- Blockera membranet med 5% torrmjölk under 1 timme.
- Inkubera membranet med ATM primära antikroppen (från kanin) i blockerande lösningen (från steg 13,9) vid en 1: 1000 späd O / N.
- Tvätta membranet med fosfatbuffrad saltlösning innehållande 0,1% polyetylenglykol sorbitanmonolaurat och sedan inkubera det med den sekundära antikroppen (anti-kanin) i blockeringslösning (från steg 13.9) vid en 1: 2500 spädning under 1 h.
- Tvätta membranet med fosfatbuffrad saltlösning innehållande 0,1% polyetylenglykol sorbitanmonolaurat och upptäcka proteinbanden med Western blot detektionsreagenset använder bildtagning och analysprogram.
- För laststyrning, tvätta membranet och upprepa steg från 13,9 till 13,12 med hjälp av en β-aktin primär antikropp (från mus, 1: 10.000 utspädning) och en sekundär antikropp (anti-mus 1: 4,000 utspädning).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta protokoll beskriver användningen av ett icke-viralt leveranssystem för säker och effektiv siRNA transfektion. SEM-resultat avslöjar att PCPS partiklarna är cylindrisk till formen och har en diameter på 2,6 ^ m (Figur 2A). Partiklarna är positivt laddade med en zeta-potential av ca 8,21 (fig 2B), varigenom elektrostatisk bindning med negativt laddade nukleotider. Konfokala bilder av olika lager av de PCPS partiklarna visar att fluorescerande kontroll siRNA laddas inuti porösa kiselpartiklar (figur 2C). Bildning och utsläpp av Arg-PEI / siRNA nanopartiklar från Psi partiklarna bekräftades med DLS och AFM. Storleksfördelningen för partiklama varierade från 70 till 120 nm, med en medelstorlek av 94 nm (Figur 2D). AFM-bilder illustrerar att nanopartiklarna har en sfärisk form (Figur 2E).
Den ratio av partiklarna till siRNA optimerades genom agarosgelelektrofores för att garantera hög bindningsaffinitet (figur 3A). Ett brett utbud av partikel till siRNA-förhållanden användes (2 x 10 5, 4 x 10 5, 6 x 10 5, 8 × 10 5, 10 × 10 5 och 12 × 10 5 /0.2 ug siRNA). Resultaten indikerar att siRNA kan binda tätt till partiklarna när partikel mängden är över 8 x 10 5. Ett förhållande av 10 x 10 5 PCPS / 0,2 ug siRNA valdes för ytterligare experiment. Vidare siRNA lyckades frigöras från bäraren när de behandlades med SDS, såsom illustreras i figur 3B.
Därefter källaren internalisering av PCPS / fluorescerande siRNA partiklar kontroll utvärderades i MDA-MB-231-celler. Konfokala bilder tagna efter 24 h av behandlings visar att partiklarna effektivt internaliseras i celler (Figur 4 Figur 5 visar att 89% av cellerna har intern PCPS / siRNA partiklarna efter 24 h av inkubation. Dessutom var internaprocessen registreras för 12 timmar (Video 1). Dessa resultat indikerar att de PCPS partiklarna effektivt kan leverera siRNA in i celler. Den långsiktiga ackumulering av siRNA inuti cellerna utvärderades också genom konfokalmikroskopi. Vid dag 7 och dag 10 siRNA kunde fortfarande detekteras inuti cellerna (Figur 6).
En av de viktigaste faktorerna att tänka på när man utvecklar ett siRNA leveranssystem är säkerheten för bäraren 13. PEI är känd för att bilda polyplex med siRNA, stöd i cellulärt upptag och trigger frigivning från endosomen / lysosomen. Emellertid kan PEI ha toxiska effekter, beroende på närvaron av positivt laddade primära aminogrupper i huvudkedjan 14,15. Exempelvis PEI bindning till glykokalyxen på cellytan kan resultera i att formation av stora kluster 16. För att eliminera denna avgift-inducerad toxicitet, var PEI kovalent konjugerad till arginin genom en bro-linker, för att minska antalet primära aminogrupper. Cellen viabilitet förblev över 95% efter 48 h och 72 h när partiklar och siRNA användes vid en koncentration av upp till 6 x 10 5 / brunn och 100 nM, respektive (figur 7A). Därefter tillsattes transfektionsblandningen effekten av siRNA mot onkogenen ATM utvärderades i MDA-MB-231-celler. Western blot resultat visar att proteinnivåerna ATM är minskade efter behandling med PCPS / ATM siRNA (figur 7B). Resultaten tyder på att PCPS plattformen är ett säkert och effektivt leveranssystem för siRNA.
Figur 1. Schematisk bild av polykatjonkomplex-funktion porösa kisel (PCPS) partiklar. strong> arginin (Arg) -polyethylenimine (PEI) / små störande RNA (siRNA) nanopartiklar bildas efter nedbrytning av kisel (Si).
Figur 2. Karakterisering av PCPS-partiklar. (A) Svepelektronmikroskopi (SEM) bild av PCPS partiklar. (B) Zeta-potential av PCPS partiklar. (C) Confocal bilder av olika lager av de kontroll siRNA partiklarna PCPS / fluorescerande. (D) Storleksfördelning av de arginin- Arg-PEI / kontroll siRNA nanopartiklar som frigörs från de porösa kiselmikropartiklarna. (E) atomkraftsmikroskopi (AFM) bilder av Arg-PEI / kontroll siRNA nanopartiklar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Agaros gel för optimering av PCPS / siRNA leveranssystem. (A) Bindning affinitet mellan PCPS partiklarna och styra siRNA. Banden representerar obundet siRNA. (B) siRNA frisättning efter inkubering med 2% SDS under 1 h. Banden representerar totalt siRNA (obundet och bundet). Prov 1: siRNA; prov 2: 2 × 10 5 PCPS partiklar / 0.2 ug siRNA; prov 3: 4 × 10 5 PCPS partiklar / 0.2 ug siRNA; Prov 4: 6 x 10 5 PCPS partiklar / 0.2 ug siRNA; prov 5: 8 x 10 5 PCPS partiklar / 0.2 ug siRNA; prov 6: 10 × 10 5 PCPS partiklar / 0.2 ug siRNA; prov 7: 12 × 10 5 PCPS partiklar / 0.2 ug siRNA.
75 / 52075fig4.jpg "/>
Figur 4. Confocal mikroskop bilder av PCPS / fluorescerande siRNA partiklar (röd) i MDA-MB-231-celler (24 tim inkubation). Kärnan och fintrådiga aktin visualiserades med 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, blå ) och phalloidin (grön), respektive. Tre olika skikten avbildas (överst, mitten och basal). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Kvantitativ flödescytometrianalys av fluorescerande MDA-MB-231-celler efter inkubation med PCPS / kontroll fluorescerande siRNA partiklar. Obehandlade celler användes som en negativ kontroll. 89% av cellerna hade internalis partiklarna.
igure 6 "src =" / filer / ftp_upload / 52.075 / 52075fig6.jpg "/>
Figur 6. Konfokala bilder av fluorescerande kontroll siRNA (röd) inuti MDA-MB-231-celler. Celler inkuberades med PCPS / fluorescerande kontroll siRNA partiklar för 1 dag, 7 dagar och 10 dagar. Cellerna visualiserades sedan med konfokalmikroskopi. Kärnan och fintrådiga aktin visualiserades med 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, blå) och phalloidin (grön), respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7. Cellviabilitet och gentystande in vitro. (A) En cellviabiliteten analys av celler inkuberade med PCPS partiklar och PCPS / kontroll siRNA partiklar (SCR). Experiment utfördes i resalicate och resultaten presenteras som medelvärde ± standardavvikelse. Obehandlade celler (blank) och celler inkuberade med PBS användes som kontroller. (B) Western blot av PCPS / ataxi telangiectasia muterat (ATM) siRNA-partiklar. Celler exponerades för PCPS / kontroll siRNA (SCR) partiklar och PCPS / ATM siRNA partiklar. Obehandlade celler (mock) användes som en kontroll. β-aktin användes som en laddningskontroll.
Video 1 . Tidsberoende upptag av PCPS / fluorescerande kontroll siRNA partiklar i levande MDA-MB-231-celler. Videon spelades in under 12 timmar efter exponering av cellerna för partiklar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskriver en metod för framgångsrik leverans och transfektion av siRNA in i celler. I synnerhet är leveransen av siRNA uppnås genom att använda en multifunktionell plattform bestående av polykatjonkomplex-funktionaliserad Psi partiklar. Användningen av siRNA terapi har stor potential, t.ex. cancerbehandling, eftersom olika onkogener kan riktas med hög specificitet. Därför finns ett behov att utveckla siRNA leverans fordon, vilket kan mildra de utmaningar som siRNA terapi. Sammanfattningsvis har vi skiss ett protokoll som visar löfte för en säker och effektiv leverans av siRNA. Det finns dock några viktiga faktorer som bör beaktas när man utför den beskrivna tekniken. Exempelvis är en viktig faktor vid framställning av PCPS partiklarna att hantera siRNA noga, för att undvika nedbrytning av nukleaser. I synnerhet, rena handskar och RNAse fria rör och vatten bör användas vid alla tillfällen när du arbetar medsiRNA. Om siRNA transfektion effekt är låg, kan en spray som tar bort RNAse kontamination användas för att spraya handskar och arbetsområden. Dessutom, om transfektion misslyckas siRNA bör testas med ett kommersiellt transfektionsreagens, för att avgöra om problemet orsakas av siRNA eller partiklarna. En annan kritisk fråga för ett framgångsrikt genomförande av PCPS / siRNA leveranssystem är att ta hand när du utför centrifugering och tvättsteg. Nämligen, bör supernatanten helt kastas för att avlägsna överskott av reagens som krävs under beredning partikel steg.
En viktig fördel med PCPS / siRNA leveranssystem är säkerhet. Flera siRNA transfektion agenter har en hög katjonisk laddning, vilket bidrar till cellulär toxicitet 13,15. Faktum flesta kommersiella protokoll visar att reagenserna bör inkuberas med cellerna för bara några timmar, för att undvika celldöd. Tvärtom cells kan exponeras för PCPS partiklar för flera dagar utan några tecken på toxicitet, vilket framgår av cellviabiliteten resultaten. De PCPS partiklarna kan binda siRNA med hög affinitet på grund av närvaron av PEI. Emellertid laddningen-inducerad toxicitet av PEI förhindras genom den unika inställningen av leveransplattform. Speciellt den kovalenta bindningen av Arg till PEI och inkapsling av PEI inuti Si porer bidrar till reducerad toxicitet. En annan fördel med PCPS-plattformen är att siRNA transfektion kan äga rum i närvaro av serum. Andra existerande metoder kräver vanligen användning av serumfritt cellodlingsmedium, därmed lägga till ytterligare steg i transfektion processen och potentiellt störa vanliga cellsignaleringsvägar.
En ytterligare fördel med PCPS systemet är att det inte kräver någon ändring av siRNA-molekyler. Medan vissa nuvarande metoder kräver komplicerade konjugeringstekniker åtgärder för att stabilisera siRNA eller för att möjliggöra cellular interna 13 förlitar sig PCPS systemet enkel blandning för siRNA lastning. Bindningen till PEI och porerna i Si-materialet ger en skyddande miljö för siRNA, vilket minskar kontakt med nukleaser. De PCPS partiklarna kan lagras under längre tidsperioder som torkat material eller i isopropylalkohol. Dessutom, om de PCPS / siRNA partiklar frystorkas de kan lagras i minst tre månader vid 4 ° C. De frystorkade PCPS partiklar ska suspenderas i RNas fritt vatten strax före transfektion, och bör inte förvaras i lösning. Slutligen de PCPS plattform tillåter fördröjd frisättning av siRNA, som tidigare rapporterats 11, därmed ökar den tidsperiod då rikta gener förblir undertryckt. Följaktligen, efter cellulär interna, de Si-partiklar gradvis brytas ned, vilket resulterar i bildningen av Arg-PEI / siRNA nanopartiklar. Därefter siRNA långsamt frisätts i cytoplasman, där den kan binda till messenger-RNA (mRNA) och utövar därigenom biologisk aktivitet. Även PCPS partiklar ger flera fördelar jämfört med befintliga metoder för siRNA leverans, är en begränsning i tekniken att icke-funktion PSI mikropartiklar behövs som utgångsmaterial. Medan partiklarna kan syntetiseras med användning av fotolitografi och elektrokemisk etsning 17 är dessa tekniker inte är lätt tillgängliga vid alla institutioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polyethylenimine (PEI), branched | Sigma-Aldrich | 408727 | Average molecular weight ~25,000 Da |
| L-Arginine | Sigma-Aldrich | A5006 | Reagent grade, ≥98% |
| Boc-Asp-OH | Sigma-Aldrich | 408-468 | 99% |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763 | 30 wt. % in H2O |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 339741 | 100.00% |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907 | ≥99.7% |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 459844 | ≥99.5% |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) | Sigma-Aldrich | 03449 | ≥99% |
| Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A7030-10G | Blocking agent |
| Ataxia-telangiectasia mutated siRNA | Sigma-Aldrich | Designed in-house | |
| Tris Acetate-EDTA buffer | Sigma-Aldrich | T9650 | For DNA agarose gel electrophoresis |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | Polyethylene glycol sorbitan monolaurate |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250 | For Western blot |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 71496 | For making phosphate buffer |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 71640 | For making phosphate buffer |
| Anti-Mouse IgG | Sigma-Aldrich | A4416 | Secondary antibody (anti-mouse) for Western blot |
| N-Hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 130672 | 98% |
| CELLSTAR 96W Microplate Tissue Culture Treated Clear w/ Lid | Greiner Bio-One | 655182 | 96-well plate |
| 10x Tris-Glycine Liquid | Li-Cor | 928-40010 | Transfer buffer for Western blot |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | Santa Cruz | Sc-281692 | Fixation of cells |
| CellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (MTS) | Promega | G5421 | Proliferation assay |
| Phosphate buffered saline | Fisher Scientific | BP399-500 | 10x Solution |
| Corning cellgro Dulbecco's Modification of Eagle's (Mod.) | Fisher Scientific | MT-15-017-CM | Cell culture media, 1x solution |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | AC21568-2500 | Octyl phenol ethoxylate, permeabilization agent |
| Cover glass | Fisher Scientific | 12-530C | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-1 | For Western blot transfer buffer |
| Plastic Cuvettes | Fisher Scientific | 14-377-010 | For size measurements using Zetasizer Nano ZS |
| Molecular BioProducts RNase AWAY Surface Decontaminant | Fisher Scientific | 14-754-34 | Spray for removing RNAse contamination |
| Agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | Low melting point, for running RNA samples |
| ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | Antifade reagent with DAPI, nucelus detection |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen | A12379 | Dissolve 300 units in 1.5 ml methanol, detection of filamentous actin |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | Invitrogen | S33102 | Visualization of RNA |
| Negative Control siRNA | Qiagen | 1022076 | Control siRNA |
| AllStars Neg. siRNA AF 555 | Qiagen | 1027294 | Fluorescent control siRNA |
| Cell scraper | Celltreat | 229310 | |
| BioLite Multidishes and Microwell Plates | Thermo Scientific | 130184 | 6-well plate |
| Pierce LDS Sample Loading Buffer (4x) | Thermo Scientific | 84788 | Sample loading buffer for Western blot |
| Pierce BCS Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | Protein quantification assay |
| Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktails (100x) | Thermo Scientific | 78430 | Protease inhibitor cocktail, use at 1x |
| M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent | Thermo Scientific | 78501 | Protein extraction reagent |
| Sorvall Legend Micro 21R | Thermo Scientific | 75002440 | Centrifuge |
| Beta Actin Antibody | Thermo Scientific | MA1-91399 | β-actin primary antibody (from mouse) for western blot |
| 6x TriTrack DNA Loading Dye | Thermo Scientific | R1161 | DNA loading dye |
| Nuclease-Free Water | Life Technologies | AM9938 | |
| Non-Fat Dry Milk | Lab Scientific | M0841 | For Western blot |
| 2-well BD Falcon culture slides | BD Biosciences | 354102 | 2-well culture slides |
| Amersham ECL Western blot detection reagent | GE Healthcare Life Sciences | RPN2106 | Western blot detection reagent |
| BA Membranes | GE Healthcare Life Sciences | 10402096 | Nitrocellulose membrane for Wester blot |
| ATM (D2E2) Rabbit mAb | Cell Signaling | 2873S | ATM primary antibody (from rabbit) for Western blot |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7074 | Secondary antibody (anti-rabbit) for Western blot |
| Folded capillary cells | Malvern | DTS 1061 | For zeta potentail measurements using Zetasizer Nano ZS |
| MDA-MB-231 cell line | ATCC | HTB-26 | Mammary Gland/Breast |
| 12% Mini-PROTEAN TGX Gel | Bio-rad | 456-1043 | For Western blot |
| Biorad PowerPac HC | Bio-rad | 164-5052 | Power supply for electrophoresis |
| 10x Tris/Glycine/SDS Buffer | Bio-rad | 161-0732 | Running buffer for Western blot |
| Wide Mini-Sub Cell GT Cell | Bio-rad | 170-4405 | Electrophoresis equipment for DNA agarose gel |
| Mini-PROTEAN Tetra cell | Bio-rad | 165-8000 | Electrophoresis equipment for Western blot |
| ChemiDoc XRS+ System with Image Lab Software | Bio-rad | 170-8265 | Image acquisition and analysis software for gels and blots |
| 4" (10 cm) dia., 5 x 7 mm diced Silicon Wafer | Ted Pella | 16007 | Silicon waferfor scanning electron microscopy and atomic force microscopy |
| Thermomixer R | Eppendorf | 22670107 | Shaker |
| Isoton II diluent | Beckman Coulter | 8546719 | Isoton diluent |
| Multisizer 4 Coulter Counter | Beckman Coulter | A63076 | Particle counting analyzer |
| Non-functionalized porous silicon particles | Microelectronics Research Center, University of Texas at Austin | Dicoidal shape. 2.6 μm (diameter) x 0.7 μm (height), provided in isopropyl alcohol | |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | Particle analyzer system for size and zeta potential | |
| Scanning Electron Microscope | FEI | Particle size and shape | |
| Atomic Force Microscope | Bruker | Particle size and shape | |
| Fluo ViewTM 1000 Confocal Microscope | Olympus | Visualization of fixed and live cells |
References
- De Fougerolles, A., Vornlocher, H. P., Maraganore, J., Lieberman, J. Interfering with disease: a progress report on siRNA-based therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 6 (6), 443-453 (2007).
- Rolland, A.
- Oh, Y. K., Park, T. G. siRNA delivery systems for cancer treatment. Adv Drug Deliv Rev. 61 (10), 850-862 (2009).
- Mintzer, M. A., Simanek, E. E. Nonviral vectors for gene delivery. Chem Rev. 109 (2), 259-302 (2009).
- Whitehead, K. A., Langer, R., Anderson, D. G. Knocking down barriers: advances in siRNA delivery. Nat Rev Drug Discov. 8 (2), 129-138 (2009).
- Decuzzi, P., et al. Size and shape effects in the biodistribution of intravascularly injected particles. J Control Release. 141 (3), 320-327 (2010).
- Decuzzi, P., Ferrari, M. Design maps for nanoparticles targeting the diseased microvasculature. Biomaterials. 29 (3), 377-384 (2008).
- Martinez, J. O., Evangelopoulos, M., Chiappini, C., Liu, X., Ferrari, M., Tasciotti, E. Degradation and biocompatibility of multistage nanovectors in physiological systems. J Biomed Mater Res A. 102 (10), 3540-3549 (2014).
- Shen, H., et al. Enhancing chemotherapy response with sustained EphA2 silencing using multistage vector delivery. Clin Cancer Res. 19 (7), 1806-1815 (2013).
- Xu, R., et al. Multistage vectored siRNA targeting ataxia-telangiectasia mutated for breast cancer therapy. Small. 9 (9-10), 1799-1808 Forthcoming.
- Shen, J., et al. High capacity nanoporous silicon carrier for systemic delivery of gene silencing therapeutics. ACS Nano. 7 (11), 9867-9880 (2013).
- Zhang, M., et al. Polycation-functionalized nanoporous silicon particles for gene silencing on breast cancer cells. Biomaterials. 35 (1), 423-431 (2014).
- Ozpolat, B., Sood, A. K., Lopez-Berestein, G. Nanomedicine based approaches for the delivery of siRNA in cancer. J Intern Med. 267 (1), 44-53 (2010).
- Philipp, A., Dehshahri, A., Wagner, A., E, Simple modifications of branched PEI lead to highly efficient siRNA carriers with low toxicity. Bioconjug Chem. 19 (7), 1448-1455 (2008).
- Hunter, A. C. Molecular hurdles in polyfectin design and mechanistic background to polycation induced cytotoxicity. Adv Drug Deliv Rev. 58 (14), 1523-1531 (2006).
- Andrews, P. M., Bates, S. B. Dose-dependent movement of cationic molecules across the glomerular wall. Anat Rec. 212 (3), 223-231 (1985).
- Ananta, J. S., et al. Geometrical confinement of gadolinium-based contrast agents in nanoporous particles enhances T1 contrast. Nat Nanotechnol. 5 (11), 815-821 (2010).
