Summary
لا يزال تقديم التحدي الرئيسي لتنفيذ العلاجي من الحمض النووي الريبي التدخل الصغيرة (سيرنا). ويشمل هذا البروتوكول استخدام منصة متعددة الوظائف وحيويا تسليم سيرنا، ويتألف من أرجينين وpolyethylenimine المطعمة المجهرية الدقيقة السيليكون التي يسهل اختراقها.
Introduction
الرنا التدخل صغيرة (الرناوات siRNAs) هي عبارة عن جزيئات RNA المزدوج تقطعت بهم السبل التي يمكن أن قمع التعبير عن الجينات. في السنوات الأخيرة، وقد وضعت الرناوات siRNAs كما جيل جديد من biodrugs التي تظهر الإمكانات العلاجية لاستخدامها في المستقبل في التطبيقات السريرية 1-5. ومع ذلك، لا يزال التنفيذ الناجح لعلاج سيرنا تحديا كبيرا، نظرا لتدهور كتبها nucleases، وسوء امتصاص الخلايا، وانخفاض كفاءة ترنسفكأيشن والإفراج غير فعالة من دخلول؛ جسيم داخلي / يحلول 5. العديد من هذه العقبات يمكن التغلب عليها من خلال تطوير المنصات التسليم، والتي يمكن بأمان وكفاءة تقديم سيرنا إلى الأنسجة المريضة. مقارنة ناقلات فيروسية، والمنصات غير الفيروسية وتوفر العديد من المزايا، مثل السلامة، وانخفاض التكلفة وسهولة الخياطة. ولا سيما النانوية الموجبة، مثل البوليمرات والدهون، قد أثبتت جدواها لتسليم سيرنا 3.
سابقا، وقد وضعنا الدكتور قريصيميكروغرام نظام التسليم، ويسمى متجه متعدد المراحل (MSV). ويستند هذا البرنامج على مراحل متتابعة، والتي يتم تحريرها مركبة واحدة من آخر. أول مركبة المرحلة هي microparticle مصنوعة من السيليكون التي يسهل اختراقها قابلة للتحلل (PSI)، في حين أن المرحلة الثانية هي المركبات النانوية محملة المخدرات أو عوامل التباين 6،7. النانوية، والتي هي جزء لا يتجزأ في المواد PSI، يتم الافراج تدريجيا كما يحط سي 8. وهناك فائدة من استخدام جزيئات سي هي أن التشكل والسطحية الخصائص يمكن بسهولة أن تصمم لتحقيق biodistribution الأمثل والافراج عن المخدرات. في الآونة الأخيرة، وقد تبين نجاح استخدام منصة MSV لإيصال الجسيمات الشحمية سيرنا إلى نسيج الورم في المبيض وسرطان الثدي نموذج الفأر 9 و 10.
في هذا العمل، ونحن قد ملفقة نظام تسليم العالمي لسيرنا على أساس مبادئ منصة MSV. وقد سبق أظهرت لنا مدى فعالية هذا النظام تسليمجي سيرنا مختلف الجزيئات 11. هذا النظام هو السيليكون التي يسهل اختراقها (PCPS) الناقل بين functionalized polycation، ويتألف من PSI المطعمة مع polyethylenimine (PEI) وأرجينين (الارجنتين). PEI يمكن أن تساعد في تشكيل التفاعلات كهرباء مع سيرنا، بينما الارجنتين والمبادرة يمكن أن تكون لتقليل سمية PEI، كما demonstarted سابقا 11. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن وجود PEI تساعد في امتصاص الخلايا وendosomal الهروب، في حين أن المجهرية الدقيقة المبادرة تتيح حماية سيرنا وإطلاق المستدام. الجسيمات PSI تتحلل تدريجيا تحت الظروف الفسيولوجية، مما يؤدي إلى تشكيل النانوية الارجنتين-PEI / سيرنا (الشكل 1)، والتي لها التشكل متميزة وتوزيع حجم الضيق 11. للحصول على تفاصيل بشأن استقرار النظام PCPS / سيرنا، يرجى الرجوع إلى الدراسة التي شين وآخرون. 11. هذه المنصة PCPS تختلف عن MSV التقليدية، منذ النانوية المرحلة الثانية لا بريسي البدايةالإقليم الشمالي في الناقل، ولكن تتشكل مع مرور الوقت كما يحط الناقل المرحلة الأولى-11، و 12. وقد تم تقييم كفاءة سيرنا تحميل الكفاءة، وسمية الخلايا والجينات إسكات النظام PCPS في المختبر. وقد تم قياس كفاءة ترنسفكأيشن باستخدام سيرنا ضد توسع الشعريات ترنح تحور (ATM) الجين الورمي، التي تشارك في إصلاح الحمض النووي 10. سابقا، وقد تبين قمع ATM لتقليل نمو الورم في نموذج سرطان الثدي 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. PCPS الجسيمات إعداد
- أكسدة جزيئات السيليكون التي يسهل اختراقها غير بين functionalized في حل 30٪ من بيروكسيد الهيدروجين على 95 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. يؤمين الجزيئات المؤكسدة في 2٪ (3- أمينو) حل triethoxysilane في الإيزوبروبيل لمدة 2 أيام عند 65 درجة مئوية مع التحريك لطيف.
- أجهزة الطرد المركزي الحل لمدة 30 دقيقة في 18،800 x ج ويغسل الجسيمات مرتين في الكحول الآيزوبروبيل وثلاث مرات في الإيثانول، وذلك باستخدام صوتنة موجز لتعليق بيليه. ترك الجسيمات في محلول الإيثانول عند تنفيذ الخطوة 1.3 و 1.4.
- إضافة يعرف حجم تعليق الجسيمات (على سبيل المثال، 10 ميكرولتر) إلى 10 مل متساوي النترونات مخفف والعد الجسيمات مع محلل الجسيمات العد لتحديد تركيز الجسيمات في محلول المخزون.
- تفعيل مجموعة من حمض L-أرجينين (0.1 نانومول) مع N - (3-dimethylaminopropyl) - N 'هيدروكلوريد -ethylcarbodiimide (EDC، 0.1 نانومول) / N
- يصوتن لفترة وجيزة الحل الأسهم الجسيمات وإضافة 1000000000 الجسيمات إلى حل L-أرجينين وترك رد فعل لمدة 18 ساعة على RT مع التحريك لطيف.
- تفعيل أول مجموعة حمض الأسبارتيك من N - (ثالثي Butoxycarbonyl) -L-الأسبارتيك حمض (بوك-ASP-OH، 1 نانومول) مع EDC (0.1 نانومول) / NHS (0.1 نانومول) في 20 مل من الإيثانول لمدة 4 ساعة على 4 ° C مع التحريك لطيف.
- حل 50 ملغ polyethylenimine في 10 مل ايثانول وإضافة محلول إلى خليط بوك-ASP-OH. السماح للرد فعل المضي قدما لمدة 24 ساعة على RT مع التحريك لطيف.
- تفعيل مجموعة حمض الأسبارتيك الثانية من الحل بوك-ASP-OH / PEI مع EDC (0.1 نانومول) / NHS (0.1 نانومول) في 4 درجة مئوية لمدة 6 ساعات مع التحريك لطيف.
- للحصول على جسيمات PCPS، إضافة محلول الجسيمات من الخطوة 1.5 إلى الحل بوك-ASP-OH / PEI من الخطوة 1.8. السماح للتفاعل والمضي قدما لمدة 18 ساعة على RT مع طيف الحادي irring.
- أجهزة الطرد المركزي الحل لمدة 30 دقيقة في 18،800 x ج ويغسل حل الجسيمات ثلاث مرات مع الإيثانول، وذلك باستخدام صوتنة موجز لتعليق بيليه.
2. PCPS الجسيمات توصيف
- قياس حجم الجسيمات باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح (SEM).
- ضع قطرة من الجسيمات تعليق (10،000 الجسيمات / ميكرولتر في الإيثانول) على السيليكا النقية SEM عينة كعب واسمحوا الجافة في RT تحت فراغ.
- قياس الصور SEM الساعة 8 كيلو فولت مع العمل عن بعد 3-5 ملم باستخدام كاشف في العدسة.
- قياس إمكانات زيتا من الجسيمات باستخدام نظام الجسيمات محلل.
- مزيج 10 ميكرولتر من الجسيمات تعليق (10،000 الجسيمات / ميكرولتر في الإيثانول) مع 1 مل من 10 ملي العازلة الفوسفات (7.4 درجة الحموضة).
- تحميل العينة إلى الخلايا الشعرية مطوية وقياس إمكانات زيتا وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- تجفيف الجسيمات PCPS (من PCPS الجسيمات إعداد الخطوة 1.9) في ظل فراغ O / N.
- إضافة سيرنا (4 ميكروغرام) في nuclease خالية من المياه (20 ميكرولتر) إلى جزيئات PCPS المجففة ويصوتن لفترة وجيزة. استخدام الجسيمات التالية لنسب سيرنا: 2 × 10 5 الجسيمات / 0.2 ميكروغرام سيرنا، 4 × 10 5 الجسيمات / 0.2 ميكروغرام سيرنا، 6 × 10 5 الجسيمات / 0.2 ميكروغرام سيرنا، 8 × 10 5 الجسيمات / 0.2 ميكروغرام سيرنا، 10 × 10 5 الجسيمات / 0.2 ميكروغرام سيرنا و 12 × 10 5 الجسيمات / 0.2 ميكروغرام سيرنا.
- احتضان لمدة 3 ساعات في 4 درجات مئوية على شاكر (1،000 دورة في الدقيقة) للسماح سيرنا ملزما للجزيئات.
4. التحسين من سيرنا / PCPS نسبة الجسيمات
- إضافة صبغة DNA تحميل إلى 20 ميكرولتر من الجسيمات سيرنا PCPS / التحكم مع الجسيمات مختلفة لنسب سيرنا (انظر تحميل سيرنا الى جزيئات PCPS).
- تحميل سامتسير وفق إلى هلام الاغاروز 2٪ التي تحتوي على هلام DNA وصمة عار.
- أداء الكهربائي في الجهد المستمر من 120 V لمدة 20 دقيقة في ادارة العازلة.
- تحليل الجل مع الحصول على الصور وبرامج التحليل.
5. الإفراج عن سيرنا من PCPS الجسيمات
- مزيج 20 ميكرولتر من الجسيمات سيرنا PCPS / التحكم مع الجسيمات مختلفة لنسب سيرنا (راجع الخطوة 3) في كبريتات الصوديوم دوديسيل (SDS، 2٪) واسمحوا الوقوف لمدة 1 ساعة على RT.
- إضافة صبغة DNA تحميل للعينات.
- عينات الحمل إلى هلام الاغاروز 2٪ التي تحتوي على هلام DNA وصمة عار.
- أداء الكهربائي في الجهد المستمر من 120 V لمدة 20 دقيقة في إدارة عازلة باستخدام DNA المعدات الكهربائي وامدادات الطاقة.
- تحليل الجل مع الحصول على الصور وبرامج التحليل.
6. متحد البؤر المجهر من الجسيمات PCPS
- إضافة 5 ميكرولتر من PCPS / الفلورسنت الجسيمات سيرنا التحكم (10 × 10 5 الجسيمات / 0.2 ميكروغرام سيرنا / 20 ميكرولتر) إلى انزلاق الغطاء الزجاجي.
- تصور طبقات الجسيمات بواسطة المجهر متحد البؤر.
7. توصيف الارجنتين-PEI / تحكم سيرنا النانوية
- للحط من مادة السيليكون وتشكيل الارجنتين-PEI النانوية / تحكم سيرنا، إضافة جزيئات PCPS / سيرنا (10 × 10 6 جزيئات PCPS / 2 ميكروغرام سيرنا) إلى 100 ميكرولتر من الفوسفات مخزنة المالحة ويهز (1،000 دورة في الدقيقة) عند 37 درجة مئوية لمدة 2 أيام.
- الطرد المركزي العينة لمدة 30 دقيقة في 18،800 x ج وجمع طاف.
- قياس حجم الجسيمات النانوية شكلت الارجنتين-PEI / سيرنا مع تشتت الضوء الحيوي (DLS).
- مزيج 10 ميكرولتر من طاف مع 1 مل 10 ملي العازلة الفوسفات (7.4 درجة الحموضة) والمكان الى كفيت بلاستيكية.
- قياس حجم الجسيمات باستخدام نظام الجسيمات محلل وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- تحديد حجم ومورفولوجية شكلت ARG / PEI سيرناالنانوية مع مجهر القوة الذرية.
- يستغرق 10 ميكرولتر من طاف ومكان على رقاقة السيليكون.
- تصور الجسيمات مع مجهر القوة الذرية (AFM).
الثقافة 8. خلية
- ثقافة MDA-MB-231 خلايا سرطان الثدي البشرية في وسائل الإعلام ثقافة الخلية تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني و 1٪ البنسلين، الستربتومايسين في 5٪ CO 2، 95٪ الرطوبة و 37 درجة مئوية.
9. متحد البؤر المجهري للخلايا الحية مع PCPS الجسيمات
- لوحة الخلايا في الثقافة 2 جيدا الشرائح في مناطق ذات كثافة البذر من 3 × 10 5 خلايا / جيد لمدة 24 ساعة.
- إضافة جزيئات PCPS محملة السيطرة الفلورسنت سيرنا (10 × 10 5 الجسيمات / 0.2 ميكروغرام الجسيمات إلى نسبة سيرنا، 50 نانومتر سيرنا) إلى الخلايا.
- تسجيل فيلم من الخلايا مع المجهر متحد البؤر (مرفق مع الغرفة، 5٪ CO 2، 95٪ الرطوبة و37 درجة مئوية) لمدة 12 ساعة بعد المعرض الجسيماتبالتأكيد.
10. متحد البؤر المجهري للخلايا ثابتة مع PCPS الجسيمات
- لوحة الخلايا في الثقافة 2 جيدا الشرائح في مناطق ذات كثافة البذر من 3 × 10 5 خلايا / جيد لمدة 24 ساعة.
- إضافة جزيئات PCPS محملة السيطرة الفلورسنت سيرنا (10 × 10 5 الجسيمات / 0.2 ميكروغرام الجسيمات إلى نسبة سيرنا، 50 نانومتر سيرنا) إلى الخلايا واحتضان لمدة 1 يوم، 7 أيام و 10 يوما.
- غسل الخلايا مرتين مع الفوسفات مخزنة المالحة ومن ثم اصلاحها مع 4٪ محلول امتصاص العرق لمدة 10 دقيقة.
- غسل الخلايا مع الفوسفات مخزنة المالحة.
- Permeabilize الخلايا مع 0.1٪ الأوكتيل الفينول ethoxylate لمدة 10 دقيقة ثم يغسل لهم ثلاث مرات مع الفوسفات مخزنة المالحة.
- منع الخلايا مع الزلال من المصل البقري (10 ملغ / مل) في الفوسفات مخزنة المالحة لمدة 10 دقيقة في RT مع التحريك لطيف.
- لتصور الأكتين الخيطية، واحتضان الخلايا مع fluorescently المسمى phalloidin (1 ميكرولتر / 40 ميكرولترعرقلة الحل) لمدة 20 دقيقة في RT مع التحريك لطيف ثم يغسل في الفوسفات مخزنة المالحة.
- إزالة الشرائح من الإطار وإضافة antifade كاشف مع 4 "، 6-diamidino-2-phenylindole (دابي) لتصور النواة.
- إضافة كوب غطاء على رأس والتقاط صور للخلايا مع المجهر متحد البؤر.
11. التدفق الخلوي للخلايا مع PCPS / الفلورسنت تحكم سيرنا الجسيمات
- خلايا لوحة في لوحة 6 جيدا في مناطق ذات كثافة البذر من 3 × 10 5 خلايا / جيد لمدة 24 ساعة.
- إضافة جزيئات PCPS محملة السيطرة الفلورسنت سيرنا (10 × 10 5 الجسيمات / 0.2 ميكروغرام الجسيمات إلى نسبة سيرنا، 50 نانومتر سيرنا) إلى الخلايا واحتضان لمدة 24 ساعة.
- غسل الخلايا مع الفوسفات مخزنة المالحة وكشط لهم مع مكشطة الخلية.
- تخزين الخلايا في الفوسفات مخزنة المالحة مع 2٪ مصل بقري جنيني قبل التحليل. استخدام الخلايا غير المعالجة كوسيلة لمراقبة سلبية.
- أداء تدفق قبرصيtometry.
12. بقاء الخلية من الخلايا مع PCPS الجسيمات وPCPS / تحكم سيرنا الجسيمات
- خلايا لوحة في لوحة 96-جيدا في مناطق ذات كثافة خلية من 3 × 10 3 خلية / جيدا لمدة 24 ساعة.
- علاج الخلايا مع جزيئات PCPS (1.5 × 10 5 / جيد و 6 × 10 5 / جيد) أو الجسيمات سيرنا PCPS / التحكم (10 × 10 5 الجسيمات / 0.2 ميكروغرام الجسيمات إلى نسبة سيرنا، 10 نانومتر و 100 نانومتر سيرنا) لمدة 48 ساعة و 72 ساعة. استخدام الخلايا غير المعالجة والخلايا المعالجة مع الفوسفات مخزنة المالحة (نفس الحجم كما الجسيمات المضافة) والضوابط. فحص كل عينة في ثلاث نسخ.
- إجراء فحص تكاثر الخلايا وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- تمثيل البيانات كما يعني ± الانحراف المعياري.
13. البقعة الغربية من الخلايا مع PCPS / ATM المتحولة سيرنا الجسيمات
- خلايا لوحة في لوحة 6 جيدا في مناطق ذات كثافة الخلايا 2 × 10 5 خلايا / ثالذراع لمدة 24 ساعة.
- احتضان الخلايا مع PCPS / تحكم سيرنا (50 نانومتر) الجسيمات أو PCPS / ATM سيرنا (50 نانومتر) الجسيمات لمدة 72 ساعة. استخدام الخلايا غير المعالجة كمجموعة تحكم.
- ليز الخلايا باستخدام كاشف استخراج البروتين تستكمل مع كوكتيل مثبط البروتياز.
- الطرد المركزي لست] خلية لمدة 10 دقيقة في 14،000 x ج واسترداد طاف.
- تحديد تركيز البروتين مع فحص البروتين الكمي وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- إضافة عينة العازلة تحميل (مع 5 ميكرولتر 2-المركابتويثانول / عازلة مل) للعينات وتسخين لهم لمدة 6 دقائق عند 99 ° C.
- تحميل عينات البروتين (20 ميكروغرام / ميكرولتر) في 12٪ هلام SDS-بولكرلميد في ادارة العازلة وأداء هلام بولي أكريلاميد الكهربائي (1 ساعة، 120 V) باستخدام المعدات الكهربائي وامدادات الطاقة.
- نقل هلام العازلة في نقل (مع الميثانول 20٪) إلى غشاء النيتروسليلوز (1 ساعة، و 100 V) باستخدام المعدات الكهربائي وامدادات الطاقة.
- منع الغشاء مع الحليب الجاف 5٪ لمدة 1 ساعة.
- احتضان الغشاء مع الأجسام المضادة الأولية ATM (من الأرنب) في عرقلة الحل (من الخطوة 13.9) في 1: 1،000 التخفيف O / N.
- يغسل الغشاء مع الفوسفات مخزنة المالحة التي تحتوي على 0.1٪ البولي ايثيلين جلايكول صوربيتان monolaurate ثم احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية (المضادة للأرنب) في عرقلة الحل (من الخطوة 13.9) في 1: 2،500 التخفيف لمدة 1 ساعة.
- يغسل الغشاء مع الفوسفات مخزنة المالحة التي تحتوي على 0.1٪ البولي ايثيلين جلايكول صوربيتان monolaurate وكشف عن عصابات بروتين مع الكشف عن لطخة غربية باستخدام كاشف الحصول على الصور وبرامج التحليل.
- للتحكم التحميل، ويغسل الغشاء وكرر الخطوات 13،9-13،12 باستخدام الأجسام المضادة الأولية-β الأكتين (من الماوس، 1: 10،000 التخفيف) والضد الثانوية (المضادة للماوس 1: 4،000 التخفيف).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يصف هذا البروتوكول استخدام نظام التسليم غير الفيروسي لآمنة وفعالة سيرنا ترنسفكأيشن. نتائج SEM تكشف أن الجسيمات PCPS هي اسطوانية الشكل ولها يبلغ قطرها 2.6 ميكرومتر (الشكل 2A). واتهم الجزيئات بشكل إيجابي مع إمكانات زيتا من حوالي +8.21 (الشكل 2B)، وبالتالي تمكين كهرباء ملزم مع النيوكليوتيدات سالبة الشحنة. وتظهر الصور مبائر من طبقات مختلفة من الجزيئات PCPS أن السيطرة الفلورسنت سيرنا يتم تحميل داخل جزيئات السيليكون مسامية (الشكل 2C). وأكد تشكيل وإطلاق الجسيمات النانوية الارجنتين-PEI / سيرنا من الجسيمات PSI مع DLS وAFM. توزيع حجم الجسيمات تراوحت 70-120 نانومتر، ويبلغ متوسط حجم 94 نانومتر (الشكل 2D). وتوضح الصور AFM أن الجسيمات النانوية لها شكل كروي (الشكل 2E).
وراتيوكان محسن س الجسيمات إلى سيرنا التي كتبها الاغاروز الكهربائي للهلام لضمان تقارب ملزم عالية (الشكل 3A). تم استخدام مجموعة واسعة من الجسيمات إلى نسب سيرنا (2 × 10 5، 4 × 10 5، 6 × 10 5، 8 × 10 5، 10 × 10 × 5 و 12 10 5 /0.2 ميكروغرام سيرنا). وتشير النتائج إلى أن سيرنا يمكن أن تربط بإحكام على جزيئات عندما كمية الجسيمات فوق 8 × 10 5. وهناك نسبة 10 × 10 5 PCPS / تم اختيار 0.2 ميكروغرام سيرنا لمزيد من التجارب. وعلاوة على ذلك، تم الإفراج عن سيرنا بنجاح من الناقل عندما تعامل مع SDS، كما هو موضح في الشكل 3B.
وبعد ذلك، تم تقييم تدخيل قبو PCPS / السيطرة الفلورسنت الجسيمات سيرنا في MDA-MB-231 الخلايا. صور مبائر المتخذة بعد 24 ساعة من المعرض العلاج أن الجسيمات منضويتان على نحو فعال في الخلايا (الشكل 4 الشكل (5) أن 89٪ من الخلايا قد استوعبت PCPS / الجسيمات سيرنا بعد 24 ساعة من الحضانة. وعلاوة على ذلك، تم تسجيل عملية الاستيعاب لمدة 12 ساعة (فيديو 1). هذه النتائج تشير إلى أن الجسيمات PCPS يمكن تسليم بكفاءة سيرنا إلى الخلايا. تم تقييم تراكم طويل المدى للسيرنا داخل الخلايا أيضا بواسطة المجهر متحد البؤر. في يوم 7 ويوم 10 كان لا يزال في سيرنا اكتشافها داخل الخلايا (الشكل 6).
واحدة من أهم العوامل في الاعتبار عند تطوير نظام تسليم سيرنا هو سلامة الناقل 13. ومن المعروف PEI لتشكيل polyplexes مع سيرنا، والمساعدة في امتصاص الخلوية وإطلاق الزناد من دخلول؛ جسيم داخلي / يحلول. ومع ذلك، يمكن أن يكون لها آثار سامة PEI، وذلك بسبب وجود جماعات الأمينية الأساسية موجبة الشحنة في العمود الفقري 14،15. على سبيل المثال، PEI ملزمة لالكنان السكري على سطح الخلية يمكن أن يؤدي إلى FOrmation من مجموعات كبيرة (16). من أجل القضاء على هذه السمية التي يسببها تهمة، وكان مترافق PEI تساهميا إلى أرجينين من خلال رابط الجسر، للحد من عدد من المجموعات الأمينية الأساسية. ظلت بقاء الخلية أكثر من 95٪ بعد 48 ساعة و 72 ساعة عندما استخدمت الجسيمات وسيرنا بتركيز يصل إلى 6 × 10 5 / جيد و 100 نانومتر، على التوالي (الشكل 7A). وبعد ذلك، تم تقييم فعالية ترنسفكأيشن سيرنا ضد الجين الورمي ATM في MDA-MB-231 الخلايا. وتظهر النتائج طخة غربية أن مستويات البروتين من أجهزة الصراف الآلي وانخفض بعد العلاج مع PCPS / ATM سيرنا (الشكل 7B). وتشير النتائج إلى منصة PCPS هو نظام تسليم آمنة وفعالة لسيرنا.
الشكل 1. تمثيل تخطيطي من السيليكون التي يسهل اختراقها (PCPS) الجسيمات بين functionalized polycation. قوية> ارجينين (الارجنتين) -polyethylenimine (PEI) / تتشكل صغيرة بالتدخل RNA (سيرنا) النانوية في أعقاب تدهور السيليكون (سي).
الشكل 2. توصيف جزيئات PCPS. (A) المجهر الإلكتروني (SEM) صورة جزيئات PCPS. (B) زيتا إمكانات الجسيمات PCPS. (C) وصور متحد البؤر من طبقات مختلفة من PCPS / فلوري الجسيمات تحكم سيرنا. توزيع (D) حجم أرجينين الارجنتين-PEI / مراقبة الجسيمات النانوية سيرنا التي صدرت من السيليكون المجهرية الدقيقة التي يسهل اختراقها. (E) القوة الذرية المجهر (AFM) صور من الارجنتين-PEI / مراقبة الجسيمات النانوية سيرنا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. الاغاروز هلام لتعظيم الاستفادة من نظام التسليم PCPS / سيرنا. (A) ملزم تقارب بين الجسيمات PCPS والسيطرة سيرنا. العصابات تمثل غير منضم سيرنا. (ب) الإفراج سيرنا يلي الحضانة مع 2٪ SDS لمدة 1 ساعة. العصابات تمثل إجمالي سيرنا (غير منضم والمربوطة). عينة 1: سيرنا. عينة 2: 2 × 10 5 جزيئات PCPS / 0.2 ميكروغرام سيرنا. عينة 3: 4 × 10 5 جزيئات PCPS / 0.2 ميكروغرام سيرنا. عينة 4: 6 × 10 5 جزيئات PCPS / 0.2 ميكروغرام سيرنا. عينة 5: 8 × 10 5 جزيئات PCPS / 0.2 ميكروغرام سيرنا. عينة 6: 10 × 10 5 جزيئات PCPS / 0.2 ميكروغرام سيرنا. عينة 7: 12 × 10 5 جزيئات PCPS / 0.2 ميكروغرام سيرنا.
75 / 52075fig4.jpg "/>
الشكل 4. الصور المجهر متحد البؤر من PCPS / الجسيمات الفلورية سيرنا (الحمراء) في MDA-MB-231 الخلايا (24 ساعة الحضانة). وقد تصور النواة والأكتين الخيطية مع 4 "، 6-diamidino-2-phenylindole (دابي والأزرق ) وphalloidin (الأخضر)، على التوالي. تم تصوير ثلاث طبقات مختلفة (أعلى، المتوسطة والقاعدية). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5. تدفق الكمي تحليل الخلوي من الفلورسنت MDA-MB-231 الخلايا بعد الحضانة مع PCPS / مراقبة الجسيمات سيرنا الفلورسنت. تم استخدام الخلايا غير المعالجة كوسيلة لمراقبة سلبية. وكان 89٪ من خلايا المنضوية الجسيمات.
igure 6 "SRC =" / الملفات / ftp_upload / 52075 / 52075fig6.jpg "/>
وحضنت الشكل 6. صور متحد البؤر السيطرة الفلورسنت سيرنا (الأحمر) داخل MDA-MB-231 الخلايا. خلايا مع PCPS / السيطرة الفلورسنت الجسيمات سيرنا لمدة 1 يوم، 7 أيام و 10 يوما. ثم تم تصور الخلايا مع المجهر متحد البؤر. وقد تصور النواة والخيطية الأكتين مع 4 "، 6-diamidino-2-phenylindole (دابي والأزرق) وphalloidin (الأخضر)، على التوالي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 7. بقاء الخلية وإسكات الجينات في المختبر. (A) وبقاء الخلية فحص الخلايا المحتضنة مع الجزيئات والجسيمات PCPS PCPS / تحكم سيرنا (SCR). وقد أجريت التجربة في رحلةيتم عرض licate والنتائج كما يعني ± الانحراف المعياري. واستخدمت الخلايا غير المعالجة (فارغة) والخلايا المحتضنة مع PBS والضوابط. (B) لطخة غربية من PCPS / ترنح توسع الشعيرات تحور (ATM) الجسيمات سيرنا. تعرضت الخلايا لPCPS / تحكم سيرنا (SCR) والجسيمات PCPS / ATM سيرنا. واستخدمت الخلايا غير المعالجة (وهمية) كمجموعة تحكم. تم استخدام β-الأكتين كعنصر تحكم التحميل.
فيديو 1 . امتصاص تعتمد على وقت PCPS / الفلورسنت تحكم الجسيمات سيرنا في حي MDA-MB-231 الخلايا. وسجلت فيديو لمدة 12 ساعة بعد تعريض الخلايا لالجسيمات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يصف هذا البروتوكول وسيلة لإيصال ناجحة وترنسفكأيشن من سيرنا إلى الخلايا. على وجه الخصوص، ويتحقق تسليم سيرنا باستخدام منصة متعددة الوظائف تتألف من جسيمات PSI-بين functionalized polycation. استخدام العلاج سيرنا لديها امكانات كبيرة، على سبيل المثال، علاج السرطان، والعديد من الجينات المسرطنة يمكن أن تستهدف مع خصوصية عالية. وبالتالي، وجود الطلب لتطوير وسائل إيصالها سيرنا، والتي يمكن التخفيف من التحديات العلاج سيرنا. في الختام، لقد أوجز البروتوكول الذي يظهر الوعد لتسليم آمنة وفعالة من سيرنا. ومع ذلك، هناك بعض العوامل الرئيسية التي يجب أن تؤخذ بعين الاعتبار عند تنفيذ تقنية وصفها. على سبيل المثال، أحد الاعتبارات الهامة عند إعداد الجسيمات PCPS هو للتعامل مع سيرنا بعناية، وذلك لتجنب تدهور التي كتبها nucleases. وخاصة، قفازات نظيفة وريبونوكلياز أنابيب المياه الحرة وينبغي أن تستخدم في جميع الأوقات عند العمل معسيرنا. إذا كان ترنسفكأيشن سيرنا فعالية منخفضة، رذاذ التي تزيل التلوث ريبونوكلياز يمكن استخدامها للرش القفازات ومناطق العمل. وبالإضافة إلى ذلك، إذا كان ترنسفكأيشن غير ناجحة، يجب اختبار سيرنا مع كاشف ترنسفكأيشن التجاري، لتحديد ما إذا كان السبب في المشكلة عن طريق سيرنا أو الجسيمات. وهناك اعتبار آخر بالغ الأهمية لنجاح تنفيذ / سيرنا نظام التسليم PCPS هو اتخاذ الحيطة والحذر عند أداء الطرد المركزي وغسل الخطوات. وهي طاف يجب التخلص تماما لإزالة الزائدة الكواشف المطلوبة في جميع أنحاء خطوات إعداد الجسيمات.
ومن المزايا المهمة لنظام PCPS / تسليم سيرنا هو السلامة. العديد من وكلاء ترنسفكأيشن سيرنا يكون لها تهمة الموجبة عالية، مما يسهم في السمية الخلوية 13،15. في الواقع، فإن معظم بروتوكولات تجارية تشير إلى أن الكواشف يجب حضنت مع الخلايا لمدة بضع ساعات فقط، لتجنب موت الخلايا. على العكس من ذلك، ميمكن أن يتعرض له LLS إلى جزيئات PCPS لعدة أيام دون أي علامات السمية، كما هو واضح من نتائج بقاء الخلية. يمكن للجسيمات PCPS ربط سيرنا مع تقارب عالية بسبب وجود PEI. إلا أن سمية الناجم عن المسؤول عن PEI والوقاية منها من خلال الإعداد فريد من منصة التسليم. خصوصا التساهمية ملزم من الارجنتين إلى PEI والتغليف من PEI داخل المسام سي المساهمة في خفض سمية. ميزة أخرى لمنصة PCPS هي أن سيرنا ترنسفكأيشن يمكن أن تتم في وجود المصل. أساليب أخرى موجودة عادة ما تتطلب استخدام وسائل الإعلام ثقافة الخلية خالية من مصل الدم، وبالتالي إضافة خطوات إضافية لعملية ترنسفكأيشن وربما التدخل في مسارات إشارات الخلية العادية.
فائدة إضافية للنظام PCPS هو أنه لا يتطلب أي تعديل في جزيئات سيرنا. في حين أن بعض الأساليب الحالية تتطلب خطوات اقتران معقدة لتحقيق الاستقرار في سيرنا أو لتمكين جتدخيل ellular 13، يعتمد نظام PCPS على خلط بسيط لسيرنا التحميل. الربط إلى PEI والمسام في المواد سي توفر بيئة توفر الحماية للسيرنا، وبالتالي الحد من الاتصال مع nucleases. ويمكن تخزين جزيئات PCPS لفترات طويلة من الزمن كمادة مجففة أو في الإيزوبروبيل. وعلاوة على ذلك، إذا تم مجفف بالتجميد الجسيمات PCPS / سيرنا يمكن تخزينها لمدة ثلاثة أشهر على الأقل في 4 درجات مئوية. ينبغي وقف الجسيمات PCPS مجفف بالتجميد في ريبونوكلياز المياه مجانا قبل ترنسفكأيشن، ويجب عدم تخزينها في الحل. وأخيرا، أصيبت تصاريح منصة PCPS الإفراج عن سيرنا، كما ذكرت سابقا 11، وبالتالي زيادة الفترة الزمنية التي تستهدف تبقى الجينات قمعت. وفقا لذلك، وبعد استيعاب الخلوية، والجزيئات سي تتحلل تدريجيا، مما أدى إلى تشكيل النانوية الارجنتين-PEI / سيرنا. وفي وقت لاحق، يتم تحرير سيرنا ببطء في السيتوبلازم، حيث يمكن ربط ميسينجر RNA (مرنا)، وبالتالي ممارسة النشاط البيولوجي. وعلى الرغم من الجسيمات PCPS توفر العديد من المزايا بالمقارنة مع الأساليب القائمة لتسليم سيرنا، وجود قيود على التقنية هو أن المجهرية الدقيقة غير بين functionalized PSI مطلوبة كمادة أولية. في حين أن الجزيئات يمكن توليفها باستخدام ضوئيه والحفر الكهروكيميائية 17، وهذه التقنيات ليست متوفرة بسهولة في جميع المؤسسات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polyethylenimine (PEI), branched | Sigma-Aldrich | 408727 | Average molecular weight ~25,000 Da |
| L-Arginine | Sigma-Aldrich | A5006 | Reagent grade, ≥98% |
| Boc-Asp-OH | Sigma-Aldrich | 408-468 | 99% |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763 | 30 wt. % in H2O |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 339741 | 100.00% |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907 | ≥99.7% |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 459844 | ≥99.5% |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) | Sigma-Aldrich | 03449 | ≥99% |
| Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A7030-10G | Blocking agent |
| Ataxia-telangiectasia mutated siRNA | Sigma-Aldrich | Designed in-house | |
| Tris Acetate-EDTA buffer | Sigma-Aldrich | T9650 | For DNA agarose gel electrophoresis |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | Polyethylene glycol sorbitan monolaurate |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250 | For Western blot |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 71496 | For making phosphate buffer |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 71640 | For making phosphate buffer |
| Anti-Mouse IgG | Sigma-Aldrich | A4416 | Secondary antibody (anti-mouse) for Western blot |
| N-Hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 130672 | 98% |
| CELLSTAR 96W Microplate Tissue Culture Treated Clear w/ Lid | Greiner Bio-One | 655182 | 96-well plate |
| 10x Tris-Glycine Liquid | Li-Cor | 928-40010 | Transfer buffer for Western blot |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | Santa Cruz | Sc-281692 | Fixation of cells |
| CellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (MTS) | Promega | G5421 | Proliferation assay |
| Phosphate buffered saline | Fisher Scientific | BP399-500 | 10x Solution |
| Corning cellgro Dulbecco's Modification of Eagle's (Mod.) | Fisher Scientific | MT-15-017-CM | Cell culture media, 1x solution |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | AC21568-2500 | Octyl phenol ethoxylate, permeabilization agent |
| Cover glass | Fisher Scientific | 12-530C | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-1 | For Western blot transfer buffer |
| Plastic Cuvettes | Fisher Scientific | 14-377-010 | For size measurements using Zetasizer Nano ZS |
| Molecular BioProducts RNase AWAY Surface Decontaminant | Fisher Scientific | 14-754-34 | Spray for removing RNAse contamination |
| Agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | Low melting point, for running RNA samples |
| ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | Antifade reagent with DAPI, nucelus detection |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen | A12379 | Dissolve 300 units in 1.5 ml methanol, detection of filamentous actin |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | Invitrogen | S33102 | Visualization of RNA |
| Negative Control siRNA | Qiagen | 1022076 | Control siRNA |
| AllStars Neg. siRNA AF 555 | Qiagen | 1027294 | Fluorescent control siRNA |
| Cell scraper | Celltreat | 229310 | |
| BioLite Multidishes and Microwell Plates | Thermo Scientific | 130184 | 6-well plate |
| Pierce LDS Sample Loading Buffer (4x) | Thermo Scientific | 84788 | Sample loading buffer for Western blot |
| Pierce BCS Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | Protein quantification assay |
| Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktails (100x) | Thermo Scientific | 78430 | Protease inhibitor cocktail, use at 1x |
| M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent | Thermo Scientific | 78501 | Protein extraction reagent |
| Sorvall Legend Micro 21R | Thermo Scientific | 75002440 | Centrifuge |
| Beta Actin Antibody | Thermo Scientific | MA1-91399 | β-actin primary antibody (from mouse) for western blot |
| 6x TriTrack DNA Loading Dye | Thermo Scientific | R1161 | DNA loading dye |
| Nuclease-Free Water | Life Technologies | AM9938 | |
| Non-Fat Dry Milk | Lab Scientific | M0841 | For Western blot |
| 2-well BD Falcon culture slides | BD Biosciences | 354102 | 2-well culture slides |
| Amersham ECL Western blot detection reagent | GE Healthcare Life Sciences | RPN2106 | Western blot detection reagent |
| BA Membranes | GE Healthcare Life Sciences | 10402096 | Nitrocellulose membrane for Wester blot |
| ATM (D2E2) Rabbit mAb | Cell Signaling | 2873S | ATM primary antibody (from rabbit) for Western blot |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7074 | Secondary antibody (anti-rabbit) for Western blot |
| Folded capillary cells | Malvern | DTS 1061 | For zeta potentail measurements using Zetasizer Nano ZS |
| MDA-MB-231 cell line | ATCC | HTB-26 | Mammary Gland/Breast |
| 12% Mini-PROTEAN TGX Gel | Bio-rad | 456-1043 | For Western blot |
| Biorad PowerPac HC | Bio-rad | 164-5052 | Power supply for electrophoresis |
| 10x Tris/Glycine/SDS Buffer | Bio-rad | 161-0732 | Running buffer for Western blot |
| Wide Mini-Sub Cell GT Cell | Bio-rad | 170-4405 | Electrophoresis equipment for DNA agarose gel |
| Mini-PROTEAN Tetra cell | Bio-rad | 165-8000 | Electrophoresis equipment for Western blot |
| ChemiDoc XRS+ System with Image Lab Software | Bio-rad | 170-8265 | Image acquisition and analysis software for gels and blots |
| 4" (10 cm) dia., 5 x 7 mm diced Silicon Wafer | Ted Pella | 16007 | Silicon waferfor scanning electron microscopy and atomic force microscopy |
| Thermomixer R | Eppendorf | 22670107 | Shaker |
| Isoton II diluent | Beckman Coulter | 8546719 | Isoton diluent |
| Multisizer 4 Coulter Counter | Beckman Coulter | A63076 | Particle counting analyzer |
| Non-functionalized porous silicon particles | Microelectronics Research Center, University of Texas at Austin | Dicoidal shape. 2.6 μm (diameter) x 0.7 μm (height), provided in isopropyl alcohol | |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | Particle analyzer system for size and zeta potential | |
| Scanning Electron Microscope | FEI | Particle size and shape | |
| Atomic Force Microscope | Bruker | Particle size and shape | |
| Fluo ViewTM 1000 Confocal Microscope | Olympus | Visualization of fixed and live cells |
References
- De Fougerolles, A., Vornlocher, H. P., Maraganore, J., Lieberman, J. Interfering with disease: a progress report on siRNA-based therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 6 (6), 443-453 (2007).
- Rolland, A.
- Oh, Y. K., Park, T. G. siRNA delivery systems for cancer treatment. Adv Drug Deliv Rev. 61 (10), 850-862 (2009).
- Mintzer, M. A., Simanek, E. E. Nonviral vectors for gene delivery. Chem Rev. 109 (2), 259-302 (2009).
- Whitehead, K. A., Langer, R., Anderson, D. G. Knocking down barriers: advances in siRNA delivery. Nat Rev Drug Discov. 8 (2), 129-138 (2009).
- Decuzzi, P., et al. Size and shape effects in the biodistribution of intravascularly injected particles. J Control Release. 141 (3), 320-327 (2010).
- Decuzzi, P., Ferrari, M. Design maps for nanoparticles targeting the diseased microvasculature. Biomaterials. 29 (3), 377-384 (2008).
- Martinez, J. O., Evangelopoulos, M., Chiappini, C., Liu, X., Ferrari, M., Tasciotti, E. Degradation and biocompatibility of multistage nanovectors in physiological systems. J Biomed Mater Res A. 102 (10), 3540-3549 (2014).
- Shen, H., et al. Enhancing chemotherapy response with sustained EphA2 silencing using multistage vector delivery. Clin Cancer Res. 19 (7), 1806-1815 (2013).
- Xu, R., et al. Multistage vectored siRNA targeting ataxia-telangiectasia mutated for breast cancer therapy. Small. 9 (9-10), 1799-1808 Forthcoming.
- Shen, J., et al. High capacity nanoporous silicon carrier for systemic delivery of gene silencing therapeutics. ACS Nano. 7 (11), 9867-9880 (2013).
- Zhang, M., et al. Polycation-functionalized nanoporous silicon particles for gene silencing on breast cancer cells. Biomaterials. 35 (1), 423-431 (2014).
- Ozpolat, B., Sood, A. K., Lopez-Berestein, G. Nanomedicine based approaches for the delivery of siRNA in cancer. J Intern Med. 267 (1), 44-53 (2010).
- Philipp, A., Dehshahri, A., Wagner, A., E, Simple modifications of branched PEI lead to highly efficient siRNA carriers with low toxicity. Bioconjug Chem. 19 (7), 1448-1455 (2008).
- Hunter, A. C. Molecular hurdles in polyfectin design and mechanistic background to polycation induced cytotoxicity. Adv Drug Deliv Rev. 58 (14), 1523-1531 (2006).
- Andrews, P. M., Bates, S. B. Dose-dependent movement of cationic molecules across the glomerular wall. Anat Rec. 212 (3), 223-231 (1985).
- Ananta, J. S., et al. Geometrical confinement of gadolinium-based contrast agents in nanoporous particles enhances T1 contrast. Nat Nanotechnol. 5 (11), 815-821 (2010).
