Summary
Consegna resta la sfida principale per l'attuazione terapeutico di piccoli RNA interferenti (siRNA). Questo protocollo prevede l'utilizzo di una piattaforma di distribuzione siRNA multifunzionale e biocompatibile, composto da arginina e polietilenimmina innestato microparticelle di silicio poroso.
Introduction
I piccoli RNA interferenti (siRNA) sono molecole a doppio filamento di RNA che possono sopprimere l'espressione dei geni. Negli ultimi anni, siRNAs sono stati sviluppati come una nuova generazione di biofarmaci che mostrano potenziale terapeutico per uso futuro in applicazioni cliniche 1-5. Tuttavia, il successo di una terapia siRNA resta una sfida considerevole, dovuta alla degradazione da nucleasi, scarsa captazione intracellulare, bassa efficienza di trasfezione e il rilascio inefficiente dal endosome / lisosomi 5. Molti di questi ostacoli possono essere superati dallo sviluppo di piattaforme di distribuzione, che può sicuro ed efficiente fornire siRNA di tessuto malato. Rispetto ai vettori virali, le piattaforme non-virali offrono diversi vantaggi, come la sicurezza, a basso costo e facilità di sartoria. In particolare, le nanoparticelle cationici, come i polimeri e lipidi, sono dimostrate utili per la consegna siRNA 3.
In precedenza, abbiamo sviluppato un dr discoidaleug sistema di consegna, definito il vettore multistadio (MSV). Tale piattaforma è basata su fasi sequenziali, in cui un veicolo viene rilasciato da un altro. La prima fase è un veicolo a base di microparticelle biodegradabili silicio poroso (psi), mentre il secondo stadio sono veicoli nanoparticelle caricate con farmaci o agenti di contrasto 6,7. Le nanoparticelle, che sono incorporati nel materiale pSi, vengono gradualmente rilasciati come degrada il Si 8. Un vantaggio di utilizzare particelle Si è che le caratteristiche morfologiche e di superficie possono essere facilmente personalizzati per realizzare biodistribuzione ottimale e rilascio del farmaco. Recentemente, l'uso efficace della piattaforma MSV per la consegna di siRNA liposomi al tessuto tumorale è stato mostrato in un modello di topo ovarico e cancro al seno 9, 10.
In questo lavoro, abbiamo fabbricato un sistema di erogazione universale per siRNA in base ai principi della piattaforma MSV. L'efficacia di questo sistema di erogazione precedentemente us stata dimostrataing diverso siRNA molecole 11. Il sistema è un silicio poroso (PCPS) carrier policatione-funzionalizzato, consistente pSi innestato con polietilenimmina (PEI) e arginina (Arg). PEI può aiutare a formare interazioni elettrostatiche con siRNA, mentre Arg e PSI può servire per ridurre la tossicità del PEI, come precedentemente demonstarted 11. Inoltre, la presenza di PEI può aiutare nella captazione intracellulare e endosomal fuga, mentre le microparticelle psi consentono protezione siRNA e rilascio prolungato. Le particelle psi poco degradano in condizioni fisiologiche, ottenendo in tal modo la formazione di nanoparticelle Arg-PEI / siRNA (Figura 1), che hanno una morfologia distinta e una distribuzione granulometrica ristretta 11. Per maggiori dettagli riguardanti la stabilità del sistema PCPS / siRNA, fare riferimento allo studio di Shen et al. 11. Questa piattaforma PCPS differisce dal MSV convenzionale, dal momento che il secondo stadio nanoparticelle non sono inizialmente PRESEnt nel supporto, ma si formano nel tempo come carrier primo stadio degrada 11, 12. L'efficienza siRNA carico efficienza, citotossicità e silenziamento genico del sistema PCPS è stata valutata in vitro. Efficienza di trasfezione è stata misurata utilizzando siRNA contro l'atassia telangiectasia mutato (ATM) oncogene, che è coinvolto nella riparazione del DNA 10. In precedenza, la soppressione di ATM ha dimostrato di diminuire la crescita tumorale in un modello di cancro al seno 10.
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Protocol
1. Particle Preparazione PCPS
- Ossidare non funzionalizzati particelle di silicio poroso in una soluzione al 30% di perossido di idrogeno a 95 ° C per 2 ore. Aminate le particelle ossidate a 2% (3 amminopropil) trietossisilano soluzione in alcool isopropilico per 2 giorni a 65 ° C con delicata agitazione.
- Centrifugare la soluzione per 30 minuti a 18.800 xg e lavare le particelle due volte in alcool isopropilico e tre volte in etanolo, utilizzando breve sonicazione per sospendere il pellet. Lasciare le particelle in soluzione di etanolo durante l'esecuzione passo 1.3 e 1.4.
- Aggiungere un volume noto di sospensione di particelle (ad esempio, 10 ml) a 10 ml isotone diluente e contare le particelle con un analizzatore conteggio di particelle per determinare la concentrazione di particelle nella soluzione di riserva.
- Attivare il gruppo acido di L-arginina (0,1 nmol) con N - (3-dimetilamminopropil) - N 'cloridrato -ethylcarbodiimide (EDC, 0,1 nmol) / N
- Brevemente sonicare la soluzione particelle magazzino e aggiungere 1 miliardo di particelle alla soluzione L-arginina e lasciare la reazione per 18 ore a temperatura ambiente con delicata agitazione.
- Attivare il primo gruppo acido aspartico di N - (tert-Butoxycarbonyl) -L-aspartico (Boc-Asp-OH, 1 nmol) con EDC (0,1 nmol) / NHS (0,1 nmol) in 20 ml di etanolo per 4 ore a 4 ° C con delicata agitazione.
- Sciogliere 50 mg polyethylenimine in 10 ml di etanolo ed aggiungere la soluzione alla miscela Boc-Asp-OH. Lasciate che la reazione procede per 24 ore a temperatura ambiente con leggera agitazione.
- Attivare il secondo gruppo acido aspartico della soluzione Boc-Asp-OH / PEI con EDC (0,1 nmol) / NHS (0,1 nmol) a 4 ° C per 6 ore con delicata agitazione.
- Per ottenere particelle PCP, aggiungere la soluzione di particelle dal punto 1.5 nella soluzione Boc-Asp-OH / PEI dal punto 1.8. Lasciare che la reazione di procedere per 18 ore a temperatura ambiente con dolce st irring.
- Centrifugare la soluzione per 30 minuti a 18.800 xg e lavare la soluzione particelle tre volte con etanolo, utilizzando breve sonicazione per sospendere il pellet.
2. PCPS Caratterizzazione delle particelle
- Misurare la dimensione delle particelle usando un microscopio elettronico a scansione (SEM).
- Mettere una goccia di sospensione di particelle (10.000 particelle / ml in etanolo) su una silice pulita SEM campione stub e lasciare asciugare a temperatura ambiente sotto vuoto.
- Misurare immagini SEM a 8 kV con una distanza di lavoro di 3-5 mm, utilizzando un rivelatore in-lente.
- Misurare il potenziale zeta delle particelle utilizzando un analizzatore di particelle.
- Miscelare 10 ml di sospensione di particelle (10.000 particelle / microlitro in etanolo) con 1 ml di 10 mM tampone fosfato (pH 7,4).
- Caricare il campione in cellule capillari piegate e misurare il potenziale zeta secondo le istruzioni del produttore.
- Asciugare le particelle PCP (da particelle PCPS preparazione passo 1.9) sotto vuoto O / N.
- Aggiungi siRNA (4 mg) in acqua priva di nucleasi (20 microlitri) per le particelle PCPs secchi e brevemente agli ultrasuoni. Utilizzare la seguente particella rapporti siRNA: 2 × 10 5 particelle / 0,2 mcg siRNA, 4 × 10 5 particelle / 0,2 mcg siRNA, 6 × 10 5 particelle / 0,2 mcg siRNA, 8 × 10 5 particelle / 0,2 mcg siRNA, 10 × 10 5 particelle / 0,2 mcg siRNA e 12 × 10 5 particelle / 0,2 mcg siRNA.
- Incubare per 3 ore a 4 ° C su un agitatore (1000 rpm) per consentire siRNA legame alle particelle.
4. Ottimizzazione del rapporto Particle siRNA / PCPS
- Aggiungere carico DNA colorante per 20 l di particelle siRNA PCPS / controllo con diverse particelle di rapporti siRNA (vedi il caricamento di siRNA in particelle PCP).
- Caricare il samples in un gel di agarosio al 2% contenente gel macchia DNA.
- Eseguire elettroforesi ad una tensione costante di 120 V per 20 min in tampone di corsa.
- Analizzare il gel con acquisizione delle immagini e software di analisi.
5. Rilascio di siRNA da PCPs particelle
- Mescolare 20 ml di particelle siRNA PCPS / controllo con diverse particelle di rapporti siRNA (vedi punto 3) in sodio dodecil solfato (SDS, 2%) e lasciare riposare per 1 ora a temperatura ambiente.
- Aggiungere loading DNA colorante per i campioni.
- Caricare i campioni in un gel 2% contenente gel macchia DNA.
- Eseguire elettroforesi ad una tensione costante di 120 V per 20 min in tampone di corsa utilizzando attrezzature elettroforesi DNA e un alimentatore.
- Analizzare il gel con acquisizione delle immagini e software di analisi.
6. Microscopia confocale di PCPs particelle
- Aggiungere 5 ml di particelle fluorescenti siRNA controllo PCP / (10 × 10 5 particelle / 0.2 mg siRNA / 20 ml) per una scivolata copertura in vetro.
- Visualizza i livelli di particelle al microscopio confocale.
7. Caratterizzazione di Arg-PEI / controllo siRNA nanoparticelle
- Per degradare il materiale di silicio e formare Arg-PEI nanoparticelle / controllo siRNA, aggiungere particelle PCPS / siRNA (10 × 10 6 particelle PCP / 2 mg siRNA) per 100 ml di tampone fosfato e agitare (1.000 rpm) a 37 ° C per 2 giorni.
- Centrifugare il campione per 30 minuti a 18.800 xg e raccogliere il surnatante.
- Misurare le dimensioni delle nanoparticelle formate Arg-PEI / siRNA con light scattering dinamico (DLS).
- Miscelare 10 ml di surnatante con 1 ml di 10 mM tampone fosfato (pH 7.4) e posto in una cuvetta di plastica.
- Misurare la dimensione delle particelle utilizzando un analizzatore di particelle secondo le istruzioni del produttore.
- Determinare la dimensione e la morfologia del formato Arg / PEI-siRNAnanoparticelle con microscopia a forza atomica.
- Prendere 10 ml di surnatante e posto su un wafer di silicio.
- Visualizza le particelle con microscopia a forza atomica (AFM).
Cultura 8. cellulare
- Cultura MDA-MB-231 cellule di cancro al seno umano in coltura cellulare multimediale integrato con il 10% di siero fetale bovino e 1% di penicillina-streptomicina a 5% di CO 2, il 95% di umidità e 37 ° C.
9. Microscopia confocale di cellule vive con PCPs particelle
- Piastra cellule in coltura 2-ben scivoli ad una densità di semina di 3 x 10 5 cellule / pozzetto per 24 ore.
- Aggiungere particelle PCPs carichi di siRNA di controllo fluorescenti (10 × 10 5 particelle / 0,2 mg di particelle rapporto siRNA, 50 nm siRNA) alle cellule.
- Registrare un film delle cellule con un microscopio confocale (fornito con una camera, 5% CO 2, 95% di umidità e 37 ° C) per 12 ore dopo expo particellesicuro.
10. Microscopia confocale di cellule fissate con PCPs particelle
- Piastra cellule in coltura 2-ben scivoli ad una densità di semina di 3 x 10 5 cellule / pozzetto per 24 ore.
- Aggiungere particelle PCPs carichi di siRNA di controllo fluorescenti (10 × 10 5 particelle / 0,2 mg di particelle rapporto siRNA, 50 nm siRNA) alle cellule e incubare per 1 giorno, 7 giorni e 10 giorni.
- Lavare le cellule due volte con tampone fosfato e poi fissarli con soluzione di paraformaldeide 4% per 10 min.
- Lavare le cellule con tampone fosfato.
- Permeabilize le cellule con 0,1% ottil fenolo etossilato per 10 minuti e poi lavarli tre volte con tampone fosfato.
- Bloccare le cellule con albumina da siero bovino (10 mg / ml) in tampone fosfato salino per 10 minuti a RT sotto blanda agitazione.
- Per visualizzare actina filamentosa, incubare le cellule con fluorescente falloidina etichettati (1 ml / 40 mlsoluzione bloccante) per 20 minuti a RT sotto blanda agitazione e poi lavare in tampone fosfato.
- Rimuovere i vetrini dal telaio e aggiungere antifade reagente con 4 ', 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) per visualizzare nucleo.
- Aggiungi un vetro di copertura sulla parte superiore e prendere le immagini delle cellule con microscopia confocale.
11. Citometria a flusso di cellule con PCPs / fluorescenti controllo Particelle siRNA
- Cellule piastra in una piastra da 6 pozzetti ad una densità di semina di 3 x 10 5 cellule / pozzetto per 24 ore.
- Aggiungere particelle PCPs carichi di siRNA di controllo fluorescenti (10 × 10 5 particelle / 0,2 mg di particelle rapporto siRNA, 50 nm siRNA) alle cellule e incubare per 24 ore.
- Lavare le cellule con tampone fosfato e raschiare con un raschietto cellulare.
- Conservare le cellule in tampone fosfato salino con 2% di siero fetale bovino prima dell'analisi. Utilizzare cellule non trattate come controllo negativo.
- Eseguire flusso cytometry.
12. Cella vitalità delle cellule con PCPS Particelle e PCPS / Controllo particelle siRNA
- Cellule piastra in una piastra a 96 pozzetti ad una densità cellulare di 3 × 10 3 cellule / pozzetto per 24 ore.
- Trattare le cellule con particelle PCP (1,5 × 10 5 / bene e 6 × 10 5 / bene) o particelle siRNA PCPS / controllo (10 × 10 5 particelle / 0,2 mg di particelle rapporto siRNA, 10 nm e 100 nM siRNA) per 48 hr e 72 ore. Utilizzare cellule non trattate e cellule trattate con tampone fosfato (stesso volume delle particelle aggiunte) come controlli. Analizzare ogni campione in triplicato.
- Effettuare un saggio di proliferazione cellulare secondo le istruzioni del produttore.
- Rappresentare i dati come media ± deviazione standard.
13. Western Blot di Celle con PCPs / ATM Mutated Particelle siRNA
- Cellule piatto in un 6-pozzetti ad una densità cellulare 2 × 10 5 cellule / well per 24 ore.
- Incubare le cellule con siRNA PCPS / controllo (50 Nm) particelle o PCPS / ATM siRNA (50 Nm) particelle per 72 ore. Utilizzare cellule non trattate come controllo.
- Lyse le cellule utilizzando un reagente di estrazione di proteine integrato con un cocktail inibitore della proteasi.
- Centrifugare i lisati cellulari per 10 min a 14.000 xg e recuperare il surnatante.
- Determinare la concentrazione di proteina con un saggio proteico quantificazione secondo le istruzioni del produttore.
- Aggiungere tampone campione di carico (con 5 ml 2-mercaptoethanol / ml di tampone) per i campioni e li riscalda per 6 min a 99 ° C.
- Caricare i campioni proteici (20 mg / mL) in un gel SDS-poliacrilammide 12% in tampone di corsa ed eseguire l'elettroforesi su gel di poliacrilammide (1 hr, 120 V) mediante elettroforesi e un alimentatore.
- Trasferire il gel in tampone di trasferimento (20% metanolo) ad una membrana di nitrocellulosa (1 hr, 100 V) mediante elettroforesi eun alimentatore.
- Bloccare la membrana con latte in polvere 5% per 1 ora.
- Incubare la membrana con l'anticorpo primario ATM (da coniglio) in soluzione bloccante (dal punto 13.9) ad una diluizione 1: O / N 1.000.
- Lavare la membrana con tampone fosfato salino contenente 0,1% di polietilene glicole sorbitan monolaurato e poi incubare con l'anticorpo secondario (anti-coniglio) in soluzione bloccante (dal punto 13.9) ad una diluizione 1: 2.500 per 1 ora.
- Lavare la membrana con tampone fosfato salino contenente 0,1% di polietilene glicole sorbitano e rilevare le bande proteiche con Western Blot reagente di rilevazione utilizzando l'acquisizione delle immagini e software di analisi.
- Per il controllo di carico, lavare la membrana e ripetere i passaggi 13,9-13,12 utilizzando un anticorpo primario β-actina (dal mouse, 1: 10.000 diluizione) e un anticorpo secondario (anti-topo 1: 4.000 diluizione).
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Representative Results
Questo protocollo descrive l'uso di un sistema di erogazione non virale per sicuro ed efficiente siRNA trasfezione. I risultati SEM mostrano che le particelle PCPs sono di forma cilindrica e ha un diametro di 2,6 micron (Figura 2A). Le particelle vengono caricate positivamente con un potenziale zeta di circa 8,21 (Figura 2B), consentendo in tal modo elettrostatico vincolante con nucleotidi carica negativa. Immagini confocali di diversi strati di particelle PCPs dimostrano che il controllo fluorescente siRNA viene caricato all'interno delle particelle di silicio poroso (Figura 2C). La formazione e il rilascio di Arg-PEI / siRNA nanoparticelle dalle particelle PSI è stata confermata con DLS e AFM. La granulometria delle particelle variava 70-120 nm, con una dimensione media di 94 nm (Figura 2D). Immagini AFM illustrare che le nanoparticelle hanno una forma sferica (Figura 2E).
Il ratio di particelle di siRNA è stato ottimizzato mediante elettroforesi su gel di agarosio per garantire un'elevata affinità di legame (Figura 3A). Una vasta gamma di particella rapporti siRNA stata utilizzata (2 × 10 5, 4 × 10 5, 6 × 10 5, 8 × 10 5, 10 × 10 e 12 × 5 10 5 /0.2 mcg siRNA). I risultati indicano che può siRNA legano strettamente alle particelle quando la quantità delle particelle è superiore a 8 × 10 5. Un rapporto di 10 × 10 5 PCPS / 0,2 mcg siRNA è stato selezionato per ulteriori esperimenti. Inoltre, siRNA stato rilasciato correttamente dal supporto quando trattati con SDS, come illustrato nella Figura 3B.
Avanti, l'interiorizzazione cantina PCPs / fluorescenti particelle siRNA di controllo è stata valutata in MDA-MB-231 cellule. Immagini confocale prese dopo 24 ore di trattamento mostrano che le particelle siano effettivamente internalizzati nelle cellule (Figura 4 la Figura 5 mostra che l'89% delle cellule ha interiorizzato PCP / particelle siRNA dopo 24 ore di incubazione. Inoltre, il processo di internalizzazione stata registrata per 12 ore (Video 1). Questi risultati indicano che le particelle PCP possono efficacemente fornire siRNA in cellule. L'accumulo a lungo termine di siRNA all'interno delle cellule è stata anche valutata mediante microscopia confocale. Al giorno 7 e il giorno 10 del siRNA era ancora rilevabile all'interno delle cellule (Figura 6).
Uno dei fattori più importanti da considerare quando si sviluppa un sistema di consegna siRNA è la sicurezza del vettore 13. PEI è noto per formare polyplexes con siRNA, aiuti in assorbimento cellulare e di rilascio del pulsante dal endosomi / lisosomi. Tuttavia, PEI può avere effetti tossici, a causa della presenza di gruppi amminici primari carica positiva nel backbone 14,15. Per esempio, PEI legame al glicocalice sulla superficie cellulare può comportare la formazioni di grandi cluster 16. Al fine di eliminare questa tossicità carica indotta, PEI è covalentemente coniugato all'arginina attraverso un linker ponte, per ridurre il numero di gruppi amminici primari. La vitalità cellulare è rimasta oltre il 95% dopo 48 ore e 72 ore quando le particelle e siRNA stati usati ad una concentrazione fino a 6 × 10 5 / pozzetto e 100 nM, rispettivamente (Figura 7A). Quindi, l'efficacia della trasfezione siRNA contro la oncogene ATM è stata valutata in MDA-MB-231 cellule. Risultati Western Blot dimostrano che i livelli di proteina di ATM sono diminuiti dopo il trattamento con PCPS / ATM siRNA (Figura 7B). I risultati suggeriscono la piattaforma PCPS è un sistema di consegna sicura ed efficiente per siRNA.
Figura 1. Rappresentazione schematica di silicio poroso (PCP) particelle policatione-funzionalizzato. strong> arginina (Arg) -polyethylenimine (PEI) / piccole interferenti RNA (siRNA) nanoparticelle sono formate dopo la degradazione del silicio (Si).
Figura 2. Caratterizzazione delle particelle PCPs. Immagine (A) microscopia elettronica a scansione (SEM) di particelle PCPs. (B) Zeta potenziale di particelle PCPs. (C) le immagini confocale di diversi strati delle particelle controllo siRNA PCP / fluorescente. Distribuzione dei arginina Arg-PEI / controllo nanoparticelle siRNA liberati dalle microparticelle di silicio poroso (D) Size. (E) microscopia a forza atomica (AFM) immagini di Arg-PEI / controllo nanoparticelle siRNA. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. agarosio gel per l'ottimizzazione del sistema di erogazione PCPS / siRNA. (A) Binding affinità tra particelle PCP e controllare siRNA. Le bande rappresentano non legato siRNA. (B) di rilascio di siRNA a seguito di incubazione con il 2% SDS per 1 ora. Le bande rappresentano totale siRNA (non legato e legato). Esempio 1: siRNA; campione 2: 2 × 10 5 PCPs particelle / 0,2 mcg siRNA; campione 3: 4 × 10 5 PCPs particelle / 0,2 mcg siRNA; campione 4: 6 × 10 5 PCPs particelle / 0,2 mcg siRNA; campione 5: 8 × 10 5 PCPs particelle / 0,2 mcg siRNA; Campione 6: 10 × 10 5 PCPs particelle / 0,2 mcg siRNA; Campione 7: 12 × 10 5 PCPs particelle / 0,2 mcg siRNA.
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Figura 4. immagini al microscopio confocale di PCP / particelle fluorescenti siRNA (rosso) in MDA-MB-231 cellule (24 ore di incubazione). Il nucleo e actina filamentosa è stata visualizzata con 4 ', 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI, blu ) e falloidina (verde), rispettivamente. Tre diversi livelli sono stati ripresi (in alto, medio e basale). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. portata quantitativa analisi di citometria di fluorescenti MDA-MB-231 cellule dopo incubazione con PCPS / controllo particelle siRNA fluorescente. Le cellule non trattate sono stati utilizzati come controllo negativo. 89% di cellule aveva interiorizzato le particelle.
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Figura 6. immagini confocale di controllo fluorescenti siRNA (rosso) all'interno MDA-MB-231 cellule. Le cellule sono state incubate con PCP / fluorescenti controllo particelle siRNA per 1 giorno, 7 giorni e 10 giorni. Le cellule sono state poi visualizzati con microscopia confocale. Il nucleo e filamentosa actina è stato visualizzato con 4 ', 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI, blu) e falloidina (verde), rispettivamente. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 7. La vitalità cellulare e silenziamento genico in vitro. (A) Una cellula redditività dosaggio di cellule incubate con particelle PCP e particelle PCPS / controllo siRNA (SCR). Esperimento è stato condotto in viaggiolicate ei risultati sono presentati come media ± deviazione standard. Le cellule non trattate (vuote) e le cellule incubate con PBS sono stati utilizzati come controlli. (B) Western Blot di PCPS / atassia telangiectasia mutato (ATM) di particelle siRNA. Le cellule sono state esposte a PCPS / controllo siRNA (Scr) particelle e particelle PCPS / ATM siRNA. Cellule non trattate (finte) sono stati usati come controllo. β-actina è stato utilizzato come controllo di caricamento.
Video 1 . captazione in funzione del tempo di PCPs / fluorescenti controllo particelle siRNA in vivo le cellule MDA-MB-231. Il video è stato registrato per 12 ore dopo l'esposizione alle cellule di particelle.
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Discussion
Questo protocollo descrive un metodo per il successo di consegna e trasfezione di siRNA in cellule. In particolare, la fornitura di siRNA è ottenuto utilizzando una piattaforma multifunzionale costituito da particelle PSI policatione-funzionalizzato. L'uso della terapia siRNA ha un grande potenziale, per esempio, il trattamento del cancro, come i vari oncogeni possono essere mirati con alta specificità. Pertanto, esiste una domanda per sviluppare veicoli di consegna siRNA, che può attenuare le sfide della terapia siRNA. In conclusione, abbiamo delineato un protocollo che mostra la promessa per la consegna sicura ed efficiente di siRNA. Tuttavia, ci sono alcuni fattori chiave che dovrebbero essere presi in considerazione quando si esegue la tecnica descritta. Per esempio, una considerazione importante quando preparazione delle particelle PCPs è avere cura del siRNA, per evitare la degradazione mediante nucleasi. In particolare, guanti puliti e RNAse tubi gratuiti e acqua dovrebbero essere usati in qualsiasi momento quando si lavora consiRNA. Se la trasfezione efficacia siRNA è basso, uno spray che rimuove la contaminazione RNAse può essere usato per spruzzare guanti e aree di lavoro. Inoltre, se la transfezione è riuscita, il siRNA deve essere testato con un reagente di trasfezione commerciale, per determinare se il problema è causato dal siRNA o particelle. Un'altra considerazione importante per il successo dell'attuazione del sistema di erogazione / siRNA PCPS è di prendersi cura durante l'esecuzione di centrifugazione e lavaggio passi. Vale a dire, il supernatante deve essere completamente eliminata per rimuovere i reagenti in eccesso necessari durante le fasi di preparazione di particelle.
Un importante vantaggio del sistema PCPS / consegna di siRNA è la sicurezza. Diversi agenti di transfezione siRNA hanno un'alta carica cationica, che contribuisce alla tossicità cellulare 13,15. Infatti, la maggior parte dei protocolli commerciali indicano che i reagenti devono essere incubati con le cellule per poche ore, per evitare la morte cellulare. Al contrario, cells possono essere esposti alle particelle PCPs per diversi giorni senza alcun segno di tossicità, come è evidente dai dati della vitalità cellulare. Le particelle possono legarsi PCPs siRNA con elevata affinità per la presenza di PEI. Tuttavia la tossicità indotta carica di PEI è impedito dalla configurazione unica della piattaforma di erogazione. Specialmente il legame di Arg a PEI covalente e l'incapsulamento del PEI all'interno Si pori contribuiscono alla tossicità ridotta. Un altro vantaggio della piattaforma PCPS è che siRNA trasfezione può avvenire in presenza di siero. Altri metodi esistenti di solito richiedono l'uso del libero di siero di coltura cellulare multimediale, aggiungendo così ulteriori passaggi al processo di transfezione e potenzialmente interferire con vie di segnalazione delle cellule normali.
Un ulteriore vantaggio del sistema PCPS è che non richiede alcuna modifica delle molecole siRNA. Mentre alcuni metodi attuali richiedono misure di coniugazione complicati per stabilizzare il siRNA o per abilitare cinteriorizzazione ellular 13, il sistema si basa su PCPS semplice miscela di siRNA carico. Il legame PEI ed i pori nel materiale Si fornire un ambiente protettivo per la siRNA, riducendo così il contatto con nucleasi. Le particelle PCP possono essere conservati per lunghi periodi di tempo, come materiale essiccato o in alcool isopropilico. Inoltre, se le particelle PCPS / siRNA sono liofilizzati possono essere conservati per almeno tre mesi a 4 ° C. Le particelle PCPs liofilizzati devono essere sospese in RNase acqua libera poco prima trasfezione, e non devono essere conservati in soluzione. Infine, i permessi piattaforma PCPS sostenuti rilascio di siRNA, come riportato in precedenza 11, aumentando di conseguenza il periodo di tempo in cui si rivolgono i geni rimangono soppressi. Di conseguenza, dopo internalizzazione cellulare, le particelle Si degradano gradualmente, causando la formazione di nanoparticelle Arg-PEI / siRNA. Successivamente, il siRNA viene rilasciato lentamente nel citoplasma, dove può legarsi a MESSEdito RNA (mRNA), esercitando in tal modo l'attività biologica. Sebbene, particelle PCPs offrono diversi vantaggi rispetto ai metodi esistenti per la consegna siRNA, una limitazione della tecnica è che microparticelle non funzionalizzati psi sono richiesti a materiale di partenza. Mentre le particelle possono essere sintetizzati mediante fotolitografia e attacco elettrochimico 17, queste tecniche non sono prontamente disponibili in tutte le istituzioni.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polyethylenimine (PEI), branched | Sigma-Aldrich | 408727 | Average molecular weight ~25,000 Da |
| L-Arginine | Sigma-Aldrich | A5006 | Reagent grade, ≥98% |
| Boc-Asp-OH | Sigma-Aldrich | 408-468 | 99% |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763 | 30 wt. % in H2O |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 339741 | 100.00% |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907 | ≥99.7% |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 459844 | ≥99.5% |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) | Sigma-Aldrich | 03449 | ≥99% |
| Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A7030-10G | Blocking agent |
| Ataxia-telangiectasia mutated siRNA | Sigma-Aldrich | Designed in-house | |
| Tris Acetate-EDTA buffer | Sigma-Aldrich | T9650 | For DNA agarose gel electrophoresis |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | Polyethylene glycol sorbitan monolaurate |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250 | For Western blot |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 71496 | For making phosphate buffer |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 71640 | For making phosphate buffer |
| Anti-Mouse IgG | Sigma-Aldrich | A4416 | Secondary antibody (anti-mouse) for Western blot |
| N-Hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 130672 | 98% |
| CELLSTAR 96W Microplate Tissue Culture Treated Clear w/ Lid | Greiner Bio-One | 655182 | 96-well plate |
| 10x Tris-Glycine Liquid | Li-Cor | 928-40010 | Transfer buffer for Western blot |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | Santa Cruz | Sc-281692 | Fixation of cells |
| CellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (MTS) | Promega | G5421 | Proliferation assay |
| Phosphate buffered saline | Fisher Scientific | BP399-500 | 10x Solution |
| Corning cellgro Dulbecco's Modification of Eagle's (Mod.) | Fisher Scientific | MT-15-017-CM | Cell culture media, 1x solution |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | AC21568-2500 | Octyl phenol ethoxylate, permeabilization agent |
| Cover glass | Fisher Scientific | 12-530C | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-1 | For Western blot transfer buffer |
| Plastic Cuvettes | Fisher Scientific | 14-377-010 | For size measurements using Zetasizer Nano ZS |
| Molecular BioProducts RNase AWAY Surface Decontaminant | Fisher Scientific | 14-754-34 | Spray for removing RNAse contamination |
| Agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | Low melting point, for running RNA samples |
| ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | Antifade reagent with DAPI, nucelus detection |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen | A12379 | Dissolve 300 units in 1.5 ml methanol, detection of filamentous actin |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | Invitrogen | S33102 | Visualization of RNA |
| Negative Control siRNA | Qiagen | 1022076 | Control siRNA |
| AllStars Neg. siRNA AF 555 | Qiagen | 1027294 | Fluorescent control siRNA |
| Cell scraper | Celltreat | 229310 | |
| BioLite Multidishes and Microwell Plates | Thermo Scientific | 130184 | 6-well plate |
| Pierce LDS Sample Loading Buffer (4x) | Thermo Scientific | 84788 | Sample loading buffer for Western blot |
| Pierce BCS Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | Protein quantification assay |
| Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktails (100x) | Thermo Scientific | 78430 | Protease inhibitor cocktail, use at 1x |
| M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent | Thermo Scientific | 78501 | Protein extraction reagent |
| Sorvall Legend Micro 21R | Thermo Scientific | 75002440 | Centrifuge |
| Beta Actin Antibody | Thermo Scientific | MA1-91399 | β-actin primary antibody (from mouse) for western blot |
| 6x TriTrack DNA Loading Dye | Thermo Scientific | R1161 | DNA loading dye |
| Nuclease-Free Water | Life Technologies | AM9938 | |
| Non-Fat Dry Milk | Lab Scientific | M0841 | For Western blot |
| 2-well BD Falcon culture slides | BD Biosciences | 354102 | 2-well culture slides |
| Amersham ECL Western blot detection reagent | GE Healthcare Life Sciences | RPN2106 | Western blot detection reagent |
| BA Membranes | GE Healthcare Life Sciences | 10402096 | Nitrocellulose membrane for Wester blot |
| ATM (D2E2) Rabbit mAb | Cell Signaling | 2873S | ATM primary antibody (from rabbit) for Western blot |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7074 | Secondary antibody (anti-rabbit) for Western blot |
| Folded capillary cells | Malvern | DTS 1061 | For zeta potentail measurements using Zetasizer Nano ZS |
| MDA-MB-231 cell line | ATCC | HTB-26 | Mammary Gland/Breast |
| 12% Mini-PROTEAN TGX Gel | Bio-rad | 456-1043 | For Western blot |
| Biorad PowerPac HC | Bio-rad | 164-5052 | Power supply for electrophoresis |
| 10x Tris/Glycine/SDS Buffer | Bio-rad | 161-0732 | Running buffer for Western blot |
| Wide Mini-Sub Cell GT Cell | Bio-rad | 170-4405 | Electrophoresis equipment for DNA agarose gel |
| Mini-PROTEAN Tetra cell | Bio-rad | 165-8000 | Electrophoresis equipment for Western blot |
| ChemiDoc XRS+ System with Image Lab Software | Bio-rad | 170-8265 | Image acquisition and analysis software for gels and blots |
| 4" (10 cm) dia., 5 x 7 mm diced Silicon Wafer | Ted Pella | 16007 | Silicon waferfor scanning electron microscopy and atomic force microscopy |
| Thermomixer R | Eppendorf | 22670107 | Shaker |
| Isoton II diluent | Beckman Coulter | 8546719 | Isoton diluent |
| Multisizer 4 Coulter Counter | Beckman Coulter | A63076 | Particle counting analyzer |
| Non-functionalized porous silicon particles | Microelectronics Research Center, University of Texas at Austin | Dicoidal shape. 2.6 μm (diameter) x 0.7 μm (height), provided in isopropyl alcohol | |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | Particle analyzer system for size and zeta potential | |
| Scanning Electron Microscope | FEI | Particle size and shape | |
| Atomic Force Microscope | Bruker | Particle size and shape | |
| Fluo ViewTM 1000 Confocal Microscope | Olympus | Visualization of fixed and live cells |
References
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