Summary
Levering er fortsatt den viktigste utfordringen for den terapeutiske gjennomføring av små RNA forstyrrende (siRNA). Denne protokollen innbefatter bruken av en multifunksjonell og biokompatibelt siRNA levering plattform, bestående av arginin og polyetylenimin podet porøse silisium mikropartikler.
Introduction
Små interfererende RNA (sirnas) er dobbelt-RNA-molekyler som kan undertrykke uttrykket av gener. I de senere årene har sirnas blitt utviklet som en ny generasjon av biodrugs som viser terapeutisk potensial for fremtidig bruk i kliniske applikasjoner 1-5. Men fortsatt er vellykket implementering av siRNA terapi en betydelig utfordring, på grunn av nedbrytning av nukleaser, dårlig intracellulære opptaket, lav transfeksjonseffektivitet og ineffektiv utgivelse fra endosomet / lysosomet 5. Mange av disse hindringer kan overvinnes ved utvikling av levering plattformer, som sikkert og effektivt kan levere siRNA til sykt vev. Sammenlignet med virusbærere, ikke-virale plattformer gir flere fordeler, for eksempel sikkerhet, lave kostnader og enkel skreddersøm. Spesielt kationiske nanopartikler, så som polymerer og lipider, har vist seg nyttig for siRNA levering 3.
Tidligere har vi utviklet en skiveformede drug leveringssystem, betegnet flertrinns vektor (MSV). Denne plattformen er basert på sekvensielle trinn, hvor ett kjøretøy er frigjort fra hverandre. Det første trinn kjøretøy er en mikropartikkel laget av biologisk nedbrytbare porøse silisium (PSI), mens den andre fasen kjøretøyer er nanopartikler ladet med medikamenter eller kontrastmidler 6,7. Nanopartikler, som er innebygd i PSI materiale, er gradvis utgitt som Si degraderer 8. En fordel med å bruke Si partikler er at morfologi og overflateegenskaper kan enkelt tilpasses for å oppnå optimal biodistribusjon og narkotika utgivelse. Nylig ble den vellykkede bruk av MSV-plattform for levering av siRNA liposomer til tumorvevet vist i en ovarian og brystkreft musemodell 9, 10.
I dette arbeidet har vi fabrikkert en universell levering system for siRNA basert på prinsippene i MSV-plattformen. Effekten av dette avgivelsessystemet har tidligere blitt demonstrert ossing forskjellig siRNA molekyler 11. Systemet er et polykation-funksjonalisert porøs silisium (PCPS) bærer, som består av PSI podet med polyetylenimin (PEI) og arginin (Arg). PEI kan hjelpe til å danne elektrostatiske interaksjoner med siRNA, mens Arg og PSI kan tjene til å redusere giftigheten av PEI, som tidligere demonstarted 11. I tillegg kan tilstedeværelsen av PEI bistå i intracellulært opptak og endosomale flukt, mens psi mikropartikler mulig siRNA beskyttelse og forlenget frigivelse. PSI partiklene gradvis nedbrytes under fysiologiske betingelser, for derved å resultere i dannelsen av Arg-PEI / siRNA nanopartikler (figur 1), som har en distinkt morfologi og en smal størrelsesfordeling 11. For detaljer om stabiliteten i PCPS / siRNA system, henvises til studiet av Shen et al. 11. Dette PCPS plattformen skiller seg fra konvensjonell MSV, siden de andre scenenanopartikler ikke er i utgangspunktet present i transportøren, men dannes over tid som første-trinns bærer degraderer 11, 12. Den siRNA lasteeffektivitet, cytotoksisitet og genet stanse effektiviteten av PCPS systemet har blitt evaluert in vitro. Transfeksjonseffektiviteten ble målt ved hjelp av siRNA mot ataxia telangiectasia mutated (ATM) onkogen, som er involvert i DNA-reparasjon 10. Tidligere har undertrykkelse av ATM blitt vist å redusere tumorvekst i en brystkreftmodell 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. PCPS Particle Forberedelse
- Oksydere ikke-funksjonaliserte porøse silisiumpartikler i en 30% oppløsning av hydrogenperoksyd ved 95 ° C i 2 timer. Aminere de oksyderte partikler som i 2% (3- aminopropyl) trietoksysilan løsning i isopropylalkohol i 2 dager ved 65 ° C med forsiktig omrøring.
- Sentrifuger løsningen i 30 minutter ved 18800 xg og vaske partiklene to ganger i isopropylalkohol og tre ganger i etanol, ved hjelp av korte ultralydbehandling for å suspendere pelleten. La partiklene i etanol løsning når du utfører trinn 1.3 og 1.4.
- Legg til et kjent volum av suspensjon partikkel (for eksempel 10 mikroliter) til 10 ml isoton fortynningsmiddel og telle partikler med en partikkeltelling analysator for å bestemme konsentrasjonen av partikler i stamløsningen.
- Aktivere syregruppen av L-arginin (0,1 nmol) med N - (3-dimetylaminopropyl) - N'-etylkarbodiimidhydroklorid (EDC, 0,1 nmol) / N
- I korthet sonikere partikkelstamoppløsning og tilsett 1 milliard partikler til L-arginin løsningen og la reaksjonsblandingen i 18 timer ved romtemperatur med forsiktig omrøring.
- Aktivere den første asparaginsyre gruppe av N - (tert-butoksykarbonyl) -L-asparaginsyre (Boc-Asp-OH, 1 nmol) med EDC (0,1 nmol) / NHS (0,1 nmol) i 20 ml etanol i 4 timer ved 4 ° C under forsiktig omrøring.
- Oppløs 50 mg polyetylenimin i 10 ml etanol og tilsett løsningen til Boc-Asp-OH-blanding. La reaksjonen forløpe i 24 timer ved romtemperatur med forsiktig omrøring.
- Aktivere den andre asparaginsyre gruppe av Boc-Asp-OH / PEI-løsning med EDC (0,1 nmol) / NHS (0,1 nmol) ved 4 ° C i 6 timer under forsiktig omrøring.
- For å få PCPS partikler, legge partikkel løsning fra trinn 1.5 inn i Boc-Asp-OH / PEI løsning fra trinn 1.8. Tillat reaksjonen å forløpe i 18 timer ved romtemperatur med forsiktig st irring.
- Sentrifuger løsningen i 30 minutter ved 18800 xg og vaske partikkel løsningen tre ganger med etanol, ved hjelp av korte ultralydbehandling for å suspendere pelleten.
2. PCPS Particle Karakterisering
- Måle størrelsen av partiklene ved hjelp av et scanning elektronmikroskop (SEM).
- Plasser en dråpe partikkel suspensjon (10.000 partikler / mikroliter i etanol) på en ren silika SEM prøve spire og la tørke ved RT under vakuum.
- Mål SEM bilder på 8 kV med en 3-5 mm arbeidsavstand ved hjelp av en in-linse detektor.
- Måle zeta-potensialet for partiklene med en partikkelanalysesystem.
- Bland 10 ul av partikkelsuspensjonen (10 000 partikler / ul i etanol) med 1 ml 10 mM fosfatbuffer (pH 7,4).
- Laste prøven i foldet kapillær celler og måle zeta potensialet i henhold til produsentens instruksjoner.
- Tørk de PCP-partikler (fra PCPS Partikkelfremstilling trinn 1.9) under vakuum, O / N.
- Legg siRNA (4 mikrogram) i nukleasefritt vann (20 mL) til de tørkede PCPS partikler og sonikere kort. Bruk følgende partikkel til siRNA forholdstall: 2 × 10 5 partikler / 0,2 mikrogram siRNA, 4 × 10 5 partikler / 0,2 mikrogram siRNA, 6 × 10 5 partikler / 0,2 mikrogram siRNA, 8 × 10 5 partikler / 0,2 mikrogram siRNA, 10 × 10 5 partikler / 0,2 mikrogram siRNA og 12 × 10 5 partikler / 0,2 mikrogram siRNA.
- Inkuber i 3 timer ved 4 ° C på en ristemaskin (1000 opm) for å tillate siRNA binding til partiklene.
4. Optimalisering av siRNA / PCPS Partikkel Ratio
- Legg DNA lasting fargestoff til 20 mL av de PCPS / kontroll siRNA partikler med forskjellig partikkel til siRNA forholdstall (se lasting av siRNA inn PCPS partikler).
- Laste sampler inn i en 2% agarosegel inneholdende DNA-gel flekken.
- Utføre elektroforesen ved en konstant spenning på 120 V i 20 minutter i rennende buffer.
- Analyser gel med bilde oppkjøpet og analyseprogramvare.
5. Slipp av siRNA fra PCPS Partikler
- Bland 20 ul av de PCPS / kontroll siRNA partikler med forskjellig partikkel til siRNA-forhold (se trinn 3) i natriumdodecylsulfat (SDS, 2%) og la stå i 1 time ved RT.
- Legg DNA lasting fargestoff til prøvene.
- Belastningsprøver inn i en 2% agarosegel inneholdende DNA-gel flekken.
- Utføre elektroforese på en konstant spenning på 120 V i 20 min i buffer ved hjelp DNA elektroforese utstyr og en strømforsyning.
- Analyser gel med bilde oppkjøpet og analyseprogramvare.
6. Konfokalmikroskopi av PCPS Partikler
- Tilsett 5 mL av PCPS / fluorescerende kontroll siRNA partikler (10 × 10 5 partikler / 0.2 mikrogram siRNA / 20 fil) til et glass dekkglass.
- Visualisere partikkel lag ved konfokalmikroskopi.
7. Karakterisering av Arg-PEI / kontroll siRNA Nanopartikler
- Å nedbryte silikonmaterialet og danne Arg-PEI / kontroll siRNA nanopartikler, tilsett PCPS / siRNA partikler (10 x 10 6 PCPS partikler / 2 ug siRNA) til 100 ul av fosfatbufret saltvann og rist (1000 rpm) ved 37 ° C i 2 dager.
- Sentrifugere prøven i 30 minutter ved 18800 xg og samle supernatanten.
- Måle størrelsen på de dannede Arg-PEI / siRNA nanopartikler med dynamisk lysspredning (DLS).
- Bland 10 ul av supernatanten med 1 ml 10 mM fosfatbuffer (pH 7,4) og plasseres i en plast kyvette.
- Måle størrelsen av partiklene ved hjelp av et partikkelanalysesystemet i henhold til produsentens instruksjoner.
- Bestemme størrelsen og morfologien til det dannede Arg / PEI-siRNAnanopartikler med atomic force mikroskopi.
- Ta 10 mL av supernatanten og sted på en silisiumskive.
- Visual partiklene med atomic force mikroskopi (AFM).
8. Cell Culture
- Kultur MDA-MB-231 human brystcancer-celler i cellekulturmedium supplert med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin-streptomycin ved 5% CO2, 95% luftfuktighet og 37 ° C.
9. Konfokalmikroskopi av levende celler med PCPS Partikler
- Plate-celler i 2-brønners kultur glir på en seeding tetthet på 3 x 10 5 celler / brønn i 24 timer.
- Legg PCPS partikler lastet med fluorescerende kontroll siRNA (10 × 10 5 partikler / 0,2 mikrogram partikkel til siRNA ratio, 50 nM siRNA) til cellene.
- Ta opp en film av cellene med et konfokal mikroskop (følger med et kammer, 5% CO 2, 95% luftfuktighet og 37 ° C) i 12 timer etter partikkel exposikker.
10. Konfokalmikroskopi av Faste Celler med PCPS Partikler
- Plate-celler i 2-brønners kultur glir på en seeding tetthet på 3 x 10 5 celler / brønn i 24 timer.
- Legg PCPS partikler lastet med fluorescerende styre siRNA (10 x 10 5 partikler / 0,2 ug partikkel til siRNA-forhold, 50 nM siRNA) til cellene og inkuberes i 1 dag, 7 dager og 10 dager.
- Vask cellene to ganger med fosfat-bufret saltvann, og deretter feste dem med 4% paraformaldehydløsning i 10 min.
- Vask cellene med fosfatbufret saltvann.
- Permeabilisere cellene med 0,1% oktylfenol-etoksylat i 10 minutter og deretter vaske dem tre ganger med fosfat-bufret saltvann.
- Blokkere cellene med albumin fra bovin serum (10 mg / ml) i fosfatbufret saltvann i 10 minutter ved RT under forsiktig omrøring.
- For å visualisere trådformede aktin, inkuberes cellene med fluorescensmerket phalloidin (1 pl / 40 ulblokkeringsløsning) i 20 minutter ved romtemperatur med forsiktig omrøring, og deretter vaskes i fosfatbufret saltvann.
- Fjern lysbilder fra rammen og legge antifade reagens med 4 ', 6-diamidino-to-phenylindole (DAPI) for å visualisere kjernen.
- Legg et dekkglass på toppen og ta bilder av cellene med konfokal mikroskopi.
11. flowcytometrisystemer av Celler med PCPS / lysrør Kontroll siRNA Partikler
- Plate-celler i en 6-brønns plate ved en densitet på 3 seeding x 10 5 celler / brønn i 24 timer.
- Legg PCPS partikler lastet med fluorescerende styre siRNA (10 x 10 5 partikler / 0,2 ug partikkel til siRNA-forhold, 50 nM siRNA) til cellene og inkuberes i 24 timer.
- Vask cellene med fosfatbufret saltvann, og skrape dem med en celleskrape.
- Lagring av celler i fosfat-bufret saltløsning med 2% bovint fosterserum forut for analysen. Bruke ubehandlede celler som en negativ kontroll.
- Utføre flyt cytometry.
12. Cell Livskraftig av Celler med PCPS Partikler og PCPS / kontroll siRNA Partikler
- Plate-celler i en 96-brønns plate ved en celletetthet på 3 x 10 3 celler / brønn i 24 timer.
- Behandle cellene med PCPS partikler (1,5 × 10 5 / brønn og 6 × 10 5 / brønn) eller PCPS / kontroll siRNA partikler (10 × 10 5 partikler / 0,2 mikrogram partikkel til siRNA ratio, 10 nM og 100 nM siRNA) for 48 hr og 72 timer. Bruke ubehandlede celler og celler behandlet med fosfat-bufret saltvann (samme volum som de tilsatte partikler) som kontroller. Analyser hver prøve in triplo.
- Utfør en celleproliferasjonsanalyse henhold til produsentens instruksjoner.
- Representerer data som gjennomsnitt ± standardavvik.
13. Western Blot av Celler med PCPS / ATM mutert siRNA Partikler
- Plate-celler i en 6-brønns plate ved en celletetthet 2 x 10 5 celler / well i 24 timer.
- Inkuber cellene med PCPS / kontroll siRNA (50 nM) partikler eller PCPS / ATM siRNA (50 nM) partikler i 72 timer. Bruke ubehandlede celler som en kontroll.
- Lyse av cellene ved bruk av et protein ekstraksjon reagens supplert med protease inhibitor cocktail.
- Sentrifuger cellelysater i 10 minutter ved 14000 xg og gjenvinne supernatanten.
- Bestem proteinkonsentrasjonen med et protein kvantifisering assay i henhold til produsentens instruksjoner.
- Legg prøveladningsbuffer (med 5 pl 2-merkaptoetanol / ml buffer) til prøvene og varme dem i 6 minutter ved 99 ° C.
- Laste proteinprøver (20 ug / ul) i en 12% SDS-polyakrylamid-gel i rennende buffer og utføre polyakrylamidgelelektroforese (1 time, 120 V) ved hjelp av elektroforese utstyr og en strømforsyning.
- Overfør gelen i overføringsbuffer (med 20% metanol) til en nitrocellulosemembran (1 time, 100 V) ved hjelp av elektroforese utstyren strømforsyning.
- Blokkere membran med 5% tørrmelk for 1 time.
- Inkuber membran med ATM primære antistoff (fra kanin) i blokkeringsløsning (fra trinn 13.9) ved en 1: 1000 fortynning O / N.
- Vask membranen med fosfatbufret saltvann inneholdende 0,1% polyetylenglykol-sorbitan-monolaurat, og deretter inkubere den med sekundært antistoff (anti-kanin) i blokkeringsløsning (fra trinn 13.9) ved en 1: 2500 fortynning i 1 time.
- Vask membranen med fosfatbufret saltvann inneholdende 0,1% polyetylenglykol-sorbitan-monolaurat, og påvise proteinbåndene med Western blot deteksjonsreagensen hjelp bildeopptak og analyseprogramvare.
- For lasting kontroll, vaske membranen og gjenta trinn 13,9 til 13,12 ved hjelp av en β-aktin primær antistoff (fra mus, 1: 10.000 fortynning) og en sekundær antistoff (anti-mus 1: 4000 fortynning).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokollen beskriver anvendelsen av et ikke-virale leveringssystem for sikker og effektiv siRNA transfeksjon. SEM-resultater viser at de PCPS partiklene er sylindrisk i form og har en diameter på 2,6 um (figur 2A). Partiklene blir positivt ladet med et zeta potensial på omtrent 8,21 (figur 2B), for derved å muliggjøre elektrostatisk binding med negativt ladede nukleotider. Konfokale bilder av forskjellige lag av PCPS partiklene viser at fluorescerende kontroll siRNA er lagt inne i et porøst silisiumpartikler (figur 2C). Dannelse og frigjøring av Arg-PEI / siRNA nanopartikler fra PSI partikler ble bekreftet med DLS og AFM. Størrelsesfordelingen av partiklene varierte 70-120 nm, med en gjennomsnittlig størrelse på 94 nm (figur 2D). AFM bilder illustrerer at nanopartikler har en sfærisk form (figur 2E).
Den Ratio av partikler til siRNA ble optimalisert ved agarosegelelektroforese for å sikre høy bindingsaffinitet (figur 3A). Et bredt spekter av partikkel til siRNA-forhold ble brukt (2 x 10 5, 4 x 10 5, 6 x 10 5, 8 x 10 5, 10 x 10 5 og 12 × 10 5 /0.2 mikrogram siRNA). Resultatene tyder på at siRNA kan binde tett til partiklene når partikkel mengden er over 8 x 10 5. Et forhold på 10 x 10 5 PCPS / 0,2 ug siRNA ble valgt for videre eksperimenter. Videre siRNA ble vellykket frigjort fra bæreren ved behandling med SDS, som vist i figur 3B.
Deretter ble kjellerinternalisering av PCP / fluorescerende kontroll siRNA partikler evaluert i MDA-MB-231-celler. Konfokale bilder tatt etter 24 timers behandling viser at partiklene effektivt internalisert inn i celler (figur 4 Figur 5 viser at 89% av cellene har internalisert PCPS / siRNA partikler etter 24 timers inkubasjon. Videre ble det intern prosessen innspilt i 12 timer (video 1). Disse resultatene indikerer at de PCPS partikler kan effektivt levere siRNA inn i celler. Den langsiktig oppbygging av siRNA inne i cellene ble også evaluert av konfokal mikroskopi. På dag 7 og dag 10 siRNA var fremdeles detekterbare inne i cellene (figur 6).
En av de viktigste faktorene for å vurdere ved utvikling av et siRNA leveringssystem er sikkerheten til transportøren 13. PEI er kjent for å danne polyplexes med siRNA, hjelp i cellulært opptak og utløse frigjøring fra endosomet / lysosomet. Imidlertid PEI kan ha en toksisk virkning, på grunn av tilstedeværelsen av positivt ladede primære aminogrupper i ryggraden 14,15. For eksempel, PEI binding til glycocalyx på celleoverflaten kan resultere i at fooversikt over den store klynger 16. For å eliminere denne charge-indusert toksisitet, ble PEI kovalent konjugert til arginin gjennom en bro linkeren, for å redusere antallet av primære aminogrupper. Den celleviabilitet forble over 95% etter 48 timer og 72 timer når partikler og siRNA ble anvendt i en konsentrasjon på opp til 6 x 10 5 / brønn og 100 nM, respektivt (figur 7A). Deretter ble transfeksjon effekt av siRNA mot oncogenet ATM evaluert i MDA-MB-231-celler. Western blot resultater viser at protein nivåer av ATM er redusert etter behandling med PCPS / ATM siRNA (Figur 7B). Resultatene tyder på at PCPS Plattformen er en trygg og effektiv levering system for siRNA.
Figur 1. Skjematisk fremstilling av polykation-funksjon porøst silisium (PCP) partikler. sterk> Arginin (Arg) -polyethylenimine (PEI) / små RNA interfererende (siRNA) nanopartikler dannes som følge av nedbrytning av silisium (Si).
Figur 2. Karakterisering av PCPS-partikler. (A) Scanning elektronmikroskopi (SEM) bilde av PCPS-partikler. (B) Zeta-potensialet av PCPS-partikler. (C) konfokale bilder av forskjellige lag av PCPS / fluoriserende styre siRNA partikler. (D) Størrelsesfordeling av de arginin Arg-PEI / kontroll siRNA nanopartikler som frigjøres fra de porøse silisiummikropartikler. (E) Atomic force mikroskopi (AFM) bilder av Arg-PEI / kontroll siRNA nanopartikler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Agarose-gel for optimalisering av PCPS / siRNA leveringssystem. (A) Binding affinitet mellom PCPS partikler og kontrollere siRNA. Bandene representerer ubundet siRNA. (B) siRNA meldingen etter inkubasjon med 2% SDS for 1 time. Bandene representerer total siRNA (ubundet og bundet). Prøve 1: siRNA; sample 2: 2 × 10 5 PCPS partikler / 0,2 mikrogram siRNA; Prøve 3: 4 × 10 5 PCPS partikler / 0,2 mikrogram siRNA; sample 4: 6 × 10 5 PCPS partikler / 0,2 mikrogram siRNA; sample 5: 8 × 10 5 PCPS partikler / 0,2 mikrogram siRNA; sample 6: 10 × 10 5 PCPS partikler / 0,2 mikrogram siRNA; sample 7: 12 × 10 5 PCPS partikler / 0,2 mikrogram siRNA.
75 / 52075fig4.jpg "/>
Figur 4. Confocal mikroskop bilder av PCPS / fluorescerende siRNA partikler (røde) i MDA-MB-231 celler (24 hr ruge). Kjernen og trådformede aktin ble visualisert med 4 ', 6-diamidino-to-phenylindole (DAPI, blå ) og phalloidin (grønn), henholdsvis. Tre forskjellige lag ble fotografert (øverst, midten og basal). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Kvantitativ strømningscytometri-analyse av fluorescerende MDA-MB-231-celler etter inkubasjon med PCPS / kontroll fluorescerende siRNA partikler. Ubehandlede celler ble anvendt som en negativ kontroll. 89% av cellene hadde internalisert partiklene.
igur 6 "src =" / files / ftp_upload / 52075 / 52075fig6.jpg "/>
Figur 6. Confocal bilder av fluorescerende kontroll siRNA (rød) inne MDA-MB-231 celler. Cellene ble inkubert med PCPS / fluorescerende kontroll siRNA partikler for en dag, 7 dager og 10 dager. Celler ble deretter visualisert med konfokal mikroskopi. Kjernen og trådformede aktin ble visualisert med 4 ', 6-diamidino-to-phenylindole (DAPI, blå) og phalloidin (grønn), henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7. Cellenes levedyktighet og genet Slå in vitro. (A) En celleviabilitet analyse av celler inkubert med PCPS partikler og PCPS / kontroll siRNA partikler (SCR). Forsøket ble utført i turlicate og resultatene er presentert som gjennomsnitt ± standardavvik. Ubehandlede celler (tomme) og celler inkubert med PBS ble anvendt som kontroller. (B) Western blot av PCPS / ataksi telangiectasia mutert (ATM) siRNA partikler. Celler ble utsatt for PCPS / kontroll siRNA (SCR) partikler og PCPS / ATM siRNA partikler. Ubehandlede celler (mock) ble anvendt som en kontroll. β-aktin ble benyttet som en lastekontroll.
Video 1 . Tidsavhengig opptak av PCPS / fluorescerende kontroll siRNA partikler i live-MDA-MB-231 celler. Videoen ble spilt inn i 12 timer etter utsette cellene til partikler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen beskriver en fremgangsmåte for en vellykket levering og transfeksjon av siRNA inn i celler. Spesielt er levering av siRNA oppnås ved hjelp av en multifunksjonell plattform bestående av polykation-funksjonalisert psi partikler. Bruk av siRNA terapi har stort potensial, for eksempel, kreftbehandling, som ulike onkogener kan være målrettet med høy spesifisitet. Derfor er det et krav om å utvikle siRNA levering kjøretøy, noe som kan redusere utfordringene i siRNA terapi. Avslutningsvis har vi skissert en protokoll som viser løfte om sikker og effektiv levering av siRNA. Men det er noen viktige faktorer som bør tas i betraktning når du utfører den beskrevne teknikken. For eksempel er en viktig faktor når fremstilling av PCPS-partikler til å håndtere siRNA forsiktig, for å unngå nedbrytning av nukleaser. Spesielt rene hansker og RNAse gratis rør og vann bør brukes til enhver tid når du arbeider medsiRNA. Dersom siRNA transfeksjon effekt er lav, kan en spray som fjerner RNAse forurensning brukes til å sprøyte hansker og arbeidsområder. I tillegg, hvis den ikke er vellykket transfeksjon, siRNA skal testes med en kommersiell transfeksjon reagens, for å finne ut om problemet er forårsaket av siRNA eller partiklene. En annen kritisk faktor for en vellykket gjennomføring av PCPS / siRNA levering systemet er å ta vare når du utfører sentrifugering og vasketrinn. Nemlig bør supernatanten bli fullstendig fjernet for å fjerne overskudd av reagenser som er nødvendige i hele partikkelfremstillingstrinnene.
En viktig fordel av PCPS / siRNA leveringssystem er sikkerhet. Flere siRNA transfeksjon midler har høy kationisk ladning, noe som bidrar til cellulær toksisitet 13,15. Faktisk, de fleste kommersielle protokoller viser at reagenser skal inkuberes med cellene i bare noen få timer, for å unngå celledød. Tvert imot, cells kan bli utsatt for de PCPS partikler i flere dager uten noen tegn på toksisitet, som det fremgår av cellenes levedyktighet resultater. De PCPS partikler kan binde siRNA med høy affinitet på grunn av tilstedeværelsen av PEI. Men lade-indusert toksisitet av PEI er forhindret av den unike oppsett av avleveringsplattformen. Spesielt den kovalente binding av Arg til PEI og innkapsling av PEI inne i Si porene bidrar til redusert toksisitet. En annen fordel av PCPS plattformen er at siRNA transfeksjon kan finne sted i nærvær av serum. Andre eksisterende fremgangsmåter krever vanligvis anvendelse av serumfritt cellekulturmedium, for derved å legge til ekstra trinn i prosessen transfeksjon og potensielt forstyrre jevncellesignalveier.
En ekstra fordel med PCPS systemet er at det ikke krever noen endring av siRNA-molekyler. Mens noen aktuelle metoder krever kompliserte konjugeringspartnere tiltak for å stabilisere siRNA eller å aktivere cellular intern 13, stoler PCPS system på enkel blanding for siRNA lasting. Bindingen til PEI og porene i Si materiale gir et beskyttende miljø for siRNA, og dermed redusere kontakt med nukleaser. De PCPS partiklene kan lagres i lengre tidsperioder som tørket materiale, eller i isopropylalkohol. Videre, hvis de PCPS / siRNA partikler er lyofilisert de kan lagres i minst tre måneder ved 4 ° C. De lyofiliserte PCPS partikler skal suspenderes i RNase fritt vann rett før transfeksjon, og bør ikke lagres i oppløsning. Endelig PCPS plattform tillater vedvarende frigivelse av siRNA, som tidligere rapportert 11, og følgelig å øke tidsperioden da målgener forblir undertrykket. Følgelig, etter cellulær internalisering, Si partikler gradvis brytes ned, noe som resulterer i dannelsen av Arg-PEI / siRNA nanopartikler. Deretter blir siRNA sakte utgitt i cytoplasma, der det kan binde seg til messenger RNA (mRNA), og dermed gir biologisk aktivitet. Selv PCPS partikler gir flere fordeler i forhold til eksisterende metoder for siRNA levering, en begrensning av teknikken er at ikke-funksjonaliserte mikropartikler psi er nødvendig som utgangsmateriale. Mens partiklene kan syntetiseres ved hjelp av fotolitografi og elektrokjemisk etsing 17, disse teknikkene er ikke lett tilgjengelig i alle institusjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polyethylenimine (PEI), branched | Sigma-Aldrich | 408727 | Average molecular weight ~25,000 Da |
| L-Arginine | Sigma-Aldrich | A5006 | Reagent grade, ≥98% |
| Boc-Asp-OH | Sigma-Aldrich | 408-468 | 99% |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763 | 30 wt. % in H2O |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 339741 | 100.00% |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907 | ≥99.7% |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 459844 | ≥99.5% |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) | Sigma-Aldrich | 03449 | ≥99% |
| Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A7030-10G | Blocking agent |
| Ataxia-telangiectasia mutated siRNA | Sigma-Aldrich | Designed in-house | |
| Tris Acetate-EDTA buffer | Sigma-Aldrich | T9650 | For DNA agarose gel electrophoresis |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | Polyethylene glycol sorbitan monolaurate |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250 | For Western blot |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 71496 | For making phosphate buffer |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 71640 | For making phosphate buffer |
| Anti-Mouse IgG | Sigma-Aldrich | A4416 | Secondary antibody (anti-mouse) for Western blot |
| N-Hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 130672 | 98% |
| CELLSTAR 96W Microplate Tissue Culture Treated Clear w/ Lid | Greiner Bio-One | 655182 | 96-well plate |
| 10x Tris-Glycine Liquid | Li-Cor | 928-40010 | Transfer buffer for Western blot |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | Santa Cruz | Sc-281692 | Fixation of cells |
| CellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (MTS) | Promega | G5421 | Proliferation assay |
| Phosphate buffered saline | Fisher Scientific | BP399-500 | 10x Solution |
| Corning cellgro Dulbecco's Modification of Eagle's (Mod.) | Fisher Scientific | MT-15-017-CM | Cell culture media, 1x solution |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | AC21568-2500 | Octyl phenol ethoxylate, permeabilization agent |
| Cover glass | Fisher Scientific | 12-530C | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-1 | For Western blot transfer buffer |
| Plastic Cuvettes | Fisher Scientific | 14-377-010 | For size measurements using Zetasizer Nano ZS |
| Molecular BioProducts RNase AWAY Surface Decontaminant | Fisher Scientific | 14-754-34 | Spray for removing RNAse contamination |
| Agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | Low melting point, for running RNA samples |
| ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | Antifade reagent with DAPI, nucelus detection |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen | A12379 | Dissolve 300 units in 1.5 ml methanol, detection of filamentous actin |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | Invitrogen | S33102 | Visualization of RNA |
| Negative Control siRNA | Qiagen | 1022076 | Control siRNA |
| AllStars Neg. siRNA AF 555 | Qiagen | 1027294 | Fluorescent control siRNA |
| Cell scraper | Celltreat | 229310 | |
| BioLite Multidishes and Microwell Plates | Thermo Scientific | 130184 | 6-well plate |
| Pierce LDS Sample Loading Buffer (4x) | Thermo Scientific | 84788 | Sample loading buffer for Western blot |
| Pierce BCS Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | Protein quantification assay |
| Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktails (100x) | Thermo Scientific | 78430 | Protease inhibitor cocktail, use at 1x |
| M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent | Thermo Scientific | 78501 | Protein extraction reagent |
| Sorvall Legend Micro 21R | Thermo Scientific | 75002440 | Centrifuge |
| Beta Actin Antibody | Thermo Scientific | MA1-91399 | β-actin primary antibody (from mouse) for western blot |
| 6x TriTrack DNA Loading Dye | Thermo Scientific | R1161 | DNA loading dye |
| Nuclease-Free Water | Life Technologies | AM9938 | |
| Non-Fat Dry Milk | Lab Scientific | M0841 | For Western blot |
| 2-well BD Falcon culture slides | BD Biosciences | 354102 | 2-well culture slides |
| Amersham ECL Western blot detection reagent | GE Healthcare Life Sciences | RPN2106 | Western blot detection reagent |
| BA Membranes | GE Healthcare Life Sciences | 10402096 | Nitrocellulose membrane for Wester blot |
| ATM (D2E2) Rabbit mAb | Cell Signaling | 2873S | ATM primary antibody (from rabbit) for Western blot |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7074 | Secondary antibody (anti-rabbit) for Western blot |
| Folded capillary cells | Malvern | DTS 1061 | For zeta potentail measurements using Zetasizer Nano ZS |
| MDA-MB-231 cell line | ATCC | HTB-26 | Mammary Gland/Breast |
| 12% Mini-PROTEAN TGX Gel | Bio-rad | 456-1043 | For Western blot |
| Biorad PowerPac HC | Bio-rad | 164-5052 | Power supply for electrophoresis |
| 10x Tris/Glycine/SDS Buffer | Bio-rad | 161-0732 | Running buffer for Western blot |
| Wide Mini-Sub Cell GT Cell | Bio-rad | 170-4405 | Electrophoresis equipment for DNA agarose gel |
| Mini-PROTEAN Tetra cell | Bio-rad | 165-8000 | Electrophoresis equipment for Western blot |
| ChemiDoc XRS+ System with Image Lab Software | Bio-rad | 170-8265 | Image acquisition and analysis software for gels and blots |
| 4" (10 cm) dia., 5 x 7 mm diced Silicon Wafer | Ted Pella | 16007 | Silicon waferfor scanning electron microscopy and atomic force microscopy |
| Thermomixer R | Eppendorf | 22670107 | Shaker |
| Isoton II diluent | Beckman Coulter | 8546719 | Isoton diluent |
| Multisizer 4 Coulter Counter | Beckman Coulter | A63076 | Particle counting analyzer |
| Non-functionalized porous silicon particles | Microelectronics Research Center, University of Texas at Austin | Dicoidal shape. 2.6 μm (diameter) x 0.7 μm (height), provided in isopropyl alcohol | |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | Particle analyzer system for size and zeta potential | |
| Scanning Electron Microscope | FEI | Particle size and shape | |
| Atomic Force Microscope | Bruker | Particle size and shape | |
| Fluo ViewTM 1000 Confocal Microscope | Olympus | Visualization of fixed and live cells |
References
- De Fougerolles, A., Vornlocher, H. P., Maraganore, J., Lieberman, J. Interfering with disease: a progress report on siRNA-based therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 6 (6), 443-453 (2007).
- Rolland, A.
- Oh, Y. K., Park, T. G. siRNA delivery systems for cancer treatment. Adv Drug Deliv Rev. 61 (10), 850-862 (2009).
- Mintzer, M. A., Simanek, E. E. Nonviral vectors for gene delivery. Chem Rev. 109 (2), 259-302 (2009).
- Whitehead, K. A., Langer, R., Anderson, D. G. Knocking down barriers: advances in siRNA delivery. Nat Rev Drug Discov. 8 (2), 129-138 (2009).
- Decuzzi, P., et al. Size and shape effects in the biodistribution of intravascularly injected particles. J Control Release. 141 (3), 320-327 (2010).
- Decuzzi, P., Ferrari, M. Design maps for nanoparticles targeting the diseased microvasculature. Biomaterials. 29 (3), 377-384 (2008).
- Martinez, J. O., Evangelopoulos, M., Chiappini, C., Liu, X., Ferrari, M., Tasciotti, E. Degradation and biocompatibility of multistage nanovectors in physiological systems. J Biomed Mater Res A. 102 (10), 3540-3549 (2014).
- Shen, H., et al. Enhancing chemotherapy response with sustained EphA2 silencing using multistage vector delivery. Clin Cancer Res. 19 (7), 1806-1815 (2013).
- Xu, R., et al. Multistage vectored siRNA targeting ataxia-telangiectasia mutated for breast cancer therapy. Small. 9 (9-10), 1799-1808 Forthcoming.
- Shen, J., et al. High capacity nanoporous silicon carrier for systemic delivery of gene silencing therapeutics. ACS Nano. 7 (11), 9867-9880 (2013).
- Zhang, M., et al. Polycation-functionalized nanoporous silicon particles for gene silencing on breast cancer cells. Biomaterials. 35 (1), 423-431 (2014).
- Ozpolat, B., Sood, A. K., Lopez-Berestein, G. Nanomedicine based approaches for the delivery of siRNA in cancer. J Intern Med. 267 (1), 44-53 (2010).
- Philipp, A., Dehshahri, A., Wagner, A., E, Simple modifications of branched PEI lead to highly efficient siRNA carriers with low toxicity. Bioconjug Chem. 19 (7), 1448-1455 (2008).
- Hunter, A. C. Molecular hurdles in polyfectin design and mechanistic background to polycation induced cytotoxicity. Adv Drug Deliv Rev. 58 (14), 1523-1531 (2006).
- Andrews, P. M., Bates, S. B. Dose-dependent movement of cationic molecules across the glomerular wall. Anat Rec. 212 (3), 223-231 (1985).
- Ananta, J. S., et al. Geometrical confinement of gadolinium-based contrast agents in nanoporous particles enhances T1 contrast. Nat Nanotechnol. 5 (11), 815-821 (2010).
