Summary
Lieferung bleibt die größte Herausforderung für die therapeutische Anwendung der small interfering RNA (siRNA). Dieses Protokoll schließt die Verwendung eines multifunktionellen und biokompatibel siRNA Abgabeplattform, bestehend aus Arginin und Polyethylenimin gepfropft porösen Siliciummikropartikel.
Introduction
Small interfering RNAs (siRNAs) sind doppelsträngige RNA-Moleküle, die die Expression von Genen unterdrücken kann. In den letzten Jahren haben siRNAs als eine neue Generation von biodrugs die therapeutisches Potential für die zukünftige Verwendung in klinischen Anwendungen 1-5 zeigen entwickelt. Die erfolgreiche Umsetzung der siRNA-Therapie bleibt jedoch eine große Herausforderung, durch Abbau durch Nukleasen, schlechte intrazelluläre Aufnahme, geringe Transfektionseffizienz und ineffizient Freisetzung aus dem Endosom / Lysosom 5. Viele dieser Hindernisse können durch die Entwicklung der Delivery-Plattformen, die sicher und effizient liefern kann siRNA auf erkranktes Gewebe zu überwinden. Im Vergleich zu Virusträgern nicht viralen Plattformen bieten mehrere Vorteile, wie Sicherheit, geringe Kosten und Einfachheit des Zuschneidens. Insbesondere kationischen Nanopartikeln, wie Polymere und Lipide, haben sich als nützlich für die siRNA-3 bewiesen.
Bisher haben wir eine scheibenförmige dr entwickeltug Liefersystem, der sogenannten mehrstufigen Vektor (MSV). Diese Plattform ist an aufeinanderfolgenden Stufen, in denen ein Fahrzeug, das von einem anderen veröffentlicht basiert. Die erste Stufe Fahrzeug ein Mikroteilchen aus biologisch abbaubaren porösen Silicium (psi) hergestellt, während die Fahrzeuge zweiten Stufe sind Nanopartikel mit Arzneimitteln oder Kontrastmittel 6,7 geladen. Die Nanopartikel, die im PSI Material eingebettet sind, werden nach und nach freigesetzt, wie die Si verschlechtert 8. Ein Vorteil der Verwendung von Si-Partikel ist, dass die Morphologie und Oberflächeneigenschaften können leicht angepasst, um eine optimale biologische Verteilung und Wirkstofffreisetzung erreicht werden. Kürzlich wurde die erfolgreiche Anwendung des MSV-Plattform für die Bereitstellung von siRNA Liposomen an Tumorgewebe in einer Eierstock- und Brustkrebs Mausmodell 9, 10 gezeigt.
In dieser Arbeit haben wir einen universellen Träger für siRNA, basierend auf den Prinzipien der MSV Plattform hergestellt. Die Wirksamkeit dieses Verabreichungssystem hat uns früher gezeigting unterschiedlichen siRNA-Moleküle 11. Das System ist ein Polykation-funktionalisierten porösen Silizium (PCPS) Träger, bestehend aus pSi mit Polyethylenimin (PEI) und Arginin (Arg) gepfropft. PEI kann bei der Bildung elektrostatische Wechselwirkungen mit siRNA unterstützen, während Arg und pSi kann dazu dienen, um die Toxizität von PEI zu reduzieren, wie zuvor demonstarted 11. Darüber hinaus kann die Anwesenheit von PEI in die intrazelluläre Aufnahme und endosomalen Flucht zu unterstützen, während die PSI-Mikropartikel ermöglichen siRNA Schutz und anhaltende Freisetzung. Die PSI-Partikel nach und nach unter physiologischen Bedingungen abgebaut werden, was zu der Bildung von Arg-PEI / siRNA-Nanopartikel (Abbildung 1), die einen ausgeprägten Morphologie und einer engen Größenverteilung 11 zu haben. Für detaillierte Angaben zur Stabilität der PCPS / siRNA-System finden Sie in der Studie beziehen von Shen et al. 11. Diese PCPS Plattform unterscheidet sich von der herkömmlichen MSV, da die Stufe Nanopartikel zweiten anfänglich nicht present in dem Träger, sondern werden über die Zeit gebildet wird wie das erste-Stufe-Träger abbaut 11, 12. Die siRNA Beladungseffizienz, Zytotoxizität und Gen-Silencing-Effizienz der PCPS System wurde in vitro untersucht. Transfektionseffizienz wurde mit siRNA gegen das Ataxia telangiectasia mutiert (ATM) Onkogen, das in der DNA-Reparatur beteiligt 10 gemessen. Früher war die Unterdrückung der ATM ist gezeigt worden, das Tumorwachstum in einer Brustkrebsmodell 10 zu verringern.
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Protocol
1. PCPS Particle Vorbereitung
- Oxidieren nicht-funktionalisierten porösen Siliciumpartikel in einer 30% igen Wasserstoffperoxidlösung bei 95 ° C für 2 Std. Aminieren die oxidierten Teilchen in 2% (3-Aminopropyl) triethoxysilan-Lösung in Isopropylalkohol für 2 Tage bei 65 ° C unter leichtem Rühren.
- Zentrifugieren Sie die Lösung für 30 Minuten bei 18.800 xg und waschen Sie die Partikel zweimal in Isopropanol und dreimal in Ethanol, mit kurzen Ultraschallbehandlung, um das Pellet zu suspendieren. Lassen Sie die Partikel in Ethanol-Lösung bei der Durchführung von Schritt 1.3 und 1.4.
- Hinzufügen eines bekannten Volumens Teilchensuspension (beispielsweise 10 & mgr; l) auf 10 ml isotone Verdünnungsmittel und zählt die Teilchen mit einem Analysator Partikelzählung, um die Konzentration der Teilchen in der Stammlösung zu bestimmen.
- Aktivieren der Säuregruppe von L-Arginin (0,1 nmol) mit N - (3-dimethylaminopropyl) - N '-ethylcarbodiimide Hydrochlorid (EDC, 0,1 nmol) / N
- Kurz beschallen die Partikelstammlösung und fügen eine Milliarde Teilchen an der L-Arginin-Lösung und lassen Sie die Reaktion für 18 Stunden bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren.
- Aktiviere die erste Asparaginsäure Gruppe N - (tert-Butoxycarbonyl) -L-asparaginsäure (Boc-Asp-OH, 1 nmol) mit EDC (0,1 nmol) / NHS (0,1 nmol) in 20 ml Ethanol 4 Stunden bei 4 ° C unter leichtem Rühren.
- Man löst 50 mg Polyethylenimin in 10 ml Ethanol und Hinzufügen der Lösung zu der Boc-Asp-OH-Mischung. Lassen Sie die Reaktion ablaufen zu 24 Stunden bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren.
- Aktivieren des zweiten Asparaginsäure Gruppe der Boc-Asp-OH / PEI-Lösung mit EDC (0,1 nmol) / NHS (0,1 nmol) bei 4 ° C für 6 h unter leichtem Rühren.
- Um PCPS Partikel zu erhalten, fügen Sie die Partikellösung aus Schritt 1.5 in die Boc-Asp-OH / PEI-Lösung aus Schritt 1.8. Die Reaktion kann für 18 Stunden bei Raumtemperatur unter leichtem st fortzufahren Irring.
- Zentrifugieren Sie die Lösung für 30 Minuten bei 18.800 xg und waschen die Partikellösung dreimal mit Ethanol, mit kurzen Ultraschallbehandlung, um das Pellet zu suspendieren.
2. PCPS Partikelcharakterisierung
- Messung der Größe der Teilchen unter Verwendung eines Rasterelektronenmikroskops (SEM).
- Geben Sie einen Tropfen Partikelsuspension (10.000 Partikel / & mgr; l in Ethanol) auf eine saubere Kieselsäure SEM Proben Stub und unter Vakuum bei Raumtemperatur trocken lassen.
- Messen Sie REM-Aufnahmen bei 8 kV mit einer 3-5 mm Arbeitsabstand mit Hilfe eines in-lens-Detektor.
- Messung des Zetapotentials der Teilchen mit einer Partikelanalysesystem.
- Mix 10 ul Partikelsuspension (10.000 Teilchen / & mgr; l in Ethanol) mit 1 ml 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,4).
- Laden Sie die Probe in gefalteten Kapillarzellen und messen Sie die Zetapotential nach den Anweisungen des Herstellers.
- Trocknen Sie die PCPS Partikel (aus PCPS Partikelvorbereitungsschritt 1.9) unter Vakuum O / N.
- Fügen siRNA (4 ug) in Nuklease-freies Wasser (20 ul) zu den getrockneten PCPS Partikeln und kurz sonifizieren. Verwenden Sie die folgende Partikel siRNA Verhältnisse: 2 x 10 5 Partikel / 0,2 ug siRNA, 4 x 10 5 Partikel / 0,2 ug siRNA, 6 x 10 5 Partikel / 0,2 ug siRNA, 8 x 10 5 Partikel / 0,2 ug siRNA, 10 × 10 5 Teilchen / 0,2 ug siRNA und 12 × 10 5 Teilchen / 0,2 ug siRNA.
- Inkubieren für 3 Stunden bei 4 ° C auf einem Schüttler (1.000 rpm) siRNA Bindung an die Teilchen zu ermöglichen.
4. Optimierung der siRNA / PCPS Partikel-Verhältnis
- Fügen DNA Loading Dye zu 20 ul der PCPS / Kontroll-siRNA-Partikel mit unterschiedlichen Partikel siRNA Verhältnisse (siehe Laden von siRNA in PCPS Teilchen).
- Laden Sie das samsätze in ein 2% Agarosegel, das DNA-Gel-Färbung.
- Führen der Elektrophorese bei einer konstanten Spannung von 120 V für 20 min in Laufpuffer.
- Analysieren Sie das Gel mit der Bildaufnahme und Analyse-Software.
5. Freisetzung von siRNA PCPS Partikel
- Mischen Sie 20 ul der PCPS / Kontroll-siRNA-Partikel mit unterschiedlichen Partikel siRNA Verhältnisse (siehe Schritt 3) in Natriumdodecylsulfat (SDS, 2%) und stehen lassen für 1 h bei RT.
- Hinzufügen DNA Ladefarbstoff zu den Proben.
- Belastungsproben werden in ein 2% Agarosegel, das DNA-Gelfärbung.
- Führen der Elektrophorese bei einer konstanten Spannung von 120 V für 20 min in Laufpuffer unter Verwendung von DNA-Apparatur und eine Stromversorgung.
- Analysieren Sie das Gel mit der Bildaufnahme und Analyse-Software.
6. konfokale Mikroskopie von PCPS Partikel
- In 5 ul PCPS / fluoreszierende Kontroll-siRNA-Partikel (10 x 10 5 Partikel / 0.2 ug siRNA / 20 ul) auf einem Deckglas.
- Visualisieren Partikelschichten durch konfokale Mikroskopie.
7. Charakterisierung von Arg-PEI / Kontroll-siRNA-Nanopartikel
- Um die Silizium-Material abgebaut wird und Arg-PEI / Kontroll-siRNA-Nanopartikel, fügen PCPS / siRNA-Partikel (10 × 10 6 Teilchen PCPS / 2 ug siRNA) zu 100 ul phosphatgepufferter Kochsalzlösung und Schütteln (1000 UpM) bei 37 ° C 2 Tagen.
- Zentrifugieren Sie die Probe für 30 min bei 18.800 xg und sammeln Sie den Überstand.
- Messen Sie die Größe der gebildeten Arg-PEI / siRNA-Nanopartikel mit der dynamischen Lichtstreuung (DLS).
- Nimm 10 & mgr; l des Überstandes mit 1 ml 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,4) und in einen Plastik Küvette.
- Messung der Größe der Partikel mit einer Partikelanalysesystem nach den Anweisungen des Herstellers.
- Bestimmen Sie die Größe und die Morphologie des gebildeten Arg / PEI-siRNANanopartikel mit Rasterkraftmikroskopie.
- Nimm 10 & mgr; l des Überstands und auf ein Siliziumwafer ist.
- Visualisieren Sie die Partikel mit Rasterkraftmikroskopie (AFM).
8. Zellkultur
- Kultur MDA-MB-231-Brustkrebszellen in Zellkulturmedium mit 10% fötalem Rinderserum und 1% Penicillin-Streptomycin bei 5% CO 2, 95% Luftfeuchtigkeit und 37 ° C ergänzt.
9. konfokale Mikroskopie von lebenden Zellen mit PCPS Partikel
- Platten Zellen in 2-Well-Kultur gleitet bei einer Aussaatdichte von 3 x 10 5 Zellen / Vertiefung für 24 h.
- Fügen PCPS Partikel mit fluoreszierenden Kontroll-siRNA (10 x 10 5 Partikel / 0,2 ug Teilchens siRNA-Verhältnis, 50 nM siRNA) zu den Zellen geladen.
- Eine Videoaufnahme der Zellen mit einem konfokalen Mikroskop 12 h (mit einer Kammer, 5% CO 2, 95% Luftfeuchtigkeit und 37 ° C zugeführt wird) folgende Korn Exposicher.
10. konfokale Mikroskopie der fixierten Zellen mit PCPS Partikel
- Platten Zellen in 2-Well-Kultur gleitet bei einer Aussaatdichte von 3 x 10 5 Zellen / Vertiefung für 24 h.
- Fügen PCPS Partikel mit fluoreszierenden Kontroll-siRNA (10 x 10 5 Partikel / 0,2 ug Teilchens siRNA-Verhältnis, 50 nM siRNA) geladen, um Zellen und Inkubation für 1 Tag, 7 Tage und 10 Tage.
- Waschen Sie die Zellen zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung und dann befestigen Sie sie mit 4% Paraformaldehydlösung für 10 min.
- Mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung waschen der Zellen.
- Permeabilisierung der Zellen mit 0,1% Octylphenolethoxylat für 10 min und dann wasche sie dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung.
- Blockieren der Zellen mit Albumin aus Rinderserum (10 mg / ml) in phosphatgepufferter Salzlösung für 10 min bei RT unter leichtem Rühren.
- Um filamentösen Aktin visualisieren, Inkubation der Zellen mit fluoreszenzmarkierten Phalloidin (1 ul / 40 & mgr;Blockierungslösung) für 20 min bei RT unter leichtem Rühren und dann in phosphatgepufferter Salzlösung zu waschen.
- Entfernen Sie die Folien aus dem Rahmen, und fügen Antifade Reagenz mit 4 ', 6-Diamino-2-phenylindol (DAPI), um den Kern zu visualisieren.
- Fügen Sie ein Deckglas oben und nehmen Bilder der Zellen mit der konfokalen Mikroskopie.
11. Durchflusszytometrie von Zellen mit PCPS / Fluoreszenzkontrolle siRNA Partikel
- Platten Zellen in einer 6-Well-Platte bei einer Aussaatdichte von 3 x 10 5 Zellen / Vertiefung für 24 h.
- Fügen PCPS Partikel mit fluoreszierenden Kontroll-siRNA (10 x 10 5 Partikel / 0,2 ug Teilchens siRNA-Verhältnis, 50 nM siRNA) in die Zellen geladen und Inkubation für 24 Stunden.
- Waschen der Zellen mit phosphatgepufferter Salzlösung und kratzen, mit einem Zellschaber.
- Lagern Sie die Zellen in phosphatgepufferter Salzlösung mit 2% fötalem Rinderserum vor der Analyse. Verwenden unbehandelten Zellen als Negativkontrolle.
- Führen Fluss cytrie.
12. Zelllebensfähigkeit von Zellen mit PCPS Partikel und PCPS / Kontroll-siRNA Partikel
- Platten Zellen in einer Platte mit 96 Vertiefungen bei einer Zelldichte von 3 × 10 3 Zellen / Vertiefung für 24 h.
- Behandlung der Zellen mit PCPS-Teilchen (1,5 × 10 5 / Vertiefung und 6 × 10 5 / Vertiefung) oder PCPS / Steuer siRNA Partikel (10 × 10 5 Teilchen / 0,2 ug Teilchens siRNA-Verhältnis, 10 nM und 100 nM siRNA) 48 h und 72 h. Verwenden unbehandelten Zellen und Zellen mit phosphatgepufferter Salzlösung (das gleiche Volumen wie die hinzugefügten Teilchen) als Kontrolle behandelt. Assay jede Probe in dreifacher Ausfertigung.
- Durchführen einer Zellproliferations-Assay gemß den Herstelleranweisungen.
- Repräsentieren Daten als Mittelwert ± Standardabweichung.
13. Western Blot von Zellen mit PCPS / ATM Mutierte siRNA Partikel
- Platten Zellen in einer Platte mit 6 Vertiefungen bei einer Zelldichte 2 × 10 5 Zellen / well für 24 Stunden.
- Inkubieren der Zellen mit PCPS / Kontroll-siRNA (50 nM) Teilchen oder PCPS / ATM siRNA (50 nM) Teilchen für 72 Stunden. Verwenden Sie unbehandelten Zellen als Kontrolle.
- Lyse der Zellen unter Verwendung einer Protein-Extraktionsreagenz mit einem Protease-Inhibitor-Cocktail ergänzt.
- Zentrifugieren Zelllysate für 10 min bei 14.000 × g und Gewinnen des Überstandes.
- Bestimmung der Proteinkonzentration mit einem Proteinquantifizierungsassay gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Hinzufügen Probenbeladungspuffer (5 & mgr; l 2-Mercaptoethanol / ml Puffer) zu den Proben und erhitzen sie für 6 min bei 99 ° C.
- Laden die Proteinproben (20 ug / ul) in einer 12% SDS-Polyacrylamid-Gel mit Laufpuffer und führen Polyacrylamidgelelektrophorese (1 h, 120 V) unter Verwendung von Elektrophorese Ausrüstung und eine Stromversorgung.
- Übertragen des Gels in Transferpuffer (mit 20% Methanol) auf eine Nitrocellulosemembran (1 h, 100 V) unter Verwendung von Elektrophorese Ausrüstung undein Netzteil.
- Blockieren Sie die Membran mit 5% Trockenmilch für 1 Stunde.
- Inkubieren der Membran mit der ATM-Primär-Antikörpers (aus Kaninchen) in Blocking-Lösung (aus Stufe 13.9) bei einer 1: 1.000-Verdünnung O / N.
- Waschen der Membran mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung, die 0,1% Polyethylenglykol-Sorbitan-Monolaurat und dann inkubiert mit dem sekundären Antikörper (anti-Kaninchen) in Blocking-Lösung (aus Stufe 13.9) bei einer 1: 2.500-Verdünnung für 1 Stunde.
- Waschen der Membran mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung, die 0,1% Polyethylenglykol-Sorbitan-Monolaurat und detektieren die Proteinbanden mit Western-Blot-Nachweis-Reagens unter Verwendung von Bilderfassung und -analyse-Software.
- Für die Ladesteuerung, Waschen der Membran und die Schritte 13,9-13,12 Verwendung eines β-Actin primären Antikörper (von der Maus, 1: 10.000-Verdünnung) und einem Sekundärantikörper (anti-Maus-1: 4.000-Verdünnung).
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Representative Results
Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung eines nicht-viralen Zufuhrsystem für einen sicheren und effizienten siRNA-Transfektion. Die SEM-Ergebnisse zeigen, dass die PCPS Teilchen eine zylindrische Form und haben einen Durchmesser von 2,6 & mgr; m (2A). Die Partikel sind positiv mit einem Zetapotential von ungefähr 8,21 (2B) geladen, wodurch elektrostatische Bindung mit negativ geladenen Nukleotiden. Konfokale Bilder von verschiedenen Schichten der PCPS Teilchen zeigen, daß fluoreszierende Steuer siRNA wird innerhalb der porösen Siliciumpartikeln (2C) geladen. Die Bildung und Freisetzung von Arg-PEI / siRNA-Nanopartikel aus der PSI-Partikel wurde mit DLS und AFM bestätigt. Die Größenverteilung der Teilchen betrug 70 bis 120 nm, mit einer mittleren Größe von 94 nm (Figur 2D). AFM-Bilder zeigen, dass die Nanopartikel eine Kugelform (Figur 2E).
Die ratio von Partikeln siRNA wurde mittels Agarosegelelektrophorese optimiert, um eine hohe Bindungsaffinität (3A) zu gewährleisten. Ein breiter Bereich von Partikelgrßen zu siRNA Verhältnisse verwendet wurde (2 x 10 5, 4 × 10 5, 6 × 10 5, 8 × 10 5, 10 × 10 5 und 12 x 10 5 /0.2 ug siRNA). Die Ergebnisse zeigen, dass siRNA dicht an die Teilchen zu binden, wenn die Partikelmenge über 8 x 10 5 ist. Ein Verhältnis von 10 × 10 5 PCPS / 0,2 ug siRNA wurde für weitere Experimente ausgewählt. Weiterhin wurde siRNA erfolgreich von dem Träger freigesetzt, wenn es mit SDS behandelt, wie in 3B dargestellt.
Als nächstes wurde der Keller Internalisierung PCPS / fluoreszierende Steuer siRNA Partikel in MDA-MB-231-Zellen untersucht. Konfokale Bilder nach 24 Stunden der Behandlung zeigen, dass die Partikel effektiv in Zellen aufgenommen (Figur 4 getroffen Figur 5 zeigt, dass 89% der Zellen PCPS / siRNA Partikel nach 24 h Inkubation internalisiert. Darüber hinaus wurde die Internalisierung Prozess für 12 h (Video 1) aufgezeichnet. Diese Ergebnisse zeigen, dass die PCPS Teilchen effizient liefern siRNA in Zellen. Die langfristigen Ansammlung von siRNA in den Zellen wurde durch konfokale Mikroskopie untersucht. Am Tag 7 und am Tag 10 war die siRNA noch im Inneren der Zellen (6) detektierbar ist.
Einer der wichtigsten Faktoren, die bei der Entwicklung eines siRNA-Abgabesystem ist die Sicherheit des Trägers 13. PEI ist bekannt, dass Polyplexe mit siRNA, Hilfe bei der zellulären Aufnahme und Trigger-Freisetzung aus dem Endosom / Lysosom zu bilden. Jedoch kann PEI toxischen Wirkungen aufgrund der Anwesenheit von positiv geladenen primären Aminogruppen in der Hauptkette 14,15. Zum Beispiel PEI-Bindung an die Glykocalix auf der Zelloberfläche in der fo führenrmationen großer Cluster 16. Um diese Ladung induzierte Toxizität eliminieren, PEI wurde kovalent konjugiert durch eine Brücke Linkers Arginin, um die Anzahl von primären Aminogruppen zu reduzieren. Die Lebensfähigkeit der Zellen über 95% nach 48 h und 72 h, wenn Teilchen und siRNA in einer Konzentration von bis zu 6 x 10 5 / Vertiefung und 100 nM (Figur 7A) verwendet. Als nächstes wurde die Transfektionseffizienz von siRNA gegen das Onkogen ATM in MDA-MB-231-Zellen untersucht. Western-Blot-Ergebnisse zeigen, dass die Proteinspiegel von ATM werden nach der Behandlung mit PCPS / ATM siRNA (7B) verringert. Die Ergebnisse deuten darauf hin, die PCPS Plattform ist ein sicheres und effizientes Abgabesystem für siRNA.
Abbildung 1. Schematische Darstellung der Polykation-funktionalisierten porösen Silizium (PCPS) Partikel. strong> Arginin (Arg) -polyethylenimine (PEI) / small interfering RNA (siRNA) Nanopartikel nach dem Abbau von Silizium (Si) gebildet.
Abbildung 2. Charakterisierung PCPS Teilchen. (A) Die Rasterelektronenmikroskopie (SEM) -Bild von PCPS Teilchen. (B) Das Zeta-Potential der Teilchen PCPS. (C) Die konfokale Bilder der verschiedenen Schichten der PCPS / fluoreszierende Kontroll-siRNA-Partikel. (D) die Größenverteilung der Arginin Arg-PEI / Kontroll-siRNA-Nanopartikel aus der porösen Siliciummikropartikel freigesetzt. (E) Rasterkraftmikroskopie (AFM) Bilder von Arg-PEI / Kontroll-siRNA-Nanopartikel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 3. Agarose Gel zur Optimierung der PCPS / siRNA-Abgabesystem. (A) Die Bindungsaffinität zwischen PCPS Teilchen und Kontroll-siRNA. Die Banden repräsentieren ungebundenen siRNA. (B) siRNA Mitteilung nach Inkubation mit 2% SDS für 1 Stunde. Die Bands, die den Gesamt siRNA (ungebundene und gebundene). Beispiel 1: siRNA; Beispiel 2: 2 x 10 5 PCPS Partikel / 0,2 ug siRNA; Probe 3: 4 × 10 5 Teilchen PCPS / 0,2 ug siRNA; Probe 4: 6 x 10 5 PCPS Partikel / 0,2 ug siRNA; Beispiel 5: 8 x 10 5 PCPS Partikel / 0,2 ug siRNA; Probe 6: 10 × 10 5 Teilchen PCPS / 0,2 ug siRNA; Probe 7: 12 × 10 5 Teilchen PCPS / 0,2 ug siRNA.
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Abbildung 4. Konfokalmikroskop Bilder PCPS / fluoreszierende siRNA Partikel (rot) in MDA-MB-231-Zellen (24 h Inkubation). Der Kern und filamentöse Aktin wurde mit 4 sichtbar gemacht ", 6-Diamino-2-phenylindol (DAPI, blau ) und Phalloidin (grün) auf. Drei verschiedene Schichten abgebildet wird (oben, Mitte und basal). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 5. Quantitative Durchflusszytometrieanalyse fluoreszierender MDA-MB-231-Zellen nach Inkubation mit PCPS / Steuerfluoreszenz siRNA Teilchen. Unbehandelte Zellen wurden als negative Kontrolle verwendet. 89% der Zellen waren die Partikel internalisiert.
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Abbildung 6. Die konfokale Bilder von fluoreszierenden Kontroll-siRNA (rot) in MDA-MB-231-Zellen. Die Zellen wurden mit PCPS / fluoreszierende Kontroll-siRNA-Partikel für 1 Tag, 7 Tage und 10 Tage inkubiert. Zellen wurden dann mit konfokaler Mikroskopie visualisiert. Der Kern und filamentöse Aktin wurde mit 4 ', 6-Diamino-2-phenylindol (DAPI, blau) und Phalloidin (grün) sichtbar sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Figur 7. Die Lebensfähigkeit der Zellen und das Gen-Silencing in vitro. (A) Eine Zelllebensfähigkeitstest von Zellen mit PCPS Teilchen und PCPS / Steuer siRNA Teilchen (Scr) inkubiert. Das Experiment wurde in Reise durchgeführtsilicat und die Ergebnisse sind als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Unbehandelte Zellen (Blindwert) und die Zellen mit PBS inkubiert wurden als Kontrollen verwendet. (B) Western-Blot von PCPS / Ataxie Teleangiektasie mutiert (ATM) siRNA Partikel. Die Zellen wurden bis PCPS / Kontroll-siRNA (SCR) Partikeln und PCPS / ATM siRNA Partikeln ausgesetzt. Unbehandelte Zellen (mock) wurden als eine Kontrolle verwendet. β-Actin wurde als Ladekontrolle verwendet.
Video 1 . zeitabhängige Aufnahme von PCPS / Fluoreszenz Steuer siRNA Teilchen in lebenden MDA-MB-231-Zellen. Das Video wurde 12 Stunden nach Aussetzen der Zellen, Partikel erfasst.
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Discussion
Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur erfolgreichen und Transfektion von siRNA in Zellen. Insbesondere ist die Verabreichung von siRNA durch Verwendung eines multifunktionellen Plattform, bestehend aus Polykation-funktionalisierten pSi Partikel erreicht. Die Verwendung von siRNA-Therapie hat ein großes Potenzial, zum Beispiel Krebsbehandlung, da verschiedene Onkogene können mit hoher Spezifität ausgerichtet sein. Daher besteht ein Bedarf an siRNA Lieferfahrzeugen zu entwickeln, die die Herausforderungen siRNA Therapie bestehen kann. Zusammenfassend haben wir ein Protokoll, das Versprechen für die sichere und effiziente Erbringung von siRNA zeigt skizziert. Es gibt jedoch einige wichtige Faktoren, die bei der Ausführung der beschriebenen Technik genommen werden sollte. Beispielsweise ist eine wichtige Überlegung bei der Herstellung der Teilchen PCPS die siRNA sorgfältig behandeln, um den Abbau durch Nukleasen zu vermeiden. Insbesondere sauberen Handschuhen und RNAse freie Rohre und Wasser sollte jederzeit bei der Arbeit mit verwendet werdensiRNA. Wenn die siRNA-Transfektion Wirksamkeit gering ist, kann ein Spray, das RNase Kontamination beseitigt zum Handschuhen und Arbeitsbereiche zu sprühen. Darüber hinaus, wenn die Transfektion nicht erfolgreich ist, die siRNA sollte mit einem kommerziellen Transfektionsreagens getestet werden, um zu bestimmen, ob das Problem durch die siRNA oder Teilchen verursacht. Ein weiterer kritischer Rücksicht auf die erfolgreiche Umsetzung des PCPS / siRNA-System ist darauf zu achten, bei der Durchführung der Zentrifugation und Waschschritte. Sollte nämlich der Überstand vollständig verworfen werden, um überschüssige Reagenzien, die in den Partikelherstellungsschritte erforderlich sind, zu entfernen.
Ein wichtiger Vorteil der PCPS / siRNA-Abgabesystem ist die Sicherheit. Mehrere siRNA Transfektionsagenzien eine hohe kationische Ladung, die zu Zelltoxizität 13,15 beiträgt. Tatsächlich sind die meisten kommerziellen Protokolle anzugeben, dass die Reagenzien mit den Zellen nur ein paar Stunden lang inkubiert werden, um den Zelltod zu verhindern. Vielmehr cells an die PCPS Partikel mehrere Tage ausgesetzt werden, ohne irgendwelche Anzeichen von Toxizität, wie aus der Zelllebensfähigkeit ergibt. Die PCPS Partikel siRNA mit hoher Affinität aufgrund der Anwesenheit von PEI zu binden. Allerdings ist die ladungsinduzierte Toxizität von PEI wird durch die einzigartige Einrichtung des Delivery-Plattform verhindert. Besonders die kovalente Bindung des Arg zu PEI und die Verkapselung von PEI in der Si Poren tragen zur Reduzierung der Toxizität. Ein weiterer Vorteil der PCPS Plattform ist, dass siRNA-Transfektion in Gegenwart von Serum erfolgen. Andere bestehende Verfahren erfordern üblicherweise die Verwendung von serumfreien Zellkulturmedien, wodurch zusätzliche Schritte Transfektionsprozess und potentiell stören regelmäßigen Zellsignalwege.
Ein zusätzlicher Vorteil der PCPS System ist, dass es keine Änderung der siRNA-Moleküle erforderlich. Während einige aktuelle Methoden erfordern komplizierte Konjugation Schritte, um die siRNA zu stabilisieren oder c aktivierenzellulären Internalisierung 13 stützt sich das System auf PCPS einfaches Mischen für siRNA Belastung. Die Bindung an PEI und die Poren in dem Si-Material eine schützende Umgebung für die siRNA, wodurch ein Kontakt mit Nukleasen reduzieren. Die PCPS Teilchen können für längere Zeiträume als getrocknetes Material oder in Isopropylalkohol gespeichert. Außerdem, wenn die PCPS / siRNA Partikel lyophilisiert werden, können sie für mindestens drei Monate bei 4 ° C gelagert werden. Die lyophilisierten PCPS Teilchen sollten in RNase-freiem Wasser unmittelbar vor der Transfektion ausgesetzt werden, und sollte nicht in Lösung gelagert werden. Schließlich erlitten die PCPS Plattform ermöglicht Freisetzung von siRNA, wie zuvor berichtet 11, demzufolge eine Erhöhung der Zeitspanne, in der Zielgene bleiben drückt. Dementsprechend wird, nachdem zelluläre Internalisierung, die Si-Partikel allmählich verschlechtern, was zu der Bildung von Arg-PEI / siRNA-Nanopartikel. Anschließend wird die siRNA langsam in das Cytoplasma, wo sie binden an Messe freinger RNA (mRNA), wodurch die biologische Aktivität ausübt. Obwohl PCPS Partikel bieten mehrere Vorteile im Vergleich zu bestehenden Verfahren zur siRNA, eine Einschränkung der Technik ist, dass nicht-funktionalisierten pSi Mikroteilchen werden als Ausgangsmaterial erforderlich. Während sich die Partikel unter Verwendung der Photolithographie und elektrochemisches Ätzen 17 synthetisiert werden, sind diese Techniken nicht zu allen Einrichtungen zur Verfügung stehen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polyethylenimine (PEI), branched | Sigma-Aldrich | 408727 | Average molecular weight ~25,000 Da |
| L-Arginine | Sigma-Aldrich | A5006 | Reagent grade, ≥98% |
| Boc-Asp-OH | Sigma-Aldrich | 408-468 | 99% |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763 | 30 wt. % in H2O |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 339741 | 100.00% |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907 | ≥99.7% |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 459844 | ≥99.5% |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) | Sigma-Aldrich | 03449 | ≥99% |
| Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A7030-10G | Blocking agent |
| Ataxia-telangiectasia mutated siRNA | Sigma-Aldrich | Designed in-house | |
| Tris Acetate-EDTA buffer | Sigma-Aldrich | T9650 | For DNA agarose gel electrophoresis |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | Polyethylene glycol sorbitan monolaurate |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250 | For Western blot |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 71496 | For making phosphate buffer |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 71640 | For making phosphate buffer |
| Anti-Mouse IgG | Sigma-Aldrich | A4416 | Secondary antibody (anti-mouse) for Western blot |
| N-Hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 130672 | 98% |
| CELLSTAR 96W Microplate Tissue Culture Treated Clear w/ Lid | Greiner Bio-One | 655182 | 96-well plate |
| 10x Tris-Glycine Liquid | Li-Cor | 928-40010 | Transfer buffer for Western blot |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | Santa Cruz | Sc-281692 | Fixation of cells |
| CellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (MTS) | Promega | G5421 | Proliferation assay |
| Phosphate buffered saline | Fisher Scientific | BP399-500 | 10x Solution |
| Corning cellgro Dulbecco's Modification of Eagle's (Mod.) | Fisher Scientific | MT-15-017-CM | Cell culture media, 1x solution |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | AC21568-2500 | Octyl phenol ethoxylate, permeabilization agent |
| Cover glass | Fisher Scientific | 12-530C | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-1 | For Western blot transfer buffer |
| Plastic Cuvettes | Fisher Scientific | 14-377-010 | For size measurements using Zetasizer Nano ZS |
| Molecular BioProducts RNase AWAY Surface Decontaminant | Fisher Scientific | 14-754-34 | Spray for removing RNAse contamination |
| Agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | Low melting point, for running RNA samples |
| ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | Antifade reagent with DAPI, nucelus detection |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen | A12379 | Dissolve 300 units in 1.5 ml methanol, detection of filamentous actin |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | Invitrogen | S33102 | Visualization of RNA |
| Negative Control siRNA | Qiagen | 1022076 | Control siRNA |
| AllStars Neg. siRNA AF 555 | Qiagen | 1027294 | Fluorescent control siRNA |
| Cell scraper | Celltreat | 229310 | |
| BioLite Multidishes and Microwell Plates | Thermo Scientific | 130184 | 6-well plate |
| Pierce LDS Sample Loading Buffer (4x) | Thermo Scientific | 84788 | Sample loading buffer for Western blot |
| Pierce BCS Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | Protein quantification assay |
| Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktails (100x) | Thermo Scientific | 78430 | Protease inhibitor cocktail, use at 1x |
| M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent | Thermo Scientific | 78501 | Protein extraction reagent |
| Sorvall Legend Micro 21R | Thermo Scientific | 75002440 | Centrifuge |
| Beta Actin Antibody | Thermo Scientific | MA1-91399 | β-actin primary antibody (from mouse) for western blot |
| 6x TriTrack DNA Loading Dye | Thermo Scientific | R1161 | DNA loading dye |
| Nuclease-Free Water | Life Technologies | AM9938 | |
| Non-Fat Dry Milk | Lab Scientific | M0841 | For Western blot |
| 2-well BD Falcon culture slides | BD Biosciences | 354102 | 2-well culture slides |
| Amersham ECL Western blot detection reagent | GE Healthcare Life Sciences | RPN2106 | Western blot detection reagent |
| BA Membranes | GE Healthcare Life Sciences | 10402096 | Nitrocellulose membrane for Wester blot |
| ATM (D2E2) Rabbit mAb | Cell Signaling | 2873S | ATM primary antibody (from rabbit) for Western blot |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7074 | Secondary antibody (anti-rabbit) for Western blot |
| Folded capillary cells | Malvern | DTS 1061 | For zeta potentail measurements using Zetasizer Nano ZS |
| MDA-MB-231 cell line | ATCC | HTB-26 | Mammary Gland/Breast |
| 12% Mini-PROTEAN TGX Gel | Bio-rad | 456-1043 | For Western blot |
| Biorad PowerPac HC | Bio-rad | 164-5052 | Power supply for electrophoresis |
| 10x Tris/Glycine/SDS Buffer | Bio-rad | 161-0732 | Running buffer for Western blot |
| Wide Mini-Sub Cell GT Cell | Bio-rad | 170-4405 | Electrophoresis equipment for DNA agarose gel |
| Mini-PROTEAN Tetra cell | Bio-rad | 165-8000 | Electrophoresis equipment for Western blot |
| ChemiDoc XRS+ System with Image Lab Software | Bio-rad | 170-8265 | Image acquisition and analysis software for gels and blots |
| 4" (10 cm) dia., 5 x 7 mm diced Silicon Wafer | Ted Pella | 16007 | Silicon waferfor scanning electron microscopy and atomic force microscopy |
| Thermomixer R | Eppendorf | 22670107 | Shaker |
| Isoton II diluent | Beckman Coulter | 8546719 | Isoton diluent |
| Multisizer 4 Coulter Counter | Beckman Coulter | A63076 | Particle counting analyzer |
| Non-functionalized porous silicon particles | Microelectronics Research Center, University of Texas at Austin | Dicoidal shape. 2.6 μm (diameter) x 0.7 μm (height), provided in isopropyl alcohol | |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | Particle analyzer system for size and zeta potential | |
| Scanning Electron Microscope | FEI | Particle size and shape | |
| Atomic Force Microscope | Bruker | Particle size and shape | |
| Fluo ViewTM 1000 Confocal Microscope | Olympus | Visualization of fixed and live cells |
References
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