Summary
Levering er stadig den største udfordring for den terapeutiske gennemførelse af små interfererende RNA (siRNA). Denne protokol indebærer anvendelse af en multifunktionel og biokompatibel siRNA levering platform bestående af arginin og polyethylenimin podet porøst silicium mikropartikler.
Introduction
Små interfererende RNA'er (siRNA'er) er dobbeltstrengede RNA-molekyler, der kan undertrykke ekspressionen af gener. I de seneste år har siRNAs blevet udviklet som en ny generation af biodrugs der viser terapeutisk potentiale for fremtidig anvendelse i kliniske anvendelser 1-5. Men en vellykket gennemførelse af siRNA terapi er stadig en stor udfordring, som følge af nedbrydning af nukleaser, dårlig intracellulær optagelse, lav transfektionseffektivitet og ineffektiv frigørelse fra endosomet / lysosomet 5. Mange af disse forhindringer kan overvindes ved at udvikle platforme, som sikkert og effektivt kan levere siRNA til sygt væv. Sammenlignet med virale bærere, ikke-virale platforme giver flere fordele, såsom sikkerhed, lave omkostninger og nem skræddersy. Især kationiske nanopartikler, såsom polymerer og lipider, har vist sig nyttigt for siRNA levering 3.
Tidligere har vi udviklet et skiveformet drUG leveringssystem, betegnet flertrins vektor (MSV). Denne platform er baseret på sekventielle trin, hvor et køretøj er frigivet fra en anden. Det første trin køretøj er en mikropartikel fremstillet af biologisk nedbrydeligt porøst silicium (PSI), mens den anden fase køretøjer er nanopartikler fyldt med medicin eller kontrastmidler 6,7. De nanopartikler, der er indlejret i PSI materiale, efterhånden udgivet som Si nedbryder 8. En fordel ved at bruge Si-partikler er, at morfologien og overfladeegenskaber let kan skræddersys til at opnå optimal biodistribution og lægemiddelfrigivelse. For nylig blev den vellykkede brug af MSV platform for levering af siRNA liposomer til tumorvæv vist i en æggestokkene og brystkræft musemodel 9, 10.
I dette arbejde har vi fabrikeret et universelt system for siRNA levering baseret på principper fra MSV-platformen. Effekten af dette afgivelsessystem er tidligere påvist osing forskellige siRNA molekyler 11. Systemet er en polykation-funktionaliseret porøst silicium (PCPS) bærer, der består af psi podet med polyethylenimin (PEI) og arginin (Arg). PEI kan hjælpe ved dannelse af elektrostatiske interaktioner med siRNA, mens Arg og psi kan tjene til at reducere toksiciteten af PEI, som tidligere demonstarted 11. Desuden kan tilstedeværelsen af PEI bistå i intracellulær optagelse og endosomale undslippe, mens PSI mikropartikler muliggøre siRNA beskyttelse og langvarig frigivelse. PSI partikler gradvist nedbrydes under fysiologiske betingelser, hvilket resulterer i dannelsen af Arg-PEI / siRNA nanopartikler (figur 1), som har en særskilt morfologi og en snæver størrelsesfordeling 11. For oplysninger om stabiliteten af PCPS / siRNA-system, henvises til den undersøgelse, som Shen et al. 11. Denne PCPS platform adskiller sig fra den konventionelle MSV, da den anden fase nanopartikler ikke i første omgang present i bæreren, men er dannet over tid som den første fase bærer nedbryder 11, 12. Den siRNA belastningseffektivitet, cytotoksicitet og gendæmpning effektivitet PCPS systemet er blevet evalueret in vitro. Transfektionseffektiviteten blev målt ved hjælp af siRNA mod ataksi telangiectasia muterede (ATM) onkogen, som er involveret i DNA-reparation 10. Tidligere har undertrykkelse af ATM blevet vist at mindske tumorvækst i en brystkræft model 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. PCPS Particle Fremstilling
- Oxidere ikke-funktionaliserede porøse silicium partikler i en 30% opløsning af hydrogenperoxid ved 95 ° C i 2 timer. Aminere de oxiderede partikler i 2% (3- aminopropyl) triethoxysilan opløsning i isopropylalkohol i 2 dage ved 65 ° C med forsigtig omrøring.
- Centrifugeres opløsningen i 30 minutter ved 18.800 xg og vaske partiklerne to gange i isopropylalkohol og tre gange i ethanol, ved hjælp af korte lydbehandling at suspendere pellet. Lad partiklerne i ethanolopløsning ved udførelse trin 1.3 og 1.4.
- Tilsæt en kendt mængde af partikel suspension (f.eks 10 pi) til 10 ml isoton fortyndingsmiddel og tælle partikler med en partikeltælling analysator for at bestemme koncentrationen af partikler i stamopløsningen.
- Aktiver syregruppe af L-arginin (0,1 nmol) med N - (3-dimethylaminopropyl) - N '-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC, 0,1 nmol) / N
- Kort sonikeres partikel stamopløsningen og tilsæt 1 milliard partikler til L-arginin-opløsning og lader reaktionen i 18 timer ved stuetemperatur med forsigtig omrøring.
- Aktivere det første asparaginsyre gruppe af N - (tert-butoxycarbonyl) -L-asparaginsyre (Boc-Asp-OH, 1 nmol) med EDC (0,1 nmol) / NHS (0,1 nmol) i 20 ml ethanol i 4 timer ved 4 ° C med forsigtig omrøring.
- 50 mg polyethylenimin i 10 ml ethanol opløses og tilsæt opløsningen til Boc-Asp-OH blanding. Lad reaktionen fortsætte i 24 timer ved stuetemperatur med forsigtig omrøring.
- Aktivere den anden asparaginsyre gruppe af Boc-Asp-OH / PEI løsning med EDC (0,1 nmol) / NHS (0,1 nmol) ved 4 ° C i 6 timer under forsigtig omrøring.
- Til opnåelse af PCPS partikler, tilsæt partikel opløsningen fra trin 1.5 i Boc-Asp-OH / PEI-opløsning fra trin 1.8. Lad reaktionen forløbe i 18 timer ved stuetemperatur med forsigtig st irring.
- Centrifugeres opløsningen i 30 minutter ved 18.800 xg og partikel opløsning vaskes tre gange med ethanol ved hjælp af kort lydbehandling for at suspendere pellet.
2. PCPS Particle karakterisering
- Måle størrelsen af partiklerne ved hjælp af et scanningselektronmikroskop (SEM).
- Placer en dråbe partikel suspension (10.000 partikler / ul i ethanol) på en ren silica SEM prøve stub og lad tørre ved stuetemperatur under vakuum.
- Mål SEM billeder ved 8 kV med en 3-5 mm arbejder afstand ved hjælp af en in-linse detektor.
- Mål zetapotentialet af partiklerne ved hjælp af en partikel analysator system.
- Bland 10 pi partikel suspension (10.000 partikler / pl i ethanol) med 1 ml 10 mM phosphatbuffer (pH 7,4).
- Indlæs prøven i foldede kapillærer og måle zetapotentialet ifølge producentens anvisninger.
- Tør PCPS partikler (fra PCPS partikel forberedelse trin 1.9) under vakuum O / N.
- Tilføj siRNA (4 ug) i nuclease-frit vand (20 pi) til de tørrede PCPS partikler og sonikeres kortvarigt. Brug følgende partikel til siRNA forhold: 2 × 10 5 partikler / 0,2 ug siRNA, 4 × 10 5 partikler / 0,2 ug siRNA, 6 x 10 5 partikler / 0,2 ug siRNA, 8 × 10 5 partikler / 0,2 ug siRNA, 10 × 10 5 partikler / 0,2 ug siRNA og 12 × 10 5 partikler / 0,2 ug siRNA.
- Der inkuberes i 3 timer ved 4 ° C på et rysteapparat (1000 rpm) for at tillade siRNA binding til partiklerne.
4. Optimering af siRNA / PCPS Particle Ratio
- Tilføj DNA loading dye til 20 pi af de PCPS / kontrol siRNA partikler med forskellig partikel til siRNA-forhold (se indlæsning af siRNA i PCPS partikler).
- Indlæs samsempler i en 2% agarosegel indeholdende DNA gel pletten.
- Udfør elektroforese ved en konstant spænding på 120 V i 20 minutter i køreklar buffer.
- Analyser gelen med køb image og analysesoftware.
5. Frigivelse af siRNA fra PCPS Partikler
- Bland 20 pi af PCPS / kontrol siRNA partikler med forskellige partikel til siRNA forhold (se trin 3) i natriumdodecylsulfat (SDS, 2%) og lad stå i 1 time ved stuetemperatur.
- Tilføj DNA loading dye til prøverne.
- Load prøver til en 2% agarosegel indeholdende DNA gel pletten.
- Udfør elektroforese ved en konstant spænding på 120 V i 20 minutter i køreklar buffer under anvendelse af DNA elektroforese udstyr og en strømforsyning.
- Analyser gelen med køb image og analysesoftware.
6. konfokal mikroskopi PCPS Partikler
- Tilsæt 5 pi PCPS / fluorescerende kontrol siRNA partikler (10 × 10 5 partikler / 0.2 ug siRNA / 20 pi) til et glas dækglas.
- Visualiser partikellag ved konfokal mikroskopi.
7. Karakterisering af Arg-PEI / kontrol siRNA Nanopartikler
- At nedbryde silikonemateriale og danne Arg-PEI / kontrol siRNA nanopartikler, tilføje PCPS / siRNA partikler (10 × 10 6 PCPS partikler / 2 ug siRNA) til 100 pi phosphatpufret saltvand og ryste (1.000 rpm) ved 37 ° C i 2 dage.
- Centrifugeres prøven i 30 minutter ved 18.800 xg og indsamle supernatanten.
- Måle størrelsen af de dannede Arg-PEI / siRNA nanopartikler med dynamisk lysspredning (DLS).
- Bland 10 pi af supernatanten med 1 ml 10 mM phosphatbuffer (pH 7,4) og anbringes i en plastik kuvette.
- Måle størrelsen af partiklerne ved hjælp af en partikel analysator ifølge producentens anvisninger.
- Bestem størrelse og morfologi af det dannede Arg / PEI-siRNAnanopartikler med atomic force mikroskopi.
- Tag 10 pi af supernatanten og sted på en siliciumskive.
- Visualiser partiklerne med atomic force mikroskopi (AFM).
8. Cellekultur
- Kultur MDA-MB-231 humane brystkræftceller i cellekultur medier suppleret med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin-streptomycin ved 5% CO 2, 95% fugtighed og 37 ° C.
9. konfokalmikroskopi af levende celler med PCPS Partikler
- Plate celler i 2 brønde kultur glider på en podningsdensitet på 3 x 10 5 celler / brønd i 24 timer.
- Tilføj PCPS partikler fyldt med fluorescerende kontrol siRNA (10 × 10 5 partikler / 0,2 ug partikel til siRNA ratio, 50 nM siRNA) til celler.
- Optage en film af cellerne med et konfokalt mikroskop (leveres med et kammer, 5% CO2, 95% fugtighed og 37 ° C) i 12 timer efter partikel exposikker.
10. konfokalmikroskopi af fikserede celler med PCPS Partikler
- Plate celler i 2 brønde kultur glider på en podningsdensitet på 3 x 10 5 celler / brønd i 24 timer.
- Tilføj PCPS partikler fyldt med fluorescerende kontrol siRNA (10 × 10 5 partikler / 0,2 ug partikel til siRNA ratio, 50 nM siRNA) til celler og inkuberes i 1 dag, 7 dage og 10 dage.
- Vask cellerne to gange med phosphatbufret saltvand og derefter fastgøre dem med 4% paraformaldehyd-opløsning i 10 min.
- Vask cellerne med phosphatbufret saltvand.
- Permeabilisere cellerne med 0,1% octylphenol ethoxylat i 10 minutter og derefter vaske dem tre gange med phosphatbufret saltvand.
- Bloker cellerne med albumin fra bovin serum (10 mg / ml) i phosphatpufret saltopløsning i 10 minutter ved stuetemperatur under forsigtig omrøring.
- At visualisere filamentøs actin, inkuberes cellerne med fluorescensmærket phalloidin (1 pl / 40 piblokerende opløsning) i 20 minutter ved stuetemperatur med forsigtig omrøring og derefter vaske i phosphatbufret saltvand.
- Fjern objektglassene fra rammen og tilføj antifade reagens med 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) at visualisere kernen.
- Tilføj et dækglas på toppen og tage billeder af cellerne med konfokal mikroskopi.
11. Flowcytometri af celler med PCPS / fluorescerende Kontrol siRNA Partikler
- Plate celler i en 6-brønds plade ved en podningsdensitet på 3 x 10 5 celler / brønd i 24 timer.
- Tilføj PCPS partikler fyldt med fluorescerende kontrol siRNA (10 × 10 5 partikler / 0,2 ug partikel til siRNA ratio, 50 nM siRNA) til cellerne og inkuberes i 24 timer.
- Vask cellerne med phosphatpufret saltvand og skrabe dem med en celleskraber.
- Opbevar cellerne i phosphatpufret saltvand med 2% føtalt bovint serum før analyse. Brug ubehandlede celler som en negativ kontrol.
- Udfør flow cytometry.
12. Cell levedygtighed Celler med PCPS Partikler og PCPS / kontrol siRNA Partikler
- Plate celler i en plade med 96 brønde ved en celledensitet på 3 × 10 3 celler / brønd i 24 timer.
- Behandl cellerne med PCPS partikler (1,5 × 10 5 / godt og 6 × 10 5 / brønd) eller PCPS / kontrol siRNA partikler (10 × 10 5 partikler / 0,2 ug partikel til siRNA-forhold, 10 Nm og 100 nM siRNA) i 48 time og 72 timer. Brug ubehandlede celler og celler behandlet med phosphatbufret saltvand (samme volumen som de tilsatte partikler) som kontroller. Bestem hver prøve i tre eksemplarer.
- Udfør en celleproliferationsassay i henhold til producentens anvisninger.
- Repræsentere data som middelværdi ± standardafvigelse.
13. Western Blot af celler med PCPS / ATM Muterede siRNA Partikler
- Plate celler i en 6-brønds plade ved en celletæthed 2 × 10 5 celler / well i 24 timer.
- Inkubér cellerne med PCPS / kontrol siRNA (50 nM) partikler eller PCPS / ATM siRNA (50 nM) partikler til 72 timer. Brug ubehandlede celler som en kontrol.
- Lyse cellerne under anvendelse af et protein ekstraktion reagens suppleret med en protease-inhibitor cocktail.
- Centrifuger cellelysaterne i 10 minutter ved 14.000 xg og inddrive supernatanten.
- Bestem proteinkoncentrationen med et protein kvantificering assay ifølge producentens anvisninger.
- Tilføj prøve påsætningsbuffer (med 5 pi 2-mercaptoethanol / ml buffer) til prøverne og varme dem i 6 minutter ved 99 ° C.
- Indlæs proteinprøver (20 pg / pl) i en 12% SDS-polyacrylamidgel i rindende puffer og udføre polyacrylamidgelelektroforese (1 time, 120 V) ved hjælp af elektroforese udstyr og en strømforsyning.
- Overfør gel i transfer-buffer (med 20% methanol) til en nitrocellulosemembran (1 time, 100 V) ved hjælp af elektroforese udstyr ogen strømforsyning.
- Bloker membranen med 5% tørmælk i 1 time.
- Inkuber membranen med ATM primære antistof (fra kanin) i blokerende opløsning (fra trin 13.9) ved en 1: 1000 fortynding O / N.
- Vask membranen med phosphatbufret saltvand indeholdende 0,1% polyethylenglycol sorbitanmonolaurat og derefter inkubere det med det sekundære antistof (anti-kanin) i blokerende opløsning (fra trin 13.9) ved en 1: 2500 fortynding i 1 time.
- Vask membranen med phosphatbufret saltvand indeholdende 0,1% polyethylenglycol sorbitanmonolaurat og påvise proteinbåndene med Western blot detektionsreagens hjælp erhvervelse billede og analysesoftware.
- For lastning kontrol vaske membranen, og gentag trin 13,9-13,12 anvendelse af en β-actin-primært antistof (fra mus, 1: 10.000 fortynding) og et sekundært antistof (anti-muse 1: 4.000 fortynding).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokol beskriver anvendelsen af et ikke-viralt afgivelsessystem til sikker og effektiv siRNA transfektion. SEM resultater viser, at PCPS partiklerne er cylindrisk i form og har en diameter på 2,6 um (figur 2A). Partiklerne er positivt ladede med en zetapotentiale på ca. 8,21 (figur 2B), hvorved elektrostatisk binding med negativt ladede nukleotider. Konfokale billeder af forskellige lag af PCPS partikler viser, at fluorescerende kontrol siRNA er lagt inde i porøst silicium partikler (figur 2C). Dannelse og udslip af Arg-PEI / siRNA nanopartikler fra PSI-partikler blev bekræftet med DLS og AFM. Størrelsesfordelingen af partiklerne varierede fra 70 til 120 nm, med en gennemsnitlig størrelse på 94 nm (figur 2D). AFM billeder viser, at nanopartiklerne har en sfærisk form (figur 2E).
Den ratio af partikler til siRNA blev optimeret ved agarosegelelektroforese for at sikre høj bindingsaffinitet (figur 3A). En bred vifte af partikel til siRNA forhold blev anvendt (2 x 10 5, 4 × 10 5, 6 × 10 5, 8 × 10 5, 10 × 10 5 og 12 × 10 5 /0.2 ug siRNA). Resultaterne indikerer, at siRNA kan binde tæt til partiklerne, når partiklen beløb er over 8 × 10 5. Et forhold på 10 × 10 5 PCPS / 0,2 ug siRNA blev udvalgt til yderligere forsøg. Endvidere blev siRNA succes frigivet fra bæreren ved behandling med SDS, som illustreret i figur 3B.
Dernæst blev kælder internalisering af PCPS / fluorescerende kontrol siRNA partikler evalueres i MDA-MB-231-celler. Konfokale billeder taget efter 24 timers behandling viser, at partiklerne er effektivt internaliseres i cellerne (Figur 4 Figur 5 viser, at 89% af cellerne har internaliseret PCPS / siRNA partikler efter 24 timers inkubation. Desuden blev internalisering proces registreret for 12 timer (Video 1). Disse resultater indikerer, at PCPS partikler effektivt kan levere siRNA i celler. Ophobningen af siRNA langsigtet inde i cellerne blev også evalueret ved konfokal mikroskopi. På dag 7 og dag 10 var siRNA stadig påviselig inde i cellerne (figur 6).
En af de vigtigste faktorer til at overveje, når de udvikler et siRNA leveringssystem er sikkerheden for bæreren 13. PEI er kendt for at danne polyplekser med siRNA, støtte i cellulær optagelse og udløser frigivelse fra endosomet / lysosomet. Imidlertid kan PEI har toksiske virkninger på grund af tilstedeværelsen af positivt ladede primære aminogrupper i rygraden 14,15. For eksempel PEI binding til glycocalyx på celleoverfladen kan resultere i FOrmation af store klynger 16. For at eliminere denne charge-induceret toksicitet blev PEI kovalent konjugeret til arginin gennem en bro linker, for at reducere antallet af primære aminogrupper. Cellelevedygtigheden forblev over 95% efter 48 timer og 72 timer, når partikler og siRNA blev anvendt ved en koncentration på op til 6 × 10 5 / brønd og 100 nM (figur 7A). Dernæst blev transfektion effekten af siRNA mod onkogenet ATM evalueret i MDA-MB-231-celler. Western blot-resultaterne viser, at de proteinniveauer ATM sænkes efter behandling med PCPS / ATM siRNA (figur 7B). Resultaterne tyder på, at PCPS platformen er et sikkert og effektivt system til siRNA levering.
Figur 1. Skematisk repræsentation af polykation-funktionaliserede porøse silicium (PCPS) partikler. strong> arginin (Arg) -polyethylenimine (PEI) / dannes små interfererende RNA (siRNA) nanopartikler efter nedbrydningen af silicium (Si).
Figur 2. Karakterisering af PCPS partikler. (A) Scanning elektronmikroskopi (SEM) billede af PCPS partikler. (B) Zetapotentialet PCPS partikler. (C) Konfokale billeder af forskellige lag af PCPS / fluorescerende kontrol siRNA partikler. (D) størrelsesfordelingen af arginin Arg-PEI / kontrol siRNA nanopartikler frigivet fra de porøse silicium mikropartikler. (E) Atomic force mikroskopi (AFM) billeder af Arg-PEI / kontrol siRNA nanopartikler. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 3. Agarose gel til optimering af PCPS / siRNA delivery system. (A) binding affinitet mellem PCPS partikler og kontrollere siRNA. Båndene repræsenterer ubundet siRNA. (B) siRNA frigørelse efter inkubering med 2% SDS i 1 time. Båndene repræsenterer total siRNA (ubundet og bundet). Prøve 1: siRNA; Prøve 2: 2 × 10 5 PCPS partikler / 0,2 ug siRNA; Prøve 3: 4 × 10 5 PCPS partikler / 0,2 ug siRNA; Prøve 4: 6 × 10 5 PCPS partikler / 0,2 ug siRNA; Prøve 5: 8 × 10 5 PCPS partikler / 0,2 ug siRNA; Prøve 6: 10 × 10 5 PCPS partikler / 0,2 ug siRNA; Prøve 7: 12 × 10 5 PCPS partikler / 0,2 ug siRNA.
75 / 52075fig4.jpg "/>
Figur 4. konfokalt mikroskop billeder af PCPS / fluorescerende siRNA partikler (rød) i MDA-MB-231-celler (24 timers inkubation). Kernen og filamentøse actin blev visualiseret med 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI, blue ) og phalloidin (grøn), hhv. Tre forskellige lag blev afbildet (top, midt og basal). Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 5. Kvantitativ flowcytometri analyse af fluorescerende MDA-MB-231-celler efter inkubering med PCPS / kontrol fluorescerende siRNA partikler. Ubehandlede celler blev anvendt som en negativ kontrol. 89% af cellerne var internaliseret partiklerne.
igur 6 "src =" / files / ftp_upload / 52075 / 52075fig6.jpg "/>
Figur 6. Konfokale billeder af fluorescerende kontrol siRNA (rød) inde MDA-MB-231-celler. Celler blev inkuberet med PCPS / fluorescerende kontrol siRNA partikler i 1 dag, 7 dage og 10 dage. Cellerne blev derefter visualiseret med konfokal mikroskopi. Kernen og trådformede actin blev visualiseret med 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI, blå) og phalloidin (grøn), henholdsvis. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 7. Cellelevedygtighed og gendæmpning in vitro. (A) En celle levedygtighed assay af celler inkuberet med PCPS partikler og PCPS / kontrol siRNA partikler (SCR). Forsøget blev udført i tripeksemplarer og resultaterne præsenteres som middelværdi ± standardafvigelse. Ubehandlede celler (blank) og celler inkuberet med PBS blev anvendt som kontroller. (B) Western blot af PCPS / ataksi telangiectasia muteret (ATM) siRNA partikler. Celler blev eksponeret for PCPS / kontrol siRNA (SCR) partikler og PCPS / ATM siRNA partikler. Ubehandlede celler (mock) blev anvendt som en kontrol. β-actin blev anvendt som en loading kontrol.
Video 1 . Tidsafhængig optagelse af PCPS / fluorescerende kontrol siRNA partikler i levende MDA-MB-231-celler. Videoen er optaget i 12 timer efter udsættelse af cellerne for partikler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol beskriver en fremgangsmåde til vellykket levering og transfektion af siRNA i celler. Især er levering af siRNA opnås ved anvendelse af en multifunktionel platform bestående af polykation-funktionaliserede psi partikler. Brugen af siRNA terapi har stort potentiale, f.eks kræftbehandling, som forskellige onkogener kan målrettes med høj specificitet. Der er derfor et behov for at udvikle siRNA levering køretøjer, der kan afbøde de udfordringer siRNA terapi. Afslutningsvis har vi skitseret en protokol, der viser lovende for en sikker og effektiv levering af siRNA. Men der er nogle vigtige faktorer, der bør tages i betragtning, når du udfører den beskrevne teknik. For eksempel, en vigtig overvejelse, når fremstilling af PCPS partikler er at håndtere siRNA omhyggeligt, for at undgå nedbrydning af nukleaser. Især, rene handsker og RNAse bør anvendes gratis rør og vand på alle tidspunkter, når du arbejder medsiRNA. Hvis siRNA transfektion effektivitet er lav, kan en spray, der fjerner RNAse kontaminering anvendes til at sprøjte handsker og arbejdsområder. Desuden, hvis transfektionen er mislykket, siRNA bør afprøves med et kommercielt transfektionsreagens at afgøre, om problemet er forårsaget af siRNA eller partiklerne. En anden kritisk overvejelse for en vellykket gennemførelse af PCPS / siRNA levering er at passe på, når du udfører centrifugering og vasketrin. Nemlig, bør supernatanten fuldt bortkastes for at fjerne overskydende reagenser, der er nødvendige i hele præparatet partikel trin.
En vigtig fordel ved PCPS / siRNA delivery system er sikkerhed. Adskillige siRNA transfektion midler har en høj kationisk ladning, hvilket bidrager til cellulær toksicitet 13,15. Faktisk fleste kommercielle protokoller viser, at reagenserne skal inkuberes med cellerne i kun et par timer, for at undgå celledød. Tværtimod ceLLS kan blive udsat for de PCPS partikler til flere dage uden tegn på toksicitet, som det fremgår af cellelevedygtigheden resultater. De PCPS partikler kan binde siRNA med høj affinitet på grund af tilstedeværelsen af PEI. Men charge-induceret toksicitet af PEI forhindres af den unikke opsætning af levering platform. Især den kovalente binding af Arg til PEI og indkapslingen af PEI inde Si porer bidrage til reduceret toksicitet. En anden fordel ved PCPS platformen er at siRNA transfektion kan finde sted i nærvær af serum. Andre eksisterende fremgangsmåder kræver sædvanligvis anvendelse af serum-frit celledyrkningsmedier, derved at tilføje yderligere trin til transfektion processen og potentielt interfererende med regelmæssige celle signalveje.
En yderligere fordel ved PCPS system er, at det ikke kræver nogen ændring af siRNA-molekyler. Mens nogle af de nuværende metoder kræver komplicerede konjugering skridt til at stabilisere siRNA eller aktivere cellular internalisering 13, det PCPS system er baseret på simpel blanding for siRNA læsning. Bindingen til PEI og porerne i Si materiale giver et beskyttende miljø for siRNA, hvorved kontakt med nukleaser. De PCPS partikler kan opbevares i længere tidsperioder såsom tørret materiale eller i isopropylalkohol. Desuden, hvis PCPS / siRNA partikler frysetørres de kan lagres i mindst tre måneder ved 4 ° C. De lyofiliserede PCPS partikler bør suspenderes i RNase-frit vand lige før transfektion, og må ikke opbevares i opløsning. Endelig PCPS platform tillader langvarig frigivelse af siRNA, som tidligere rapporteret 11 dermed øge den periode, hvor målgener forbliver undertrykt. Følgelig efter cellulær internalisering, Si partikler gradvist nedbrydes, hvilket resulterer i dannelsen af Arg-PEI / siRNA nanopartikler. Efterfølgende siRNA langsomt frigives i cytoplasmaet, hvor det kan binde til messenger RNA (mRNA), hvorved det biologisk aktivitet. Selv PCPS partikler giver adskillige fordele i forhold til eksisterende metoder til siRNA levering, en begrænsning af den teknik er, at ikke-funktionaliseret PSI mikropartikler er påkrævet som et udgangsmateriale. Mens partikler kan syntetiseres under anvendelse af fotolitografi og elektrokemisk ætsning 17, er disse teknikker ikke let tilgængelige på alle institutioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polyethylenimine (PEI), branched | Sigma-Aldrich | 408727 | Average molecular weight ~25,000 Da |
| L-Arginine | Sigma-Aldrich | A5006 | Reagent grade, ≥98% |
| Boc-Asp-OH | Sigma-Aldrich | 408-468 | 99% |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763 | 30 wt. % in H2O |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 339741 | 100.00% |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907 | ≥99.7% |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 459844 | ≥99.5% |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) | Sigma-Aldrich | 03449 | ≥99% |
| Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A7030-10G | Blocking agent |
| Ataxia-telangiectasia mutated siRNA | Sigma-Aldrich | Designed in-house | |
| Tris Acetate-EDTA buffer | Sigma-Aldrich | T9650 | For DNA agarose gel electrophoresis |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | Polyethylene glycol sorbitan monolaurate |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250 | For Western blot |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 71496 | For making phosphate buffer |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 71640 | For making phosphate buffer |
| Anti-Mouse IgG | Sigma-Aldrich | A4416 | Secondary antibody (anti-mouse) for Western blot |
| N-Hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 130672 | 98% |
| CELLSTAR 96W Microplate Tissue Culture Treated Clear w/ Lid | Greiner Bio-One | 655182 | 96-well plate |
| 10x Tris-Glycine Liquid | Li-Cor | 928-40010 | Transfer buffer for Western blot |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | Santa Cruz | Sc-281692 | Fixation of cells |
| CellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (MTS) | Promega | G5421 | Proliferation assay |
| Phosphate buffered saline | Fisher Scientific | BP399-500 | 10x Solution |
| Corning cellgro Dulbecco's Modification of Eagle's (Mod.) | Fisher Scientific | MT-15-017-CM | Cell culture media, 1x solution |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | AC21568-2500 | Octyl phenol ethoxylate, permeabilization agent |
| Cover glass | Fisher Scientific | 12-530C | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-1 | For Western blot transfer buffer |
| Plastic Cuvettes | Fisher Scientific | 14-377-010 | For size measurements using Zetasizer Nano ZS |
| Molecular BioProducts RNase AWAY Surface Decontaminant | Fisher Scientific | 14-754-34 | Spray for removing RNAse contamination |
| Agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | Low melting point, for running RNA samples |
| ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | Antifade reagent with DAPI, nucelus detection |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen | A12379 | Dissolve 300 units in 1.5 ml methanol, detection of filamentous actin |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | Invitrogen | S33102 | Visualization of RNA |
| Negative Control siRNA | Qiagen | 1022076 | Control siRNA |
| AllStars Neg. siRNA AF 555 | Qiagen | 1027294 | Fluorescent control siRNA |
| Cell scraper | Celltreat | 229310 | |
| BioLite Multidishes and Microwell Plates | Thermo Scientific | 130184 | 6-well plate |
| Pierce LDS Sample Loading Buffer (4x) | Thermo Scientific | 84788 | Sample loading buffer for Western blot |
| Pierce BCS Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | Protein quantification assay |
| Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktails (100x) | Thermo Scientific | 78430 | Protease inhibitor cocktail, use at 1x |
| M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent | Thermo Scientific | 78501 | Protein extraction reagent |
| Sorvall Legend Micro 21R | Thermo Scientific | 75002440 | Centrifuge |
| Beta Actin Antibody | Thermo Scientific | MA1-91399 | β-actin primary antibody (from mouse) for western blot |
| 6x TriTrack DNA Loading Dye | Thermo Scientific | R1161 | DNA loading dye |
| Nuclease-Free Water | Life Technologies | AM9938 | |
| Non-Fat Dry Milk | Lab Scientific | M0841 | For Western blot |
| 2-well BD Falcon culture slides | BD Biosciences | 354102 | 2-well culture slides |
| Amersham ECL Western blot detection reagent | GE Healthcare Life Sciences | RPN2106 | Western blot detection reagent |
| BA Membranes | GE Healthcare Life Sciences | 10402096 | Nitrocellulose membrane for Wester blot |
| ATM (D2E2) Rabbit mAb | Cell Signaling | 2873S | ATM primary antibody (from rabbit) for Western blot |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7074 | Secondary antibody (anti-rabbit) for Western blot |
| Folded capillary cells | Malvern | DTS 1061 | For zeta potentail measurements using Zetasizer Nano ZS |
| MDA-MB-231 cell line | ATCC | HTB-26 | Mammary Gland/Breast |
| 12% Mini-PROTEAN TGX Gel | Bio-rad | 456-1043 | For Western blot |
| Biorad PowerPac HC | Bio-rad | 164-5052 | Power supply for electrophoresis |
| 10x Tris/Glycine/SDS Buffer | Bio-rad | 161-0732 | Running buffer for Western blot |
| Wide Mini-Sub Cell GT Cell | Bio-rad | 170-4405 | Electrophoresis equipment for DNA agarose gel |
| Mini-PROTEAN Tetra cell | Bio-rad | 165-8000 | Electrophoresis equipment for Western blot |
| ChemiDoc XRS+ System with Image Lab Software | Bio-rad | 170-8265 | Image acquisition and analysis software for gels and blots |
| 4" (10 cm) dia., 5 x 7 mm diced Silicon Wafer | Ted Pella | 16007 | Silicon waferfor scanning electron microscopy and atomic force microscopy |
| Thermomixer R | Eppendorf | 22670107 | Shaker |
| Isoton II diluent | Beckman Coulter | 8546719 | Isoton diluent |
| Multisizer 4 Coulter Counter | Beckman Coulter | A63076 | Particle counting analyzer |
| Non-functionalized porous silicon particles | Microelectronics Research Center, University of Texas at Austin | Dicoidal shape. 2.6 μm (diameter) x 0.7 μm (height), provided in isopropyl alcohol | |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | Particle analyzer system for size and zeta potential | |
| Scanning Electron Microscope | FEI | Particle size and shape | |
| Atomic Force Microscope | Bruker | Particle size and shape | |
| Fluo ViewTM 1000 Confocal Microscope | Olympus | Visualization of fixed and live cells |
References
- De Fougerolles, A., Vornlocher, H. P., Maraganore, J., Lieberman, J. Interfering with disease: a progress report on siRNA-based therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 6 (6), 443-453 (2007).
- Rolland, A.
- Oh, Y. K., Park, T. G. siRNA delivery systems for cancer treatment. Adv Drug Deliv Rev. 61 (10), 850-862 (2009).
- Mintzer, M. A., Simanek, E. E. Nonviral vectors for gene delivery. Chem Rev. 109 (2), 259-302 (2009).
- Whitehead, K. A., Langer, R., Anderson, D. G. Knocking down barriers: advances in siRNA delivery. Nat Rev Drug Discov. 8 (2), 129-138 (2009).
- Decuzzi, P., et al. Size and shape effects in the biodistribution of intravascularly injected particles. J Control Release. 141 (3), 320-327 (2010).
- Decuzzi, P., Ferrari, M. Design maps for nanoparticles targeting the diseased microvasculature. Biomaterials. 29 (3), 377-384 (2008).
- Martinez, J. O., Evangelopoulos, M., Chiappini, C., Liu, X., Ferrari, M., Tasciotti, E. Degradation and biocompatibility of multistage nanovectors in physiological systems. J Biomed Mater Res A. 102 (10), 3540-3549 (2014).
- Shen, H., et al. Enhancing chemotherapy response with sustained EphA2 silencing using multistage vector delivery. Clin Cancer Res. 19 (7), 1806-1815 (2013).
- Xu, R., et al. Multistage vectored siRNA targeting ataxia-telangiectasia mutated for breast cancer therapy. Small. 9 (9-10), 1799-1808 Forthcoming.
- Shen, J., et al. High capacity nanoporous silicon carrier for systemic delivery of gene silencing therapeutics. ACS Nano. 7 (11), 9867-9880 (2013).
- Zhang, M., et al. Polycation-functionalized nanoporous silicon particles for gene silencing on breast cancer cells. Biomaterials. 35 (1), 423-431 (2014).
- Ozpolat, B., Sood, A. K., Lopez-Berestein, G. Nanomedicine based approaches for the delivery of siRNA in cancer. J Intern Med. 267 (1), 44-53 (2010).
- Philipp, A., Dehshahri, A., Wagner, A., E, Simple modifications of branched PEI lead to highly efficient siRNA carriers with low toxicity. Bioconjug Chem. 19 (7), 1448-1455 (2008).
- Hunter, A. C. Molecular hurdles in polyfectin design and mechanistic background to polycation induced cytotoxicity. Adv Drug Deliv Rev. 58 (14), 1523-1531 (2006).
- Andrews, P. M., Bates, S. B. Dose-dependent movement of cationic molecules across the glomerular wall. Anat Rec. 212 (3), 223-231 (1985).
- Ananta, J. S., et al. Geometrical confinement of gadolinium-based contrast agents in nanoporous particles enhances T1 contrast. Nat Nanotechnol. 5 (11), 815-821 (2010).
