Summary
Teslimat küçük müdahale RNA (siRNA) terapötik uygulanması için ana sorundur. Bu protokol, arginin ve polietilenimin aşılanmış gözenekli silikon mikro oluşan, çok fonksiyonlu ve biyo-uyumlu bir siRNA taşıyıcı platformun kullanılmasını içerir.
Introduction
Küçük, girişim yapan RNA'lar (siRNA'lar), gen ekspresyonunu engellemek çift-şeritli RNA molekülleridir. Son yıllarda, siRNA'lar klinik uygulamada 1-5 gelecekte kullanılmak için terapötik potansiyelini göstermektedir BioDrugs, yeni nesil olarak geliştirilmiştir. Bununla birlikte, siRNA tedavinin başarılı bir şekilde uygulanması nedeniyle nükleazlar, zayıf hücre içi alımı ve düşük transfeksiyon verimi ve endozom / lizozom 5 verimsiz salınması ile bozunmaya, önemli bir sorun teşkil etmektedir. Bu engellerin birçoğu güvenli ve verimli bir şekilde hastalıklı dokuya siRNA sunabilirsiniz teslim platformlarının geliştirilmesi, aşılabilir. Viral taşıyıcılar ile karşılaştırıldığında, viral-olmayan platformları, güvenlik, düşük maliyet ve biçimlendirilmesi kolaylığı gibi çeşitli avantajlar sağlar. Bu polimerlerin ve lipidler gibi, özellikle, katyonik nano-tanecikleri olarak, siRNA taşınması 3 için yararlı olduğu kanıtlanmıştır.
Daha önce, bir disk şekilli dr geliştirdikiletim sistemi ug, çok kademeli vektör (MSV) olarak adlandırılan. Bu platform, bir taşıt bir salındığı ardışık aşamaları dayanmaktadır. İkinci aşamada araçlar ilaçlar veya kontrast ajanları 6,7 yüklü nanoparçacıklar ise ilk aşaması bir araç, biyolojik olarak parçalanabilir bir gözenekli silikon (psi) yapılmış bir mikro-parçacık. Si 8 olarak azaldıkça PSI malzeme içine gömülü nanopartiküller, yavaş yavaş serbest bırakılır. Si partikülleri kullanmanın bir avantajı yüzey özelliklerinin, optimum bir biyo dağılıma ve ilaç salımı elde etmek için uygun olmasıdır. Son zamanlarda, tümör dokusuna siRNA lipozomlar verilmesi için MSV platformun başarılı kullanımı, bir yumurtalık ve meme kanseri fare modelinde 9, 10 olarak gösterilmiştir.
Bu çalışmada, MSV platformu ilkeleri temelinde siRNA'da için evrensel bir dağıtım sistemi fabrikasyon. Bu taşıyıcı sistemin etkinliği daha önce bize gösterilmiştirFarklı siRNA ing 11 molekülleri. Sistem polietilenimin (PEI) ve arginin (Arg) ile aşılanmış psi oluşan bir polikatyon işlevselleştirilmiş gözenekli silikon (PCPS) taşıyıcıdır. Arg ve PSI PEI toksisitesini azaltmak için hizmet edebilir süre önce 11 demonstarted gibi PEI, siRNA ile elektrostatik etkileşimleri oluşturulmasında yardımcı olabilir. PSI mikro-siRNA koruma ve sürekli salınmasını sağlayacak Buna ek olarak, PEI varlığı, hücre içi alımı ve endozomal kaçış yardımcı olabilir. PSI parçacıkları kademeli olarak ve böylece ayrı bir morfoloji ve dar bir boyut dağılımına sahip 11-Arg-PEI / siRNA nanopartiküller (Şekil 1) oluşması ile sonuçlanan, fizyolojik koşullar altında indirgeme. PCPS / SiRNA sisteminin istikrara ilişkin ayrıntılar için, Shen ve ark. 11 tarafından yapılan çalışmada bakın. İkinci aşama nanopartiküller başlangıçta Prese değil çünkü bu PCPS platformu, geleneksel MSV farklıdırbirinci aşama taşıyıcı 11, 12 olarak azaldıkça nt taşıyıcı içinde, ancak zaman içinde oluşturulur. PCPS sistemi siRNA yükleme verimliliği, sitotoksisite ve gen susturma etkinlik, in vitro olarak değerlendirilmiştir. Transfeksiyon etkililiği, DNA onarımı 10 yer almaktadır (ATM) onkojen mutasyona uğramış ataksi telanjiektazi karşı siRNA kullanılarak ölçülmüştür. Daha önce, ATM bastırılması, bir göğüs kanseri modelinde 10 tümör büyümesini azaltmak için gösterilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. PCPS Partikül Preparasyonu
- 2 saat süre ile 95 ° C 'de bir hidrojen peroksit% 30 çözeltisi içinde olmayan işlevselleştirilmiş gözenekli silikon parçacıkları okside eder. % 2 hafifçe karıştırılarak 65 ° C sıcaklıkta 2 gün boyunca izopropil alkol (3-aminopropil) trietoksisilan çözelti içinde oksitlenmiştir parçacıklar aminat.
- Pelet askıya kısa sonikasyon kullanılarak, 18.800 x g'de 30 dakika süre ile çözelti santrifüj ve izopropil alkol ve etanol içinde üç kez iki parçacıkları yıkayın. Adım 1.3 ve 1.4 gerçekleştirirken etanol çözeltisi içinde parçacıkların bırakın.
- 10 ml izoton seyreltici parçacık süspansiyonu (örneğin, 10 ul) olarak bilinen bir hacmi ilave edin ve yedek çözeltide bulunan parçacıkların yoğunluğunu belirlemek için bir parçacık sayma analizörü ile partiküllerin sayısı.
- (3-dimetilaminopropil) - - etilkarbodiimid hidroklorür (EDC, 0.1 nmol) / K, N ile birlikte L-arginin (0.1 nmol) ve asit grubu aktive
- Kısaca parçacık stok solüsyonu sonikasyon ve L-arginin solüsyonu 1000000000 parçacıklarının eklenmesi ve yumuşak bir şekilde karıştırma ile, oda sıcaklığında 18 saat reaksiyona bırakın.
- N birinci aspartik asit grubu aktive - (tert-Butoksikarbonil) -L-aspartik asit (Boc-Asp-OH, 1 nmol), 4 saat boyunca 20 ml etanol içerisinde EDC (0.1 nmol) / NHS (0.1 nmol) ile en hafifçe karıştırılarak, 4 ° C.
- 10 ml etanol içindeki, 50 mg polietilenimin içinde çözündürülür ve Boc-Asp-OH, karışıma solüsyonunu ilave edin. Reaksiyon hafifçe karıştırılarak oda sıcaklığında 24 saat boyunca sürmesine izin verin.
- Hafif karıştırma ile 6 saat boyunca 4 ° C sıcaklıkta EDC (0.1 nmol) / NHS (0.1 nmol) ile, Boc-Asp-OH / PEI solüsyonunun ikinci aspartik asit grubu etkinleştirir.
- PCPS parçacıklar elde etmek için, adım 1.8 Boc-Asp-OH / PEI solüsyonu içine 1.5 adım parça çözeltisi ekleyin. Reaksiyon hafif bir st oda sıcaklığında 18 saat devam etmesine izin irring.
- Pelet askıya kısa sonikasyon kullanılarak, 18.800 x g'de 30 dakika süre ile çözelti santrifüj ve etanol ile partikül çözeltisinin üç kez yıkayın.
2. PCPS Parçacık Karakterizasyonu
- Bir tarama elektron mikroskobu (SEM) ile parçacıkların boyutu ölçülür.
- Temiz bir silika SEM örnek saplama üzerindeki partikül süspansiyonu bir damla (etanol 10.000 parçacıklar / ul) yerleştirin ve vakum altında oda sıcaklığında kurumaya bırakın.
- Bir de lens dedektörü kullanılarak 3-5 mm çalışma mesafesi ile 8 kV SEM görüntüleri ölçün.
- Bir parçacık analiz sistemi kullanılarak parçacıkların zeta potansiyeli ölçülür.
- 1 mi 10 mM fosfat tamponu (pH 7.4) ile partikül süspansiyonu, 10 ul (etanol içinde 10,000 partikül / ul) karıştırın.
- Katlanmış kılcal hücreler içine yükleyin ve üreticinin talimatlarına uygun olarak zeta potansiyelini ölçer.
- Vakum O / N altında (PCPS parçacık hazırlama aşamasında 1,9 itibaren) PCPS parçacıkları kurulayın.
- Kurutuldu PCPS parçacıklar ve sonikasyon kısaca siRNA nükleaz içermeyen su (20 ul) (4 ug) ekleyin. SiRNA oranları aşağıdaki parçacık kullanın: 2 x 10 5 parçacıklar / 0.2 ug siRNA, 4 x 10 5 parçacıklar / 0.2 ug siRNA, 6 x 10 5 parçacıklar / 0.2 ug siRNA 8 x 10 5 parçacıklar / 0.2 ug siRNA, 10 x 10 5 parçacıklar / 0.2 ug siRNA ve 12 x 10 5 parçacıklar / 0.2 ug siRNA.
- SiRNA parçacıklar bağlanmaya imkan vermek için bir çalkalayıcı üzerinde 4 ° C de 3 saat karıştırıldı (1000 rpm) inkübe edilir.
SiRNA / PCPS Parçacık Oranı 4. Optimizasyon
- SiRNA farklı oranları parça (PCPS parçacıklar halinde siRNA yükleme bakınız) PCPS / kontrol siRNA parçacıkların 20 ul DNA yükleme boya ekleyin.
- Sam YükAlınan numuneler DNA jel leke ihtiva eden bir% 2 agaroz jeli içinde.
- Çalışan tampon içinde 20 dakika süre ile 120 V sabit gerilimde elektroforez yapın.
- Görüntü elde etme ve analiz yazılımı ile jel analiz.
PCPS Taneciklerinden siRNA'nın 5. Sürüm
- Sodyum dodesil sülfat (SDS,% 2) siRNA oranları (adım 3) farklı bir parçacık ile PCPS / kontrol siRNA parçacıkların 20 ul karıştırın, oda sıcaklığında 1 saat boyunca bekletilir.
- Numune DNA yükleme boya ekleyin.
- DNA jel leke ihtiva eden bir% 2 agaroz jeli yükleyin örnekleri.
- DNA elektroforezi cihaz ve bir güç kaynağı ile çalışan tampon içinde 20 dakika süre ile 120 V sabit gerilimde elektroforez yapın.
- Görüntü elde etme ve analiz yazılımı ile jel analiz.
PCPS Parçacıkların 6. Konfokal Mikroskopi
- PCPS / floresan kontrol siRNA parçacıkların (10 × 10 5 parçacıklar / 0 5 ul ekleyin.Bir cam kapak kayma 2 ug SiRNA / 20 ul).
- Konfokal mikroskobu ile parçacık katmanları gözünüzde canlandırın.
Arg-PEI / kontrol siRNA Nanopartiküller 7. Karakterizasyonu
- Silikon malzemenin indirgeme ve Arg-PEI / kontrol siRNA nanopartiküllerinin oluşması için, fosfat tamponlu tuzlu su, 100 ul PCPS / siRNA parçacıkları (10 x 10 6 PCPS parçacıkları / 2 ug siRNA) ekleyin ve 37 ° C'de (1,000 rpm) sallamak 2 gün.
- 18800 x g'de 30 dakika boyunca örnek santrifüj ve supernatant toplanır.
- Dinamik ışık saçılımı (DLS) ile oluşturulan Arg-PEI / siRNA nanopartiküllerin boyutunu ölçmek.
- 1 mi, 10 mM fosfat tampon maddesi (pH 7.4) süpernatan 10 ul karıştırın ve bir plastik küvet içine koyun.
- Üreticinin talimatlarına göre bir parçacık analiz sistemi kullanılarak parçacıkların boyutu ölçülür.
- Oluşan Arg / PEI-siRNA'nın boyutunu ve morfolojisi belirleyinatomik kuvvet mikroskobu ile nanopartiküller.
- Bir silikon gofret üzerinde süpernatant ve yerin 10 ul alın.
- Atomik kuvvet mikroskobu (AFM) ile partikülleri gözünüzde canlandırın.
8. Hücre Kültürü
- Hücre kültür ortamı içinde kültür, MDA-MB-231 insan meme kanseri hücreleri,% 10 fetal inek serumu ve% 1 penisilin-streptomisin,% 5 CO2,% 95 nem ve 37 ° C sıcaklıkta ile takviye edilmiştir.
PCPS Parçacıklar ile Canlı hücreler 9. Konfokal Mikroskopi
- 2-çukurlu kültür plakası hücreleri 24 saat / oyuk 3 x 10 5 hücre ilk önce tohum ekme yoğunluğu kayar.
- Hücrelere floresan kontrol siRNA (10 x 10 5 partikülleri / siRNA oranı 0.2 ug parçacık, 50 nM siRNA) ile yüklendiğinde, PCPS parçacıkları ekleyin.
- Parçacık expo aşağıdaki 12 saat (bir odacık,% 5 CO 2,% 95 nem ve 37 ° C ile birlikte) bir konfokal mikroskop ile hücrelerin bir film kaydetmekemin olun.
PCPS Parçacıklar Sabit Hücre 10. Konfokal Mikroskopi
- 2-çukurlu kültür plakası hücreleri 24 saat / oyuk 3 x 10 5 hücre ilk önce tohum ekme yoğunluğu kayar.
- Hücrelere floresan kontrol siRNA (10 x 10 5 partikülleri / siRNA oranı 0.2 ug parçacık, 50 nM siRNA) ile yüklendiğinde, PCPS parçacıkları ekleyin ve 1 gün, 7 gün ve 10 gün boyunca inkübe edilir.
- Fosfat tamponlu salin ile iki kez hücre yıkayın ve daha sonra 10 dakika boyunca% 4 paraformaldehit çözeltisi sabitleyin.
- Fosfat tamponlu tuzlu su ile yıkama hücreleri.
- 10 dakika boyunca% 0.1 oktil fenol etoksilat olan hücreler geçirgenliği ve daha sonra bunları, fosfat tamponlu tuzlu su ile, üç kez yıkayın.
- Hafifçe karıştırılarak oda sıcaklığında 10 dakika boyunca fosfat tamponlu tuz içinde sığır serumu (10 mg / ml) albumin ile hücrelerin bloke eder.
- (1 ul / 40 ul, floresanla işaretlenmiş falloidinle hücreleri inkübe lifli aktin görselleştirmek içinhafifçe karıştırılarak oda sıcaklığında 20 dakika boyunca çözelti) bloke edilmesi ve daha sonra fosfat tamponlu tuzlu su ile yıkayın.
- Çerçeveden slaytlar çıkarın ve çekirdeği görselleştirmek için 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile antifade reaktif ekleyin.
- Üstüne bir kapak cam ekleyin ve konfokal mikroskobu ile hücrelerin görüntüleri çekmek.
PCPS / floresan Kontrol siRNA Parçacıklar ile Hücreleri 11. Sitometrisi
- 24 saat / oyuk 3 x 10 5 hücre ilk önce tohum ekme yoğunluğu bir 6-yuvalı plaka plaka hücreleri.
- Hücrelere floresan kontrol siRNA (10 x 10 5 partikülleri / siRNA oranı 0.2 ug parçacık, 50 nM siRNA) ile yüklendiğinde, PCPS parçacıkları eklenir ve 24 saat süreyle inkübe edilir.
- Fosfat tamponlu tuzlu su ile yıkanır ve hücrelerin bir hücre kazıyıcı ile kazıyın.
- Analizden önce% 2 fetal sığır serumu ile fosfat tamponlu tuzlu su içinde hücreleri saklayın. Negatif bir kontrol olarak muamele edilmemiş hücreler kullanın.
- Akış cy gerçekleştirintometry.
PCPS Parçacıklar ve PCPS / kontrol siRNA Parçacıklar ile Hücreleri 12. Hücre canlılığı
- 24 saat / oyuk 3 x 10 3 hücrelerinin bir hücre yoğunluğunda 96 oyuklu bir plaka içerisinde Levha hücreleri.
- PCPS parçacıklarla hücreleri tedavi (1.5 x 10 5 / oyuk, 6 x 10 5 / çukur) veya PCPS / kontrol siRNA parçacıkları 48 (10 x 10 5 partikülleri / siRNA oranı 0.2 ug parçacık, 10 nM ve 100 nM siRNA) saat ve 72 saat. Kontrol olarak fosfat tamponlu tuzlu su (ilave parçacıklar ile aynı hacim) ile muamele muamele edilmemiş hücreler ve hücre kullanın. Üç kopya halinde her bir numune deneyi.
- Üreticinin talimatlarına göre bir hücre çoğalması analizi gerçekleştirir.
- Ortalama ± standart sapma olarak verileri temsil.
PCPS / ATM Mutated siRNA Parçacıklar ile Hücreleri 13. Western Blot
- Hücre yoğunluğu 2 x 10 5 hücre / a bir 6-yuvalı plaka Levha hücreleri24 saat süre ile ell.
- PCPS / kontrol siRNA (50 nM), parçacıklar ya da PCPS / ATM siRNA 72 saat boyunca (50 nM), parçacıkların hücreleri inkübe edin. Bir kontrol olarak muamele edilmemiş hücreler kullanın.
- Parçalayıcı bir proteaz inhibitör kokteyli ile takviye edilmiş bir protein ekstraksiyon reaktifi kullanılarak hücreler.
- 14000 x g'de 10 dakika boyunca hücre lizatları santrifüj ve süpernatantı iyileşir.
- Üreticinin talimatlarına uygun olarak, bir protein miktar tayini ile protein konsantrasyonunu belirleyin.
- (5 ul 2-merkaptoetanol / ml tampon) bir numunesi, yükleme tamponu ekleme örnekleri 99 ° C'de 6 dakika boyunca ısıtmaz.
- Çalışan tampon içinde bir% 12 SDS-poliakrilamid jel içinde protein numuneleri (20 ug / ml) yükleyin ve elektroforez cihaz ve bir güç kaynağı ile poliakrilamid jel elektroforez (1 saat, 120 V) gerçekleştirmek.
- Elektroforez ekipmanı kullanılarak bir nitroselüloz zar (1 saat, 100 V) (% 20 metanol), transfer tampon maddesi içinde jel aktarın veBir güç kaynağı.
- 1 saat süreyle% 5 kuru süt ile bloke membran.
- 1000 seyreltme, O / N ile 1: (aşama 13.9 gelen) çözeltiyi engelleme (tavşandan) atm birincil antikor ile membran inkübe edin.
- 1 saat süre ile 2500 seyreltme: 1% 0.1 polietilen glikol, sorbitan monolorat ihtiva eden fosfat tamponlu tuzlu su ile yıkanır ve daha sonra zar (aşama 13.9 gelen) çözeltiyi bloke ikincil antikor (anti-tavşan) ile inkübe edilir.
- % 0.1 polietilen glikol, sorbitan monolorat ihtiva eden fosfat tamponlu tuzlu su ile yıkanır ve zar görüntü elde etme ve analiz yazılımı kullanılarak Batı benek saptama reaktif protein bantları algılar.
- Yükleme kontrolü için, zarın yıkanması ve tekrar (fare, 1: 10,000 seyreltme) bir β-aktin primer antikoru kullanılarak 13,9-13,12 adım (anti-fare 1: 4000 seyrelti) ve bir sekonder antikor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokol, güvenli ve etkili bir siRNA transfeksiyon için bir viral-olmayan sağlama sistemi kullanımını tarif eder. SEM sonuçlar PCPS parçacıklar silindir şeklinde olan ve 2.6 mikron (Şekil 2A) bir çapa sahip olduğunu ortaya koymaktadır. partikülleri pozitif ve böylece negatif yüklü nükleotidler ile bağlama elektrostatik sağlayarak, yaklaşık 8,21 bir zeta potansiyeline (Şekil 2B) ile şarj edilmiştir. PCPS parçacıkların farklı katmanlarının Konfokal görüntüleri floresan kontrol siRNA gözenekli silikon parçacıklar (Şekil 2C) içinde yüklü olduğunu göstermektedir. PSI parçacıklardan Arg-PEI / siRNA nanopartiküller oluşumu ve serbest DLS ve AFM ile teyit edildi. parçacıkların boyut dağılımı, 94 nm (Şekil 2B) arasında bir ortalama boyutu, 70-120 nm arasında değişmektedir. AFM görüntüleri nanopartiküller küre şeklini (Şekil 2E) sahip olduğunu göstermektedir.
ratisiRNA parçacık O yüksek bağlanma afinitesine (Şekil 3A) sağlamak için agaroz jel elektroforezi ile optimize edildi. siRNA oranlarının, partiküllerin geniş bir yelpazede (2 x 10 5 kullanıldı, 4 x 10 5, 6 x 10 5, 8 x 10 5, 10 × 10 5 ve 12 × 10 5 /0.2 ug siRNA). Sonuçlar partikül miktarı 8 x 10 5 'in üzerinde olduğu zaman, siRNA partiküllerine sıkıca bağlanabilir olduğunu göstermektedir. 10 x 10 5 PCPS / A oranı 0.2 ug siRNA, daha başka deneyler için seçilmiştir. Şekil 3B'de gösterildiği gibi, SDS ile muamele Dahası, siRNA başarılı bir taşıyıcıdan serbest bırakıldı.
Daha sonra, PCPS / floresan kontrol siRNA parçacıkların bodrum içselleştirme, MDA-MB-231 hücrelerinde değerlendirilmiştir. Konfokal görüntüleri parçacıklar etkili bir hücre içine içselleştirilmiş olan tedavi gösterisi 24 saat (Şekil 4 sonra alınan Şekil 5 hücrelerinin% 89 inkübasyon 24 saat sonra PCPS / siRNA parçacıkları içselleştirmiş olduğunu göstermektedir. Ayrıca, içselleştirme süreci 12 saat (Video 1) kaydedildi. Bu sonuçlar, PCPS partikülleri hücre içine verimli şekilde siRNA sağlayabilir göstermektedir. hücre içinde siRNA uzun süreli birikimi de konfokal mikroskopi ile değerlendirildi. Gün 7 ve gün 10 de siRNA hala hücreleri (Şekil 6) içinde tespit edilemez.
Bir siRNA dağıtım sistemi geliştirilmesi taşıyıcı 13 güvenlik olduğunda en önemli faktörlerden biri dikkate. PEI siRNA endozom / lizozom hücresel alımında yardım ve tetikleme serbest bırakılması ile polyplexes oluşturulması için bilinmektedir. Bununla birlikte, PEİ bağlı omurga 14,15 pozitif yüklü birincil amino gruplarının varlığına bağlı olarak, toksik etkileri olabilir. Örneğin, PEİ fo neden olabilir hücre yüzeyi üzerinde glikokaliksin bağlanabilenbüyük kümeler 16 ım. Bu şarj bağlı hepatotoksisite ortadan kaldırmak için, PEİ kovalent birincil amino gruplarının sayısını azaltmak için, bir köprü bağlayıcı vasıtasıyla arginin konjüge edildi. parçacıklar ve siRNA yukarı / oyuk ve 100 nM olmuştur (Şekil 7A) x 10 5 ila 6 arasında bir konsantrasyonda kullanıldığı zaman, hücre canlılığı, 48 saat ve 72 saat sonra% 95'in üzerinde kalmıştır. Daha sonra, onkogen ATM karşı siRNA'nın, transfeksiyon etkinliği, MDA-MB-231 hücrelerinde değerlendirilmiştir. Western blot sonuçları ATM protein seviyeleri PCPS / atm siRNA (Şekil 7B) ile muamele edildikten sonra azaldığını göstermektedir. Sonuçlar PCPS platformu siRNA'da için güvenli ve etkin bir dağıtım sistemi göstermektedir.
Polikatyon-Fonksiyonlu gözenekli silikon (PCPS) parçacıkların 1. şematik gösterimi Şekil. strong> Arginin (Arg) -polyethylenimine (AST) / küçük müdahale RNA (siRNA) nanopartiküller silikon bozulması (Si) Aşağıdaki oluşturulur.
PCPS parçacıkların Şekil 2. karakterizasyonu. PCPS parçacıkların (A), tarama elektron mikroskobu (SEM) görüntüsü. (B) PCPS partiküllerinin zeta potansiyeli. (C) PCPS / floresan kontrol siRNA Parçacıkların farklı katmanları, Konfokal görüntüler. Gözenekli silikon mikro serbest arjinin Arg-PEI / kontrol siRNA nanopartiküllerin (D) boyut dağılımı. Arg-PEI / kontrol siRNA nanopartiküllerin (E) Atomik kuvvet mikroskobu (AFM) görüntüler. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
PCPS / SiRNA dağıtım sisteminin optimizasyonu için Şekil 3. Agaroz jel. (A) PCPS parçacıklar arasındaki afinite Bağlama ve siRNA kontrol. bantları bağlanmamış siRNA temsil eder. (B) siRNA bırakma 1 saat 2% SDS ile inkübasyon takip. bantları (bağlanmamış ve bağlı) toplam siRNA temsil eder. Örnek 1: siRNA; Örnek 2: 2 x 10 5 PCPS parçacık / 0.2 ug siRNA; Örnek 3: 4 x 10 5 PCPS parçacık / 0.2 ug siRNA; Örnek 4: 6 × 10 5 PCPS parçacıklar / 0.2 ug siRNA; Örnek 5: 8 x 10 5 PCPS parçacık / 0.2 ug siRNA; Örnek 6: 10 x 10 5 PCPS parçacık / 0.2 ug siRNA; Örnek 7: 12 x 10 5 PCPS parçacıklar / 0.2 ug siRNA.
75 / 52075fig4.jpg "/>
Şekil MDA-MB-231 hücrelerinde PCPS / floresan siRNA parçacıklar (kırmızı) (24 saat enkübasyon) 4. Konfokal mikroskop ve görüntüler. Çekirdeği ve filamentli aktin 4 ile görselleştirildi ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI mavi olmak üzere) ile falloidin (yeşil). Üç farklı katmanlar (üst, orta ve bazal) görüntülenmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil PCPS / kontrol floresan siRNA parçacıkları ile kuluçkadan sonra floresan, MDA-MB-231 hücrelerinin sitometri analizi 5. flow. İşleme tabi tutulmamış hücreler, bir negatif kontrol olarak kullanılmıştır. Hücrelerin% 89 parçacıklarını içselleştirmiş etmişti.
igure 6 "src =" / files / ftp_upload / 52.075 / 52075fig6.jpg "/>
Şekil MDA-MB-231 hücreleri içinde floresan kontrol siRNA (kırmızı) 6. Konfokal ve görüntüler. Hücreler PCPS / floresan kontrol siRNA 1 gün için parçacıklar, 7 gün ve 10 gün inkübe edilmiştir. Hücreler daha sonra konfokal mikroskopi ile görüntülenmiştir. çekirdek ve ipliksi aktin 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, mavi) ve falloidin (yeşil) ile görüntülendi, sırasıyla. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 7. Hücre canlılığı ve in vitro olarak gen susturma (A). PCPS parçacıklar ve PCPS / kontrol siRNA parçacıklar (SCR) ile inkübe edilen hücrelere bir hücre canlılığı deneyi. Deney gezisi yapıldılicate ve sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak sunulmuştur. PBS ile inkübe İşlem yapılmamış hücreler (boşluk) ve hücreleri, kontrol olarak kullanılmıştır. (B), (ATM) siRNA parçacıklar mutasyona uğramış PCPS / ataksi telanjiektazi batı beneği. Hücreler PCPS / kontrol siRNA (SCR) parçacıklar ve PCPS / atm siRNA partiküllerine maruz bırakıldı. İşlem yapılmamış hücreler (sahte) bir kontrol olarak kullanılmıştır. β-aktin, bir yükleme kontrolü olarak kullanılmıştır.
Video 1 canlı, MDA-MB-231 hücrelerinde PCPS / floresan kontrol siRNA parçacıkların. zamana bağlı alımı. Video parçacıkların hücreleri maruz bırakılmasından sonra 12 saat süre ile kaydedildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, hücrelerin içine siRNA gönderinin başarılı olması ve transfeksiyon için bir yöntem tarif eder. Özellikle, siRNA dağıtım polikatyon işlevselleştirilmiş PSI parçacık ihtiva eden çok fonksiyonlu bir platform kullanılarak elde edilir. SiRNA tedavisinin kullanımı çeşitli onkogenler yüksek özgüllük ile hedeflenen edilebilir, örneğin büyük bir potansiyel, kanser tedavisi vardır. Bu nedenle, siRNA'nın tedavisinin zorlukları azaltmak, hangi siRNA teslimat araçları geliştirmek için bir talep vardır. Sonuç olarak, biz siRNA'nın güvenli ve verimli bir teslimat için umut gösteren bir protokol özetlediğim. Bununla birlikte, tarif edilen teknik yaparken dikkate alınması gereken önemli faktörler vardır. Örneğin, PCPS parçacıklarının hazırlanması önemli bir husus nükleazlar tarafından bozulmasını önlemek için dikkatli bir şekilde siRNA idare etmektir. Çalışırken belirli bir temiz eldiven ve RNAse serbest tüpler ve su her zaman kullanılması gerektiğinisiRNA. SiRNA transfeksiyon etkinliği düşükse, RNAz kontaminasyonu kaldıran bir sprey eldiven ve çalışma alanları sprey kullanılabilir. Transfeksiyon başarısız ise, buna ek olarak, siRNA sorun siRNA veya partikül neden olup olmadığını belirlemek için, bir ticari transfeksiyon tepkin maddesi ile test edilmelidir. PCPS / SiRNA dağıtım sisteminin başarılı bir şekilde uygulanması için bir başka kritik husus santrifüj ve yıkama adımları gerçekleştirirken dikkat etmektir. Yani, üst faz tamamen tanecik hazırlama işlemleri boyunca gerekli olan, ayıraç fazlasını uzaklaştırmak için atılmalıdır.
PCPS / siRNA verme sisteminin önemli bir avantajı, güvenliğidir. Çeşitli siRNA transfeksiyon ajanları hücresel toksisite 13,15 katkıda yüksek katyonik yük var. Gerçekten de, bir çok ticari protokolleri reaktifler hücre ölümünü önlemek için, sadece bir kaç saat için hücreler ile inkübe edilmesi gerektiğini göstermektedir. Aksine, ce üzerindehücre canlılığı sonuçlarından açıkça görüldüğü gibi LLS toksisite belirtisi olmaksızın birkaç gün PCPS partiküllerine maruz kalabilir. PCPS tanecikler PEI varlığında, yüksek bir afinite ile siRNA bağlanabilmektedir. Bununla birlikte PEI şarj uyarımlı toksisite dağıtım platformu benzersiz kurulumu ile önlenir. Özellikle PEI Arg kovalent olarak bağlanması ve Si içinde PEI kapsüllenmesi düşük toksisite katkı proses. PCPS platformun diğer bir avantajı, siRNA transfeksiyon serumu varlığında gerçekleşebilir olmasıdır. Diğer mevcut yöntemler, genellikle bu şekilde transfeksiyon işlemine ek adımları eklenmesi ve potansiyel olarak normal hücre sinyal yollarının müdahale, serumsuz hücre kültür ortamının kullanılmasını gerektirir.
PCPS sisteminin ilave bir yararı, siRNA moleküllerinin herhangi bir değişiklik gerektirmez olmasıdır. Bazı güncel yöntemler karmaşık konjugasyon adımlarını siRNA stabilize etmek veya c sağlamak için ihtiyaç duyarkenellular içselleştirilmesi 13, PCPS sistemi siRNA yükleme için basit karıştırma dayanır. PEI bağlayıcı ve Si malzeme gözenekler böylece nükleazlara temas azaltarak, siRNA için koruyucu bir ortam sağlar. PCPS parçacıklar kurutuldu madde olarak ya da izopropil alkol içinde uzun zaman süreleri için muhafaza edilebilir. PCPS / siRNA parçacıkları, beyaz bir katı halinde Ayrıca, 4 ° C'de en az üç ay boyunca saklanabilir. Liyofilize PCPS parçacıklar, transfeksiyondan önce, RNaz içermeyen su içinde süspansiyon haline getirilmiş olmalı ve çözelti içinde saklanmamalıdır. Daha önce dolayısıyla genler baskılanmış kalır hedef olan süreyi artırarak, 11 rapor Son olarak, PCPS platformu izinleri, siRNA'nın salıverilmesinin. Bu duruma göre, hücresel içselleştirme sonra Si parçacıkları kademeli olarak Arg-PEI / siRNA nanopartiküllerinin oluşması ile sonuçlanır bozulmasına yol açar. Daha sonra, siRNA yavaşça messe bağlanabilen sitoplazmasmda salınırnger RNA (mRNA), ve böylece biyolojik aktivite sarf. PCPS parçacıklar siRNA taşınması için mevcut yöntemlere kıyasla bazı avantajlar sağlarlar rağmen, teknik bir sınırlama olmayan işlevselleştirilmiş PSI mikroparçacıklar bir başlangıç maddesi olarak gerekli olmasıdır. Parçacıklar fotolitografi ve elektrokimyasal aşındırma 17 kullanılarak sentezlenebilir iken, bu teknikler tüm kurumlarda hazır değildir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polyethylenimine (PEI), branched | Sigma-Aldrich | 408727 | Average molecular weight ~25,000 Da |
| L-Arginine | Sigma-Aldrich | A5006 | Reagent grade, ≥98% |
| Boc-Asp-OH | Sigma-Aldrich | 408-468 | 99% |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763 | 30 wt. % in H2O |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 339741 | 100.00% |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907 | ≥99.7% |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 459844 | ≥99.5% |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) | Sigma-Aldrich | 03449 | ≥99% |
| Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A7030-10G | Blocking agent |
| Ataxia-telangiectasia mutated siRNA | Sigma-Aldrich | Designed in-house | |
| Tris Acetate-EDTA buffer | Sigma-Aldrich | T9650 | For DNA agarose gel electrophoresis |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | Polyethylene glycol sorbitan monolaurate |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250 | For Western blot |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 71496 | For making phosphate buffer |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 71640 | For making phosphate buffer |
| Anti-Mouse IgG | Sigma-Aldrich | A4416 | Secondary antibody (anti-mouse) for Western blot |
| N-Hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 130672 | 98% |
| CELLSTAR 96W Microplate Tissue Culture Treated Clear w/ Lid | Greiner Bio-One | 655182 | 96-well plate |
| 10x Tris-Glycine Liquid | Li-Cor | 928-40010 | Transfer buffer for Western blot |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | Santa Cruz | Sc-281692 | Fixation of cells |
| CellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (MTS) | Promega | G5421 | Proliferation assay |
| Phosphate buffered saline | Fisher Scientific | BP399-500 | 10x Solution |
| Corning cellgro Dulbecco's Modification of Eagle's (Mod.) | Fisher Scientific | MT-15-017-CM | Cell culture media, 1x solution |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | AC21568-2500 | Octyl phenol ethoxylate, permeabilization agent |
| Cover glass | Fisher Scientific | 12-530C | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-1 | For Western blot transfer buffer |
| Plastic Cuvettes | Fisher Scientific | 14-377-010 | For size measurements using Zetasizer Nano ZS |
| Molecular BioProducts RNase AWAY Surface Decontaminant | Fisher Scientific | 14-754-34 | Spray for removing RNAse contamination |
| Agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | Low melting point, for running RNA samples |
| ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | Antifade reagent with DAPI, nucelus detection |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen | A12379 | Dissolve 300 units in 1.5 ml methanol, detection of filamentous actin |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | Invitrogen | S33102 | Visualization of RNA |
| Negative Control siRNA | Qiagen | 1022076 | Control siRNA |
| AllStars Neg. siRNA AF 555 | Qiagen | 1027294 | Fluorescent control siRNA |
| Cell scraper | Celltreat | 229310 | |
| BioLite Multidishes and Microwell Plates | Thermo Scientific | 130184 | 6-well plate |
| Pierce LDS Sample Loading Buffer (4x) | Thermo Scientific | 84788 | Sample loading buffer for Western blot |
| Pierce BCS Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | Protein quantification assay |
| Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktails (100x) | Thermo Scientific | 78430 | Protease inhibitor cocktail, use at 1x |
| M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent | Thermo Scientific | 78501 | Protein extraction reagent |
| Sorvall Legend Micro 21R | Thermo Scientific | 75002440 | Centrifuge |
| Beta Actin Antibody | Thermo Scientific | MA1-91399 | β-actin primary antibody (from mouse) for western blot |
| 6x TriTrack DNA Loading Dye | Thermo Scientific | R1161 | DNA loading dye |
| Nuclease-Free Water | Life Technologies | AM9938 | |
| Non-Fat Dry Milk | Lab Scientific | M0841 | For Western blot |
| 2-well BD Falcon culture slides | BD Biosciences | 354102 | 2-well culture slides |
| Amersham ECL Western blot detection reagent | GE Healthcare Life Sciences | RPN2106 | Western blot detection reagent |
| BA Membranes | GE Healthcare Life Sciences | 10402096 | Nitrocellulose membrane for Wester blot |
| ATM (D2E2) Rabbit mAb | Cell Signaling | 2873S | ATM primary antibody (from rabbit) for Western blot |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7074 | Secondary antibody (anti-rabbit) for Western blot |
| Folded capillary cells | Malvern | DTS 1061 | For zeta potentail measurements using Zetasizer Nano ZS |
| MDA-MB-231 cell line | ATCC | HTB-26 | Mammary Gland/Breast |
| 12% Mini-PROTEAN TGX Gel | Bio-rad | 456-1043 | For Western blot |
| Biorad PowerPac HC | Bio-rad | 164-5052 | Power supply for electrophoresis |
| 10x Tris/Glycine/SDS Buffer | Bio-rad | 161-0732 | Running buffer for Western blot |
| Wide Mini-Sub Cell GT Cell | Bio-rad | 170-4405 | Electrophoresis equipment for DNA agarose gel |
| Mini-PROTEAN Tetra cell | Bio-rad | 165-8000 | Electrophoresis equipment for Western blot |
| ChemiDoc XRS+ System with Image Lab Software | Bio-rad | 170-8265 | Image acquisition and analysis software for gels and blots |
| 4" (10 cm) dia., 5 x 7 mm diced Silicon Wafer | Ted Pella | 16007 | Silicon waferfor scanning electron microscopy and atomic force microscopy |
| Thermomixer R | Eppendorf | 22670107 | Shaker |
| Isoton II diluent | Beckman Coulter | 8546719 | Isoton diluent |
| Multisizer 4 Coulter Counter | Beckman Coulter | A63076 | Particle counting analyzer |
| Non-functionalized porous silicon particles | Microelectronics Research Center, University of Texas at Austin | Dicoidal shape. 2.6 μm (diameter) x 0.7 μm (height), provided in isopropyl alcohol | |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | Particle analyzer system for size and zeta potential | |
| Scanning Electron Microscope | FEI | Particle size and shape | |
| Atomic Force Microscope | Bruker | Particle size and shape | |
| Fluo ViewTM 1000 Confocal Microscope | Olympus | Visualization of fixed and live cells |
References
- De Fougerolles, A., Vornlocher, H. P., Maraganore, J., Lieberman, J. Interfering with disease: a progress report on siRNA-based therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 6 (6), 443-453 (2007).
- Rolland, A.
- Oh, Y. K., Park, T. G. siRNA delivery systems for cancer treatment. Adv Drug Deliv Rev. 61 (10), 850-862 (2009).
- Mintzer, M. A., Simanek, E. E. Nonviral vectors for gene delivery. Chem Rev. 109 (2), 259-302 (2009).
- Whitehead, K. A., Langer, R., Anderson, D. G. Knocking down barriers: advances in siRNA delivery. Nat Rev Drug Discov. 8 (2), 129-138 (2009).
- Decuzzi, P., et al. Size and shape effects in the biodistribution of intravascularly injected particles. J Control Release. 141 (3), 320-327 (2010).
- Decuzzi, P., Ferrari, M. Design maps for nanoparticles targeting the diseased microvasculature. Biomaterials. 29 (3), 377-384 (2008).
- Martinez, J. O., Evangelopoulos, M., Chiappini, C., Liu, X., Ferrari, M., Tasciotti, E. Degradation and biocompatibility of multistage nanovectors in physiological systems. J Biomed Mater Res A. 102 (10), 3540-3549 (2014).
- Shen, H., et al. Enhancing chemotherapy response with sustained EphA2 silencing using multistage vector delivery. Clin Cancer Res. 19 (7), 1806-1815 (2013).
- Xu, R., et al. Multistage vectored siRNA targeting ataxia-telangiectasia mutated for breast cancer therapy. Small. 9 (9-10), 1799-1808 Forthcoming.
- Shen, J., et al. High capacity nanoporous silicon carrier for systemic delivery of gene silencing therapeutics. ACS Nano. 7 (11), 9867-9880 (2013).
- Zhang, M., et al. Polycation-functionalized nanoporous silicon particles for gene silencing on breast cancer cells. Biomaterials. 35 (1), 423-431 (2014).
- Ozpolat, B., Sood, A. K., Lopez-Berestein, G. Nanomedicine based approaches for the delivery of siRNA in cancer. J Intern Med. 267 (1), 44-53 (2010).
- Philipp, A., Dehshahri, A., Wagner, A., E, Simple modifications of branched PEI lead to highly efficient siRNA carriers with low toxicity. Bioconjug Chem. 19 (7), 1448-1455 (2008).
- Hunter, A. C. Molecular hurdles in polyfectin design and mechanistic background to polycation induced cytotoxicity. Adv Drug Deliv Rev. 58 (14), 1523-1531 (2006).
- Andrews, P. M., Bates, S. B. Dose-dependent movement of cationic molecules across the glomerular wall. Anat Rec. 212 (3), 223-231 (1985).
- Ananta, J. S., et al. Geometrical confinement of gadolinium-based contrast agents in nanoporous particles enhances T1 contrast. Nat Nanotechnol. 5 (11), 815-821 (2010).
