Introduction
Levende celler bank metabolisk energi i form af fedt og kulhydrater og anvende denne energi til biosyntese, transport membran og bevægelse. Noget energi opnås i cytosolen ved konvertering af kosten sukker direkte i ATP under glykolyse. Men den vigtigste kilde til ATP-produktion i en celle udnyttes i mitokondrierne via mitokondrie respiratoriske kæde 1. Arkitekturen af mitokondrier giver den nødvendige rumlige orientering for effektiv og ATP-produktion. Mitokondrier har en dobbelt membran adskilt af et intermembrane rum og sammen med matrixen, den inderste mitokondrie rum, hus komponenterne og koordinere de kemiske reaktioner der er involveret i ATP generation. Den indre membran indeholder en række membranbundne proteinkomplekser, der omfatter den respiratoriske kæde samt ATP syntase, proteinkomplekset, der bringer ADP og Pi sammen for dannelse af ATP. KroenER-membranen er foldet ind cristae og elektroner ledes langs de respiratoriske kæde-komplekser via cytochrom c, et opløseligt elektron bærer, som bevæger sig mellem komplekser i intermembrane rum. Som elektroner bevæger oxidation af reducerende ækvivalenter forekommer og hydrogenioner pumpes fra matrixen til intermembrane rum. Som følge af den høje ionkoncentration i intermembrane rum, en elektrokemisk gradient bygger resulterer i en membran potentiale over den indre mitokondrielle membran (Δψ) 2. Oxygen er den endelige elektronacceptor af elektron transportkæden og hydrogenioner flyde gennem ATP syntaser fra intermembrane rum tilbage til matrixen, og dermed direkte forårsage ATP formation. Denne fremgangsmåde, som beskrevet i sin helhed er kendt som oxidativ phosphorylering. Folderne i cristae forøge overfladearealet af den indre membran, der giver mulighed for maksimal elektrontransport og ATP-produktion ihvert mitokondrie. De proteiner, enzymer og andre molekyler, der er involveret i den oxidative phosphorylering er afledt fra både nukleare og mitokondrie-gener. Mitokondrier indeholder deres egen cirkulært DNA, der koder for 13 proteiner samt tRNA'er og mRNA'er er nødvendige for ATP-produktion 3. Men mange flere proteiner kræves, og derfor er det nukleare kodet. De fleste af disse nukleare kodede proteiner er målrettet til det mitokondrielle matrix ved anvendelse af præsekvenser ved N-terminalen af precursorproteinet og deres import drives delvist af Δψ 4,5.
Ud over at bidrage til bioenergetik af en celle, mitokondrier indflydelse også store metaboliske processer, såsom TCA og beta-oxidation, cellulær signalering gennem regulering calcium, samt en central rolle i apoptose 6. Specifikt i perioder af cellulær stress, BCL-2-familien proteiner, der er placeret på eller interagere på den mitokondriske ydre membran kan forårsage mitochondrialydre membranpermeabilitet (MOMP) 7,8. Under MOMP er cytochrom c og andre proteiner frigives i cytosolen, og sammen med flere cytosoliske proteiner danner et kompleks kaldet apoptosome 9,10. Den apoptosome aktiverer caspaser, der går på at spalte cellulære proteiner og DNA under udførelsesfasen af apoptose. Så snart MOMP sker, er ΔΨ kollapsede og ATP produktion standset. Således som apoptose initieres mitokondriefunktion er kompromitteret og ændringer i ΔΨ kan korreleres til mitokondrie og celle sundhed 12. Mens apoptose er et endepunkt i mange sygdomsmodeller, mitokondriefunktion og ændringer ΔΨ kan også give værdifuld information om sygdommen access og / eller progression. For eksempel har mitokondriske strukturelle og funktionelle ændringer er dokumenteret i løbet af neurodegenerative sygdomme 13,14.
I den første del af protokollen, isoning af intakte mitochondrier, der bevarer deres ΔΨ beskrives. HEK-293T-celler blev udsat for forskellige koncentrationer og kombinationer af rekombinant TNF-α, IL1-β og IFN-γ til at inducere apoptose. Disse cytokiner er valgt, fordi de ofte er rapporteret at være høj i primære septisk prøver human 15 og extrinsicsti apoptose kan udløses ved interaktion af TNF-α-binding til dets receptor 6. Da der er subtile variationer er nødvendige for at isolere funktionel mitokondrier fra primære væv sammenlignet med dyrkede celler, og fordi megen forskning udnytter dyr, protokollen beskriver også, hvordan at isolere mitokondrier fra leveren og rygmarv af anterior lateral sklerose (ALS) musemodel.
Den anden del af protokollen blev udviklet til at overvåge perturbationer til mitokondriemembranpotentiale anvendelse af en potentiel fluorescensfarvestof med en fluorescerende pladelæser. Forskels mellem cellulær status (dvs. sunde vs. usund) er differentierede ved kvantificering af styrken af ΔΨ af isolerede mitokondrier i forbindelse med frakobling midler, respiratoriske kæde inhibitorer, komplekse inhibitorer og ionoforer, som alle forårsager spredning af det mitokondrielle membranpotentiale. Den sundere mitokondrier, den større ændring i ΔΨ ved behandling med mitochondriale inhibitorer, derfor reaktion mitokondrier kan anvendes som en indikator for mitochondrial (dys) funktion.
Anvendelse af isolerede mitokondrier snarere end in situ vurdering af funktion giver endelige bevis for, at en patologi eller behandling modulerer ændringer organel 16-18 direkte. Mens der er metoder i litteraturen til at isolere mitokondrier fra dyrkede celler, er de vage 17 og / eller udnytte specialudstyr 16. Denne protokol beskriver detaljeret isolation fremgangsmåde og erlet tilpasses til andre cellelinier, herunder primært væv og kulturer 13,14,19,20. Mange isolerede mitokondrier undersøgelser udnytte de samme mitokondrie uncouplers og inhibitorer, der anvendes i denne protokol, men med en Clark-elektrode (21 er et repræsentativt eksempel på mange papirer i litteraturen), som igen er en meget specifik og specialiseret udstyr. Desuden er denne traditionelle metode har begrænsninger, såsom lav produktivitet og høj kompleksitet 22,23 og kræver en betydelig mængde af mitokondrier (~ 500 pg / reaktion). I denne protokol, er den fluorescerende membran-sensing potentiel sonde TMRE anvendes i forbindelse med en fluorescerende plade læser, som er en standard maskine i mange laboratorier. TMRE er bredt anerkendt, da den træder hurtigt celler og isolerede mitokondrier og kan bruges ved lave koncentrationer 24. Flere reaktioner kan hurtigt sættes op i tandem og batch analyseres ved hjælp af denne protokol. Endvidere reaktionens kræver en meget lille mængde af isolerede mitokondrier (~ 10 pg / reaktion). Ved at kræve mindre materiale, kan mindre væv eller cellekultur prøver anvendes som et udgangspunkt for mitokondrier isolation, kan flere replikater eller reaktioner oprettes, og potentielt nok materiale til andre isolerede mitokondrier eksperimenter som ATP produktion, iltforbrug, eller import assays er mulige.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg var i overensstemmelse med National Institutes of Health retningslinjer og blev godkendt af Wake Forest University Animal Care og brug Udvalg. Ynglepar for SOD1G93A [B6SJL-TGN (SOD1-G93A) 1Gur] musemodel blev opnået fra The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Ikke-transgene vildtype (WT) hunner og SOD1G93A hanner [B6SJL-TGN (SOD1-G93A) 1Gur] blev avlet til at generere SOD1G93A mus og ikke-transgene WT kuld der blev brugt i forsøgene.
1. Modeller for Investigation
- Cellekultur
- Oprethold humane embryonale nyreceller (HEK-T293) celler i DMEM suppleret med 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum, 1% penicillin-streptomycin og 1% L-glutamin, ved 37 ° C i 5% CO 2.
- Grow celler i T75 kolber og give dem mulighed for at nå 90% konfluens.
- Foretag Celleopdelings via trypsinisering (0,25% trypsin-EDTA) i 3-5 minutter ved 37 ° C i 5% CO 2
- Aspireres medierne og resuspender cellepelleten i dyrkningsmediet.
- Seed celler i passende kolbe eller plade 7 x 10 4 celler i en T75-kolbe 48 timer før cytokinbehandling. Dette skulle give ~ 70% densitet på tidspunktet for behandling.
- Serum sulte celler 24 timer senere ved at aspirere medierne og erstatte det med det samme volumen af serum-frie medier (DMEM, steril).
- Forbered TNF-α, IL1-β, og IFN-γ, fra frysetørret pulver med ultrarent vand ved koncentrationer heraf 5 pg / pl, 10 ng / pl, og 10 ng / pl henholdsvis og tilføje dem til brøndene / kolber.
- Treat serum udsultede celler ved tilsætning af solubiliseret cytokiner direkte til celledyrkningsmediet passende kolber. Behandlingen bestod af individuelle cytokiner, en cocktail af alle 3 (benævnt "* 3"), eller sterile vand som kontrol (benævnt "0").
- Inkuber behandlede celler i 24, 48 eller 72 timer før vurdering og høst.
- Cellelevedygtighed vurdering
- Lav en opløsning af 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) 5 mg / ml -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) i 1x PBS.
- For plader med 12 brønde tilsættes 100 pi MTT-opløsning til hver brønd og omrystes forsigtigt for at sikre jævn fordeling.
- Pladerne inkuberes i 15 minutter-1 time ved 37 ° C i 5% CO 2, og kontrollere under et mikroskop for tilstedeværelsen af lilla farve. Hvis der ikke lilla er til stede, hvirvle igen og tillade cellerne at inkubere i 5 minutters intervaller, indtil lilla overholdes. Mængden af tid, det bør bestemmes af hver investigator.
- Ved hjælp af en gentagelse Fyld 700 pi MTT opløsningsmiddel (4 mM HCI og 0,1% NP40 i isopropanol) til hver brønd og rock plade (r) ved stuetemperatur i 5-10 min, eller indtil al lilla farve havde forladt cellerne . Hvis lillafarve kommer ikke ud af cellerne, tilsættes yderligere 200 ul opløsningsmiddel og fortsætte med at hvirvle.
- Til analyse, tage 100 ul fra hver brønd og anbringes i en plade med 96 brønde og læse på en tallerken læser ved hjælp 570 nm og en reference bølgelængde på 630 nm, dog 595 nm er også acceptabel, så længe der aflæses på konsistente indstillinger.
- Dyremodel for ALS
- Alle dyreforsøg var i overensstemmelse med National Institutes of Health retningslinjer og blev godkendt af Wake Forest University Animal Care og brug Udvalg. Ynglepar for SOD1G93A [B6SJL-TGN (SOD1-G93A) 1Gur] musemodel blev opnået fra The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Ikke-transgene vildtype (WT) hunner og SOD1G93A hanner [B6SJL-TGN (SOD1-G93A) 1Gur] blev avlet til at generere SOD1G93A mus og ikke-transgene WT kuld der blev brugt i forsøgene.
- Udfør genotypning med standard primere mod mutant SOD1 25.
2. Isolering af mitokondrier
BEMÆRK: Det er vigtigt at arbejde hurtigt og holde alt på is under hele proceduren.
- Fremstilling af mitokondrie isolation buffer (MIB), rygmarv isolation buffer (SC MIB) og eksperimentel buffer (EB)
- Forbered følgende stamopløsninger før tid for MIB og EB.
- Lav 1 M Tris / MOPS ved at opløse 12,1 g Tris-base i 70 ml H 2 O. Tilføj tørre MOPS at få pH-værdien til 7,4. Juster volumen til 100 ml endelig. Filtersteriliser og opbevares ved 4 ° C.
- Lav 1 M Kphos ved at blande 80,2 ml af K 2 HPO 4 og 19,8 ml KH 2 PO 4. Opbevares ved stuetemperatur.
- Lav 0,2 M EGTA / Tris ved tilsætning af 3,8 g EGTA til 10 ml H 2 O. Tilsæt 1 M Tris / MOPS indtil opløsning, ~ 30-40 ml. Juster til 50 ml, sterilt filter og opbevares ved stuetemperatur. Bemærk, at pH-værdien vil være ~ 6.7.
- Lav 1 M Glutamat ved at 10 ml1 M opløsning af glutaminsyre. Filtersteriliser og lageret 4 ° C.
- Lav 1 M Malate ved at 10 ml af 1 M opløsning af æblesyre. Tilføj Tris / MOPS til 50 mM. Filtersteriliser og opbevares ved 4 ° C.
- Lav MIB i en koncentration på 200 mM sucrose, 10 mM Tris / MOPS, pH 7,4, og 1 mM EGTA / Tris. Filtersteriliser og opbevares ved 4 ° C.
- Gør SC MIB i en koncentration på 250 mM sucrose, 20 mM HEPES-KOH pH 7,5, 10 mM KCI, 1,5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM DTT og protease inhibitor cocktail.
- Lav EB ved en koncentration på 125 mM KCI, 10 mM Tris / MOPS, pH 7,4, 5 mM glutamat, 2,5 mM malat, 1 mM K-phosphat, pH 7,4, og 10 mM EGTA / Tris. Filtersteriliser og opbevares ved 4 ° C.
- Forberedelse Udstyr før høst af cellerne.
- Skyl en lille glasbeholder og homogenisering støder tre gange med sterilt vand og placere på is.
- Saml nødvendige elementer, såsom en standard boremaskine, celle scrapers, 1,5 ml, 15 ml og 50 ml rør og løsninger.
- Mitokondrier Isolation
- Dyrkede celler
- For hver prøvetype, bruge to T175 kolber af celler.
- Sikre, at cellerne er ~ 90% konfluente og anvendelse i kontrolforsøg, eller plade og behandle som beskrevet ovenfor i trin 1.2.
- På bænken toppen, Aspirer medier og vask omliggende celler to gange med 15 ml 1x PBS hver gang.
- Aspirer bufferen og skrab kolber for at fjerne adhærerende celler fra bunden af kolben.
- Der tilsættes 15 ml 1x PBS til hver kolbe, hvirvel, og overføre til individuelle 15 ml koniske rør og sted på is.
- Når skrabning er færdig, centrifugeres rørene i 5 minutter ved 700 xg, 4 ° C under anvendelse af en bordcentrifuge ved hjælp af en svingende spand rotor.
- Aspirer supernatanter og resuspenderes hver pellet i 1 ml MIB.
- Kombiner begge suspensioner og overføre til en lille glasbeholder for homogenisering.
- Tilføj MIBtil beholderen, indtil bufferen når den første linje. Homogeniseres celler med de støder knyttet til en boremaskine ved middel hastighed i tre omgange. Sørg for, at fartøjet er på is under dette trin, ikke at fjerne støder over væsken og bruge en konstant hastighed med kontinuerlige passerer.
- Overfør den homogeniserede opløsning til et 50 ml konisk rør.
- Tegn opløsningen i en 3 ml sprøjte ved anvendelse af en 18 gauge 1 ½ inch nål og uddrive den tilbage i konisk rør på is med en 27 gauge ½ inch nål. Pas at uddrive opløsningen mod den indvendige væg af røret for at udnytte denne kraft for cellemembranen forstyrrelser.
- Gentag sprøjte trin i alt fem gange.
- Opløsningen overføres til en 15 ml konisk rør og centrifugeres i 5 minutter ved 600 xg, 4 ° C i en bordcentrifuge ved hjælp af en svingende spand rotor.
- Fjern forsigtigt supernatanten og distribuere blandt tre 1,5 ml rør.
BEMÆRK: Mitochondria er i supernatanten efter denne første, lav hastighed centrifugering, mens cellemembraner og ubrudte celler pelleteres. - Centrifugerør i en rotor med fast vinkel ved 10.000 xg, 4 ° C i 5 minutter.
- Aspirer supernatanter og kombinere pellets i 100 pi MIB og straks placere på is.
BEMÆRK: Mitokondrier er i pillen efter denne high-speed spin. Mitokondrier vil typisk opretholde deres potentielle membran til ~ 2-3 ion is efter isolering og er mest stabile som en koncentreret stamopløsning i MIB.
- Mitokondrier isoleret fra muse væv
- Bedøver musen ifølge IACUC protokol. Indstil en fordamper på 5,0% for at inducere anæstesi. Bekræftet, at dyret er bedøvet af manglende refleks for mund knivspids eller blinker refleks, når øjet er kontaktet eller bankes med en vatpind. Hold musen under anæstesi for hele kirurgiske procedure ved at holde vaporizer mellem 1,5% og 2,0%.
- Excise leveren og rygmarven fra hvert dyr og sted separat i iskold 1x PBS - / - for at skylle noget blod væk.
- For leveren, overføre vævet til en vejer skål på is og snittes i fine stykker ved hjælp af en frisk barberblad i 1 min.
- Tilføj væv og passende buffer (MIB for lever- eller SC MIB for rygmarv) til beholderen, indtil bufferen når den første linje. Blandes væv pistil med hånden i fem gennemløb. Sørg for, at fartøjet er på is under dette trin, ikke at fjerne støder over væsken og bruge en konstant hastighed med kontinuerlige passerer.
- Overfør homogenater at rense 15 ml rør.
- Centrifugerør i en rotor med fast vinkel ved 750 xg, 4 ° C i 10 min.
- Gem supernatanterne i rene rør og placere dem på is.
BEMÆRK: Mitokondrier er i supernatanten efter denne første, lav hastighed centrifugering, mens cellemembraner og ubrudte celler pelleteres. - Re-suspendere rygmarv pellets in 500 pi SC MIB.
- Re-homogenisere hver tre gange, kun fylde beholderen halvvejs med SC MIB dette tidspunkt.
- Overfør den nye homogenat til et frisk rør.
- Centrifuger i en fast vinkel rotor ved 750 xg, 4 ° C i 10 min.
- Kombiner disse nye supernatanter, der indeholder flere mitokondrier, med den første supernatant fra hver prøve.
- Centrifugerør i en rotor med fast vinkel ved 10.000 xg, 4 ° C i 5 minutter.
- Aspirer supernatanter og opblande leveren pellets i 500 pi MIB og rygmarv pellets i 50 pl SC MIB og straks placere på is.
BEMÆRK: Mitokondrier er i pillen efter denne high-speed spin. Mitokondrier vil typisk opretholde deres potentielle membran til ~ 2-3 ion is efter isolering og er mest stabile som en koncentreret stamopløsning i MIB. - Udfør en proteinkoncentration assay til at estimere koncentrationen af mitokondrier i opløsning. Følg instruktions for anvendelse af et kommercielt Protein Assay Kit eller lignende metode 26. Typiske koncentrationer af mitokondrier er: 2 T175 kolber udbytter ~ 2 mg / ml, 1 muselever ~ 3-5 mg / ml, og 1 mus rygmarv ~ 1-3 mg / ml.
- Dyrkede celler
- Cytochrom C under anvendelse af en F & U Rotte / Mus cytochrom c Quantikine ELISA Kit (tilpasset fra den protokol, som fabrikanten).
- Umiddelbart før opsætning reaktionerne, fortyndes mitokondrier til 0,5 mg / ml arbejder koncentration med EB og distribuere udvandet mitokondrier i 1,5 ml rør til reaktioner (typisk 30-50 pi mitokondrier pr rør).
- Tilføj enten EB eller DMSO, til 1% af den samlede volumen, til de fortyndede mitokondrier og inkuberes reaktionerne på bænken toppen for 7-10 min. Disse reaktioner er stabile i op til 30 minutter ved stuetemperatur, hvis en længere tidsramme er nødvendig.
- Pellet mitochondrier ved centrifugering i en rotor med fast vinkel ved 10.000 xg, 4 ° C i 5 minutter og forsigtigtly adskille supernatanten og placere hver i et separat 1,5 ml rør.
BEMÆRK: Rør kan enten frosset ved -20 ° C til analyse senere, eller anvendes straks. - Bestem frigivelse af cytochrom c ved en sammenligning af koncentrationen af cytochrom c i pillen og supernatanten 27.
- Forberede prøverne ved solubilisering af pellets i det oprindelige volumen af reaktionen med 0,5% TX-100 i 1 x PBS.
- For hver prøve forberede 2 brønde på ELISA-pladen, en for nu solubiliserede pellet og én for supernatanten fra reaktionsblandingen ved tilsætning af 100 pi af cytochrom c-konjugat (bruge lige ud af flasken) plus 100 pi 0,5% TX- 100 i 1X PBS, og derefter alle pelleten eller supernatant prøve.
- Forsigtigt vortexes pladen en lav indstilling (niveau 2-4) i 20 sekunder for at blande, dække og inkuberes i 1 time, 37 ° C.
- Dernæst vaskes pladen fire gange med vaskebuffer fortyndes i henhold til fremstillingsER instruktioner. Fjern eventuel overskydende opløsning ved at trykke på brøndene på køkkenrulle.
- Dernæst tilsættes 150 pi af 1: 1 A + B udvikle opløsning til hver brønd og inkuberes pladen i 20-30 minutter i mørke ved stuetemperatur.
- Endelig tilsættes 50 ul stopopløsning til hver brønd og tage absorbanslæsninger ved 540 nm ved hjælp af en mikropladelæser. Mængden af cytochrom c-frigivelse ved sammenligning af mængden af cytochrom c i pelleten vs. supernatanten for hver reaktion.
3. Vurdering af mitokondrie (Dys) funktion
- Umiddelbart før reaktioner er sat op, fortyndes mitokondrier til 0,5 mg / ml arbejder koncentration med EB og anbragt i 1,5 ml rør til reaktioner (typisk 30-50 pi mitokondrier anvendes pr rør).
- Mitokondrielle behandlinger
- Tilføj egnede behandlinger (EB kontrol, 1 uM FCCP blandet med 50 nM Valinomycin, 10 uM rotenon5 uM oligomycin, 2 mM KCN eller 200 pM ADP, slutkoncentrationer) til separate reaktioner på 1/10 det samlede volumen af fortyndet mitokondrier. Inkuber reaktionerne på bænken toppen for 7 min.
BEMÆRK: Der skal udvises forsigtighed ved håndtering af disse stoffer som utilsigtet indtagelse eller optagelse gennem huden kan være skadeligt. - Fortynd TMRE, rekonstitueret i sterilt vand ved en arbejdskoncentration på 100 um og opbevares ved -20 ° C til 2 um og tilføje en mængde svarende til det mitokondrielle reaktionsvolumen.
- Inkuber reaktionerne på bænken toppen for 7 min.
- Pellet mitochondrier ved centrifugering i en rotor med fast vinkel ved 10.000 xg, 4 ° C i 5 minutter.
- Load halvdelen af supernatanten volumen af hver prøve på en 396-brønds plade og læse fluorescens.
BEMÆRK: excitations- og emissions- bølgelængder TMRE bør optimeres i henhold til fabrikantens instruktioner ved anvendelse af volumen og plade, der skal bruges tilassayet. Ved hjælp af en standard 384-brønds sort plade med 25 pi 1 uM TMRE (endelig reaktion koncentration) det stærkeste signal blev opnået under anvendelse af excitation / emissionsbølgelængder 485 nm / 535 nm. - Beregn fold-forskellen i fluorescens mellem kontrol (EB), og hver behandling ved at dividere den relative fluorescens værdi (RFU) opnået fra pladelæser for den eksperimentelle prøve af RFU fra kontrolprøven.
- Tilføj egnede behandlinger (EB kontrol, 1 uM FCCP blandet med 50 nM Valinomycin, 10 uM rotenon5 uM oligomycin, 2 mM KCN eller 200 pM ADP, slutkoncentrationer) til separate reaktioner på 1/10 det samlede volumen af fortyndet mitokondrier. Inkuber reaktionerne på bænken toppen for 7 min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Behandling af HEK-293T-celler med 200 pg / ml TNF-α, 40 ng / ml IL1-β, og 75 ng / ml IFN-γ (* 3) for 24-48 timer fører til progressive mængder celledød (figur 1A ). Cellelevedygtighed blev vurderet ved anvendelse af MTT-assays og konsekvent viser, at der er ~ 10% fald i cellelevedygtighed med 24 timers behandling og ~ 20% fald med 48 timers behandling. Celler behandlet med lignende koncentrationer (100 pg / ml TNF-α, 40 ng / ml IL1-β, og 75 ng / ml IFN-γ) give lignende celledød resultater på 48 timer, og behandling med individuelle cytokiner viser, at faldet i levedygtighed skyldes kombinatorisk påvirker (figur 1B). De levedygtighed data i figur 1B repræsenterer middelværdien +/- standardafvigelse for 3 separate forsøg hver køre i tre eksemplarer og tætheden af fejlsøjlerne demonstrere reproducerbarheden af dataene. Mængden af cytokiner kan justeres i denne behandlingsprotokol yderligere elucidate bidraget fra hver cytokin på celledød, og yderligere cytokiner eller andre faktorer kan også være omfattet, så længe passende kontroller udføres.
Isolering af mitokondrier fra celler og væv er blevet beskrevet i litteraturen siden 1940'erne 28,29. Udgangspunktet for fremgangsmåden er cellesprængning efterfulgt af differentiel centrifugering, hvor rå mitokondrier er kendt for at pelletere på ~ 10.000 x g. Mange protokoller, der anvender isolerede mitokondrier kræver intakte dobbelte membraner, som kan modstå deres membranpotentiale, og derfor er det nødvendigt at vurdere integriteten når isolation er færdig. Under udviklingen af mitokondrierne isolation protokollen fra dyrkede HEK-celler blev en cytochrom c-assay anvendes til at indikere, hvis der blev opnået intakte mitochondrier. Anvendelse af kommercielt tilgængelige cytochrom c ELISA kits blev mitokondrier kvantificeret efter isolering og fortyndet i EB, og derefter enten EB eller DMSOtilsat, og reaktionerne inkuberes på bænken toppen. Derefter, ved at adskille mitokondrier fra omgivende supernatant analyse af cytochrom c indholdet af begge fraktioner blev anvendt som et mål for mitokondriemembran intakthed; hvis flertallet af cytochrom c tilbageholdes i mitokondrie pellet derefter mitokondrierne være intakte, mens hvis der er mere end 15% af cytochrom c er fundet i supernatanten, derefter mitokondrier blev fundet uegnede til funktionelle undersøgelser. Som det ses i tabel 1, protokollen beskrevet udbytter ~ 12% cytochrom c-frigivelse og ~ 15% når isoleret mitokondrier er forbehandlet med DMSO. Lignende resultater er blevet rapporteret tidligere for mitokondrier isoleret fra andre cellelinier eller dyrevæv 19,20,27. Alternativt kan mitochondrial integritet også vurderes med TMRE, som blev anvendt under isolering af muselever og rygmarv mitokondrier. Under oprindelige isolering protokol development, forsøg evalueres mitokondrier isoleret fra leveren og rygmarv af sunde, normale mus mitokondrier. For hver prøve blev ΔΨ evalueres ved at sammenligne det fluorescerende signal fra isolerede mitokondrier behandlet med EB dem inkuberet med FCCP + Valinomycin (tabel 2). Et forhold mellem fluorescens mellem behandlede og ubehandlede mitokondrier> 1 blev anvendt som en indikation af raske, intakte mitochondrier.
Når succesfulde mitokondrier isolation protokoller blev udviklet, mitokondrier isoleret fra kontrol, ubehandlede celler og * 3 cytokin behandlede celler, eller hvor de almindelige SOD1 mus blev analyseret. HEK mitokondrier fra begge grupper blev behandlet med forskellige uncouplers og inhibitorer og ΔΨ målt ved ændringer TMRE optagelse. Den fold forskel i kontrol EB behandlede mitokondrier at afkobleren / inhibitor behandlet mitokondrier angiver en forskel i styrken af ΔΨ mellem de to grupper (repræsentative data og calinger i tabel 3). Endvidere procent fald fra ubehandlede celler til * 3 behandlede celler betyder, at mitokondriel sundhed var påvirket af cytokin behandlinger samstemmende cellelevedygtighed data (figur 2). Evaluering af ΔΨ styrke via TMRE optagelse ved hjælp af mitokondrier isoleret fra leveren og rygmarv af fire individuelle normal, kontrol mus i forhold til fire ALS mus indikerer, at væv sundhed også kan vurderes ved hjælp af denne protokol. Som det fremgår af fold forskelle og procentvise fald i ΔΨ, sammenligning af EB-behandling og FCCP + Valinomycin-behandling af mitokondrier fra kontrol og sygdomsfri skred dyr er signifikant forskellige (tabel 4, se også referencer 13 & 14).
Figur 1: Celledød inducered med * 3 behandling er progressiv over tid og større end med individuelle cytokin behandlinger. (A) HEK-293T-celler blev behandlet i 24 eller 48 timer, og celledød blev målt ved hjælp af et MTT-assay. Værdier blev normaliseret til kontrol ubehandlede prøver og data repræsenterer tredobbelte målinger for n = 3, +/- standardafvigelse. (B) HEK-293T-celler blev behandlet med individuelle cytokiner eller en cocktail (* 3) i 48 timer og celledød vurderes via MTT assay. Dataene repræsenterer n = 5 for hver individuel cytokin og n = 6 for * 3, +/- standardafvigelse.
| Pellet (AU) | Supernatant (AU) | % Cytochrom c-frigivelse | |
| 0 | 0,818 | 0,115 | 12,6 ± 2,27 |
| DMSO | 0,793 | 0,142 | 15.3 ±; 2.23 |
Tabel 1:. Tilbageholdelse af cytochrom c i isolerede mitokondrier fra dyrkede celler data repræsenterer gennemsnittet af n = 4, +/- standardafvigelse.
| liver 1 | lever 2 | rygmarv 1 | rygmarv 2 | ||
| RFU | EB | 97.830 | 94.132 | 339.716 | 290.154 |
| F / V | 435.188 | 461.299 | 385.366 | 482.480 | |
| forholdet | 4.45 | 4.9 | 1.13 | 1.66 | |
| EB = eksperimentel buffer og F / V = FCCP + valinomycin. | |||||
Tabel 2:. Måling af ΔΨ fra mitokondrier isoleret fra normale musevæv To separate dyr blev anvendt til at isolere lever- og rygmarv mitokondrier i tandem (fx lever 1 og rygmarv 1 er fra samme dyr).
| EB | oligo | rot | KCN | ADP | F / V | ||
| RFU | 0 | 4844 | 12.507 | 12.734 | 9925 | 10.892 | 4844 |
| * 3 | 6517 | 13.639 | 12.435 | 10.235 | 13.154 | 6517 | |
| Fold forskel | 0 | NA | 2,58 | 2,63 | 2.05 | 2.25 | 2,65 |
| * 3 | NA | 2.09 | 1,91 | 1,57 | 2.02 | 2.18 | |
| % Fald | 0 vs. * 3 | 18.94 | 27.41 | 23.35 | 10.24 | 17,67 | |
| EB = eksperimentel puffer; oligo = oligomycin; rot = rotenon; KCN = kaliumcyanid, og F / V = FCCP + valinomycin. | |||||||
Tabel 3: rådata og beregninger fra celle cULTUR isoleret mitokondrier eksperimenter.
Figur 2: Mitokondrier isoleret fra cytokin-behandlede celler er faldet membranpotentiale. Procent fald i ΔΨ til 0 vs. * 3 for hver behandling sammenlignet med kontrol, som beregnet i tabel 2. Dataene repræsenterer gennemsnit af dobbeltbestemmelser reaktioner for n = 3 (oligomycin, rotenon, og FCCP / Valinomycin) eller n = 2 ( KCN og ADP) +/- standardafvigelse. * = Statistisk signifikante p-værdier baseret på fold forskel beregninger; p = 0,03, 0,01 og 0,05 for oligomycin, rotenon og FCCP / Valinomycin hhv.
| Spinal Cord | Lever | ||
| Fold Forskel | Kontrol | 1,54 ± 0,48 | 3,20 ± 1,56 |
| SOD1 | 1.10 ± 0.30 | 3.12 ± 1.75 | |
| % Fald | 28.1 | 2,48 | |
| p-værdi | 0.03 | 0,41 |
Tabel 4: Mitokondrier isoleret fra rygmarv af SOD1 mus har reduceret membranpotentiale som vurderet ved FCCP + Valinomycin data repræsenterer gennemsnittet af 4 dyr pr gruppe..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Behandling af HEK-293T-celler med rekombinante cytokiner forårsager moderate mængder af celledød i løbet af 48 timer (figur 1). Mængden af celledød induceret af TNF-alfa behandling ligner tidligere rapporterede undersøgelser 30 og celleviabilitet falder efter samtidig administration af flere cytokiner, der er større end summative beløb med enhver cytokin alene er også i overensstemmelse med litteraturen 31,32. Evnen til at tilpasse de beløb og typer af cytokin behandlinger samt sammenligning af cocktails til individuelle cytokiner gør denne cellekultur model attraktivt for at studere de konkrete virkninger af cytokin eksponering på nyreceller. Endvidere er resultaterne meget reproducerbare og let opnås (figur 2). Overvejelser til at holde i tankerne, omfatter sammenløbet af cellerne. For eksempel har celler behandlet med 100% konfluens ikke reagerer så godt til de samme koncentrationer af cytokiner, når de behandles ved 70-80% confluens. Endvidere bør antallet af passager cellerne har gennemgået spores, da celle respons eventuelt kunne blive påvirket at have været i kultur i for lang (mere end 8-12 uger siden optøning). Mens behandling af dyrkede celler med cytokiner nedsat cellelevedygtighed og efterfølgende mitokondrie sundhed, er det på ingen måde en model for sepsis per se. Men brugen af et mere klinisk relevant model, som beskæftiger primære nyre celler isoleret fra mus og / eller behandling med naturligt udskilles cytokiner fra stimulerede THP1 celler 33, er en naturlig forlængelse af dette arbejde. I betragtning af den forskel i forståelsen af nyresvigt under sepsis, sådanne cellekulturmodeller og vurdering af mitokondrier kunne give indledende indsigt i de mekanismer, samt en foreløbig platform til afprøvning af effektiviteten af farmaceutiske forbindelser som forebyggende eller interventionsforanstaltninger behandlinger.
Mitokondrier isoleret fra dyrkede celler eller dyrevævråd evnen til hurtigt at vurdere virkningen af celle behandlinger eller sygdomsprogression på mitokondrie sundhed. Isoleringen og evaluering protokoller er ikke teknisk krævende at udføre og kan let modificeres til anvendelse med andre cellelinjer eller primære væv. MIB og EB anvendes til hver prøvetype er gode udgangspunkter opskrifter, der kan justeres efter behov, hvis en bestemt celle eller vævstype har forskellige krav. For eksempel er sædvanligvis nødvendigt til brug med neuroner tilsætning af fedtsyre fri BSA, som følger med rygmarv protokol 15,34. Den cellesprængningsmetode kan også ændres ved hjælp af flere sprøjter udvisning eller ændrer opgør homogenisering stedet for at anvende en boremaskine eller vice versa. Desuden re-homogenisering af den første centrifugering pellet, som sker i rygmarven mitokondrier procedure, kan det være nødvendigt at opnå en tilfredsstillende mængde af mitokondrier. En god indikator for, at en isolation protokol producerer levedygtige mitochondria er anvendelse af cytochrom c ELISA. Denne analyse er en hurtig og nem alternativ til western blot analyse af cytochrom c-frigivelse, og er også en nyttig vurdering af cytochrom c-frigivelse efter behandling af mitokondrier med peptider eller andre forbindelser 19,27. Alternativt kan TMRE anvendes under protokol udvikling, men det er vigtigt at evaluere mitokondrier isoleret fra en prøve, der vides at være sunde. Endvidere, når isolering mitokondrier fra muse væv, som ikke rutinemæssigt beskrevet i litteraturen, kan leveren mitokondrier tjene som en positiv kontrol samt bruges til at indstille en baseline. For eksempel som i denne protokol, lever fra hvert dyr, både under protokol udvikling samt forsøg blev også skåret ud og brugt til mitokondrier isolation. En anden overvejelse for et præparat er den mængde af mitokondrier opnået ved udgangen af isolation procedure. Hvis koncentrationen af mitokondrier er 1 mg / ml eller mindre endanalyseresultaterne kan vise sig upålidelige (upublicerede observationer VDGM). Enten det udgangsmateriale, MIB opskrift eller forstyrrelse metode bør optimeres, før du flytter til funktionelle assays. Når en vellykket isolering protokol er nået, kan mitokondrierne også anvendes i andre assays, såsom total ATP indhold og ATP generation 13,14.
Den mitokondrier funktion protokol beskrevet her muliggør indirekte måling af mitokondrie optagelse af den potentielle-sensing farvestof TMRE anvendelse af en standard fluorescenspladelæser. Efter mitokondrier er blevet isoleret og passende kemikalier, der tilsættes, er de inkuberet med TMRE og derefter pelleteret. Ved behandling af hele celler eller dyr, og isolering af mitokondrier før ΔΨ vurdering confounding variabler såsom multiresistent transport eller ATP flux undgås. Mængden af fluorescens i supernatanten analyseres derefter med den forståelse, at sundere mitokondriernejo stærkere deres ΔΨ og derfor mere optagelse af TMRE. Som følge heraf bør mængden af fluorescens i supernatanten være mindre i sundere mitokondrier og mere usunde mitokondrier. Ved at inkludere en EB-eneste behandling, fold forskel i fluorescens mellem denne kontrol og afkoblede mitokondrier kan beregnes. En anden vigtig kontrol med hvert sæt af reaktioner køre er TMRE alene. Resultatet fra denne kontrol giver en maksimal mulig fluorescerende læsning. Da TMRE tilsat til reaktionerne er frisk fortyndet, der er iboende variabilitet. For eksempel blev TMRE-only læsninger af ~ 20.000, 25.000 og 30.000 opnås på forskellige tidspunkter under protokol udvikling. Hvis TMRE kun signal er meget større end nogen af de behandlede mitochondrierne prøver og / eller hvis de behandles mitokondrier er ikke signifikant forskellig fra ubehandlede, derefter isolering af koblet mitokondrier var sandsynligvis ikke lykkes. Faldet i ΔΨ som målt ved et forhold opnåetI forbindelse med denne protokol ligner tidligere rapporterede beløb for kontrol, sunde celler 2,35. Sammenligning af ΔΨ ændringer fra mitokondrier isoleret fra kontrol, ubehandlede HEK-293T celler og * 3 cytokin-behandlede celler viste, at den nedsatte cellelevedygtighed observeret i MTT-assays oversætter nedsat mitokondrier funktion. Denne plade læser assay kunne nemt bruges med mitokondrier isoleret fra enhver kilde og bruges til at undersøge sygdomsmodeller som ALS, som påvist her 13,14.
Adskillige undersøgelser har anvendt mitochondria-specifikke fluorescerende farvestoffer til påvisning af MOMP, der var vigtige i tilblivelsen af denne pladelæser assay. Disse undersøgelser, enten Dog bruger hele celler til at screene forbindelser, der blokerer eller inducerer MOMP 35,36, udforske nye ΔΨ sensing farvestoffer 2 eller identificere andre formater såsom flowcytometri på en mikrochip 37. Denne protokol er enestående, fordi det beskriver annonceETALJERET metode til at isolere og anvende mitokondrier til hurtigt at undersøge virkningerne af helcelle-behandling gennem reaktion på kendte ΔΨ-ændrende forbindelser. Denne protokol udnytter en række uncouplers og inhibitorer, og indikerer, at nogen af dem ville være egnet til at vurdere mitokondrie sundhed. Medens denne særlige undersøgelse centre på mitochondriale ændringer som følge af cellulær stress eller progressiv cellulær dysfunktion, protokollen kan også anvendes til at undersøge ændringer i mitokondrie metabolisme gennem anvendelse af specifikke forbindelser og / eller tilsætning af elektron kilder såsom succinat og NADH .
Vigtige overvejelser, når der udfører den isolerede mitokondrier vurdering inkluderer sammenhæng i behandling mængder, holde mitokondrier i MIB og fortynde dem i EB umiddelbart før behandlingerne vil blive oprettet, og ved hjælp af mitokondrier inden for 3 timer af isolation for at sikre deres ΔΨ stadig opretholdes. DenValget af TMRE forhold til andre mitochondria-specifikke fluorescerende farvestoffer, såsom JC-1 var som følge af evnen til at anvende små koncentrationer og enkelhed analysere fluorescens under anvendelse af kun én bølgelængde. Kan tilsvarende udføres Denne metode med fluorescerende mikroskopi 2,38 eller flowcytometri 37, men anvendelse af en pladelæser tager mindre tid og kræver mindre optimering 35. Desuden denne protokol er langt mindre teknisk krævende, hurtigere at udføre, og mere let at reproducere i forhold til at bruge en Clark-elektrode 22 (Del Gaizo Moore, upublicerede observationer). Titrering mængder af hver mitokondrie behandling kan give yderligere indsigt i mitokondriefunktionen og optimering af koncentrationer bør udføres. Det samlede volumen af de mitochondriale reaktioner kan justeres, så de passer mængden af prøve opnået under isolering samt antallet af reaktioner nødvendige behandling. Hvis det er muligt, et fast beløb på 50 μL anvendes; dog så lidt som 20 pi mitokondrier frembringer pålidelige resultater.
Mens ΔΨ korrelerer til iltforbrug, analysen præsenterede ikke direkte måler iltforbrug. Mens fluorescerende ilt sensing sonde såsom MitoExpress er udviklet, formentlig for at undgå nogle af de downfalls at bruge en Clark Elektrode dommen, at prisen per reaktion og kravet om større mængder mitokondrier pr assay forblive begrænsende. Derfor er brugen af TMRE og klassiske ΔΨ uncouplers eller inhibitorer har flere fordele. Igen batch analyse af flere prøver eller flere behandlinger / prøve, reproducerbarhed, lavere udgangsmateriale krav og / eller lavere mængde isolerede mitokondrier kræves per reaktion gør denne protokol attraktiv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| L-glutamic acid | Sigma | G1251 | Can use the potassium salt instead. |
| malic acid | Sigma | M8304 | Can use the potassium salt instead. |
| KH2PO4 | Sigma | P0662 | |
| K2HPO4 | Sigma | P3786 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Trisma base | Sigma | T6066 | |
| MOPS | Sigma | M3183 | |
| CCCP | Sigma | C2920 | Dilute down to 100 μM as a working stock in ethanol and store at -20 °C. |
| Valinomycin | Sigma | V0627 | Make in DMSO and use as a 5 μM working stock. Store at -20 °C. |
| sucrose | Fisher | S5-500 | |
| KCN | Mallinckrodt | 6379 | Make a concentrated stock in ethanol and then dilute with water |
| rotenone | Sigma | R8875 | Highly toxic. Made in ethanol. |
| oligomycin | Sigma | O4876 | Highly toxic. Made in ethanol. |
| ADP | Sigma | A2754 | |
| TMRE | Sigma | 8717-25mg | Dilute 100 μM stock with EB immediatley before use. |
| DMEM | Gibco | 11965-084 | 1x regular (high glucose). |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140-155 | |
| L-glutamine | Fisher | SH3002101 | Store aliquots at -20 °C |
| FBS | Lonza | 14-501F | US origin, premium quality. Heat inactivate and store aliquots at -20 °C. |
| Trypsin-EDTA | Sigma | T4049 | |
| DMSO | SIgma | D2650 | |
| Protien Assay Dye (5x) | Bio-Rad | 500-0006 | Any protein assay can substitute. |
| BSA | Fisher | BP1600-100 | Make 2 mg/ml stock in water for protein assay. |
| MTT powder | Sigma | M2128 | Filter sterlize 5 mg/ml stock made in PBS. Store aliquots at -20 °C; store at 4 °C for up to 1 week. |
| Tergitol solution (NP-40) | Sigma | NP40S | |
| Recombinant Human IL-1B | Gibco | PCH08014 | Once opened store aliquots at -20 °C |
| Recombinant Human TNF-alpha | Gibco | PHC3015L | |
| Recombinant Human IFN-gamma | Gibco | PHC4031 | |
| Dulbeccos PBS (-/-) | Sigma | D8537 | Make sure it is without Mg2+ and Ca2+ ions. |
| Cytochrom c ELISA kit | R&D systems | DTC0 | Human for HEK-293T cells. |
References
- Madeira, V. M. Overview of mitochondrial bioenergetics. Methods In Molecular Biology. 810, 1-6 (2012).
- Sakamuru, S., et al. Application of a homogenous membrane potential assay to assess mitochondrial function. Physiological Genomics. 44, 495-503 (2012).
- Clayton, D. A. Structure and function of the mitochondrial genome. Journal Of Inherited Metabolic Disease. 15, 439-447 (1992).
- Schatz, G. The protein import system of mitochondria. The Journal of Biological Chemistry. 271, 31763-31766 (1996).
- Mayer, A., Neupert, W., Lill, R. Mitochondrial protein import: reversible binding of the presequence at the trans side of the outer membrane drives partial translocation and unfolding. Cell. 80, 127-137 (1995).
- Green, D. R., Kroemer, G. The pathophysiology of mitochondrial cell death. Science. 305, 626-629 (2004).
- Shamas-Din, A., Kale, J., Leber, B., Andrews, D. W. Mechanisms of action of Bcl-2 family proteins. Cold Spring Harbor Perspectives In Biology. 5, a008714 (2013).
- Hardwick, J. M., Youle, R. J. SnapShot: BCL-2 proteins. Cell. 138, 404 (2009).
- Zoratti, M., Szabo, I. The mitochondrial permeability transition. Biochimica et Biophysica Acta. 1241, 139-176 (1995).
- Wu, C. C., Bratton, S. B. Regulation of the intrinsic apoptosis pathway by reactive oxygen species. Antioxidants & Redox Signaling. 19, 546-558 (2013).
- Kuwana, T., et al. BH3 domains of BH3-only proteins differentially regulate Bax-mediated mitochondrial membrane permeabilization both directly and indirectly. Molecular Cell. 17, 525-535 (2005).
- Joshi, D. C., Bakowska, J. C. Determination of mitochondrial membrane potential and reactive oxygen species in live rat cortical neurons. Journal Of Visualized Experiments. , (2011).
- Vinsant, S., et al. Characterization of early pathogenesis in the SOD1(G93A) mouse model of ALS: part I, background and methods. Brain and Behavior. 3, 335-350 (2013).
- Vinsant, S., et al. Characterization of early pathogenesis in the SOD1(G93A) mouse model of ALS: part II, results and discussion. Brain and Behavior. 3, 431-457 (2013).
- Rajapakse, N., Shimizu, K., Payne, M., Busija, D. Isolation and characterization of intact mitochondria from neonatal rat brain. Brain research. Brain Research Protocols. 8, 176-183 (2001).
- Schmitt, S., et al. A semi-automated method for isolating functionally intact mitochondria from cultured cells and tissue biopsies. Analytical Biochemistry. 443, 66-74 (2013).
- Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nature Protocols. 2, 287-295 (2007).
- Debatin, K. M., Poncet, D., Kroemer, G. Chemotherapy: targeting the mitochondrial cell death pathway. Oncogene. 21, 8786-8803 (2002).
- Del Gaizo Moore, V., et al. Chronic lymphocytic leukemia requires BCL2 to sequester prodeath BIM, explaining sensitivity to BCL2 antagonist ABT-737. The Journal of Clinical Investigation. 117, 112-121 (2007).
- Del Gaizo Moore, V., Schlis, K. D., Sallan, S. E., Armstrong, S. A., Letai, A. BCL-2 dependence and ABT-737 sensitivity in acute lymphoblastic leukemia. Blood. 111, 2300-2309 (2008).
- Li, N., et al. Mitochondrial complex I inhibitor rotenone induces apoptosis through enhancing mitochondrial reactive oxygen species production. The Journal of Biological Chemistry. 278, 8516-8525 (2003).
- Hynes, J., et al. Investigation of drug-induced mitochondrial toxicity using fluorescence-based oxygen-sensitive probes. Toxicological Sciences : An Official Journal Of The Society of Toxicology. 92, 186-200 (2006).
- Papkovsky, D. B. Methods in optical oxygen sensing: protocols and critical analyses. Methods in enzymology. 381, 715-735 (2004).
- Galluzzi, L., et al. Methods for the assessment of mitochondrial membrane permeabilization in apoptosis. Apoptosis : An International Journal On Programmed Cell Death. 12, 803-813 (2007).
- Gurney, M. E., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264, 1772-1775 (1994).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150, 76-85 (1985).
- Certo, M., et al. Mitochondria primed by death signals determine cellular addiction to antiapoptotic BCL-2 family members. Cancer Cell. 9, 351-365 (2006).
- Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. Cytochemical studies of mammalian tissues; isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material. The Journal Of Biological Chemistry. 172, 619-635 (1948).
- Hogeboom, G. H., Claude, A., Hotch-Kiss, R. D. The distribution of cytochrome oxidase and succinoxidase in the cytoplasm of the mammalian liver cell. The Journal of Biological Chemistry. 165, 615-629 (1946).
- Marques-Fernandez, F., et al. TNFalpha induces survival through the FLIP-L-dependent activation of the MAPK/ERK pathway. Cell Death & Disease. 4, e493 (2013).
- Chao, C. C., Hu, S., Ehrlich, L., Peterson, P. K. Interleukin-1 and tumor necrosis factor-alpha synergistically mediate neurotoxicity: involvement of nitric oxide and of N-methyl-D-aspartate receptors. Brain, Behavior, And Immunity. 9, 355-365 (1995).
- Downen, M., Amaral, T. D., Hua, L. L., Zhao, M. L., Lee, S. C. Neuronal death in cytokine-activated primary human brain cell culture: role of tumor necrosis factor-alpha. Glia. 28, 114-127 (1999).
- Schildberger, A., Rossmanith, E., Weber, V., Falkenhagen, D. Monitoring of endothelial cell activation in experimental sepsis with a two-step cell culture model. Innate Immunity. 16, 278-287 (2010).
- Brown, M. R., et al. Nitrogen disruption of synaptoneurosomes: an alternative method to isolate brain mitochondria. Journal Of Neuroscience Methods. 137, 299-303 (2004).
- Wong, A., Cortopassi, G. A. High-throughput measurement of mitochondrial membrane potential in a neural cell line using a fluorescence plate reader. Biochemical and Biophysical Research Communications. 298, 750-754 (2002).
- Blattner, J. R., He, L., Lemasters, J. J. Screening assays for the mitochondrial permeability transition using a fluorescence multiwell plate reader. Analytical Biochemistry. 295, 220-226 (2001).
- Kataoka, M., Fukura, Y., Shinohara, Y., Baba, Y. Analysis of mitochondrial membrane potential in the cells by microchip flow cytometry. Electrophoresis. 26, 3025-3031 (2005).
- Del Gaizo Moore, V., Payne, R. M. Transactivator of transcription fusion protein transduction causes membrane inversion. The Journal of Biological Chemistry. 279, 32541-32544 (2004).
